W niniejszej pracy opisujemy stworzenie rekombinazy Tre poprzez ukierunkowaną ewolucję molekularną. Rekombinaza Tre rozpoznaje zdefiniowaną sekwencję docelową w obrębie sekwencji LTR prowirusa HIV-1, co prowadzi do wycięcia i eliminacji prowirusa z zakażonych ludzkich komórek.
Prace rozpoczęliśmy od Cre, rekombinazy o masie 38 kDa, która rozpoznaje 34-bp dwuniciową sekwencję DNA znaną jako loxP. Ponieważ Cre potrafi skutecznie eliminować sekwencje genomiczne, postawiliśmy sobie za cel stworzenie rekombinazy zdolnej do usunięcia sekwencji znajdującej się pomiędzy 5'-LTR a 3'-LTR zintegrowanego prowirusa HIV-1. W pierwszym kroku zidentyfikowaliśmy w obrębie miejsc LTR sekwencje podobne do loxP i przetestowaliśmy ich aktywność rekombinacyjną. Początkowo Cre oraz biblioteki zmutowanej Cre nie wykazały zdolności do rekombinacji wybranych miejsc loxLTR prowirusa HIV-1. Ponieważ rozpoczęcie każdego procesu ukierunkowanej ewolucji molekularnej wymaga przynajmniej śladowej aktywności, oryginalne asymetryczne sekwencje loxLTR podzielono na podzbiory i ponownie przetestowano pod kątem aktywności rekombinacyjnej. Wykazano aktywność rekombinacyjną dla tych podzbiorów, które posłużyły jako etapy pośrednie. Następnie biblioteki rekombinaz wzbogacono poprzez iteracyjne cykle ewolucji. W dalszej kolejności wzbogacone biblioteki poddano tasowaniu i rekombinacji. Połączenie różnych mutacji okazało się synergistyczne, co pozwoliło na stworzenie rekombinaz zdolnych do rekombinacji loxLTR1 i loxLTR2. Stanowiło to dowód na to, że strategia ewolucyjna wykorzystująca etapy pośrednie może być skuteczna. Po łącznie 126 cyklach ewolucji poszczególne rekombinazy poddano analizom funkcjonalnym i strukturalnym. Najaktywniejsza rekombinaza – Tre – wykazywała 19 zmian aminokwasowych w porównaniu z Cre. Rekombinaza Tre była w stanie wyciąć prowirusa HIV-1 z genomu komórek HeLa zainfekowanych HIV-1 (patrz: „HIV-1 Proviral DNA Excision Using an Evolved Recombinase”, Hauber J., Heinrich-Pette-Institute for Experimental Virology and Immunology, Hamburg, Niemcy). Choć ukierunkowana ewolucja molekularna znajduje się wciąż w początkowej fazie rozwoju, pozwoli ona na tworzenie enzymów projektowanych na zamówienie, które posłużą jako narzędzia „chirurgii molekularnej” i medycyny molekularnej.