Różnicowanie in vitro mysich embrionalnych komórek macierzystych (mES) metodą wiszącej kropli

1. Kolbę T75 należy zżelatynizować 0,1% roztworem żelatyny i inkubować na płytce w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37°C, 5%_{CO2 przez} noc dzień wcześniej.
2. Wyjąć komórki mES z inkubacji, odessać pożywkę, przepłukać hodowlę komórek ES PBS, dodać 0,05% roztwór trypsyny, aby pokryć dno naczynia (płytka 2 ml/100 mm).
3. Inkubować w temperaturze 37°C przez około 1 minutę, aż komórki zaczną złuszczać się z płytki.
   
4. Delikatnie rozcierać (pipetować w górę iw dół) trypsynizowane komórki cztery do sześciu razy, aby rozproszyć komórki ES za pomocą zatkanej pipety Pasteura. Przenieść rozproszone komórki ES do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej  wstępnie podgrzane (37°C) podłoże mES.
   
5. Zebrać komórki przez odwirowanie. Odessać supernatant, dodać 10 ml pożywki mES i pipetować w górę iw dół, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową.
   
6. Przenieść zawiesinę komórkową do kolby T75 wstępnie pokrytej 0,1% żelatyną i inkubować w temperaturze 37°C  z 5% CO₂ przez godzinę
   
   *Po godzinie fibroblasty przyczepiają się do płytki, ale komórki macierzyste pozostają w pożywce. Odpipetować pożywkę, aby pobrać komórki macierzyste.
   
   
7. Obracaj komórki z prędkością 1000 obr./min przez 5 minut i odessaj pożywkę mES. Następnie dodać kolejne 10 ml pożywki różnicującej mES i ponownie zawiesić komórki przez powtarzalne pipetowanie, aż pojawi się drobna zawiesina komórek.
8. Policz komórki za pomocą hemocytometru, użyj pożywki różnicującej, aby rozcieńczyć zawiesinę komórek macierzystych do stężenia od 400 do 500 komórek na 20ul (20ul / kroplę)  w sterylnej misce.
9. Podnieś pokrywkę, ostrożnie odwróć ją i umieść na naczyniu zawierającym 10 ml PBS.  Za pomocą pipety wielokanałowej nałóż rzędy kropli o wartości 20 ul na odwróconą do góry wewnętrznej powierzchni pokrywki naczynia do hodowli tkankowej.
10. Ostrożnie umieść naczynie w inkubatorze na 2 dni. Po dwóch dniach ostrożnie odwróć pokrywę płytki, odessaj 180 ul świeżej pożywki różnicującej i wlej kilka kropli do studzienki 96-dołkowej płytki mocującej ultranisko. Następnie nabierz kroplę za pomocą pipety i przenieś krople, jedna po drugiej, na płytkę 96-dołkową. Umieść płytki w inkubatorze bez przeszkód przez 3 dni.
    
11. Pokryj każdą studzienkę 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej 300ul 0,1% żelatyny. Po dodaniu żelatyny inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37°C dzień wcześniej przed przeniesieniem Ebs.
    
12. Następnego dnia odessać żelatynę z płytki 48-dołkowej. Następnie dodaj 300 ul pożywki różnicującej do każdej studzienki. Przenieś EB z 96 dołków na 48 dołków pokrytych żelatyną, jedna po drugiej. Zmień pożywkę następnego dnia, a następnie zmieniaj pożywkę co drugi dzień, aby utrzymać komórki.
    
13. Spontaniczne skurcze kardiaomyocytów powinny być widoczne w ciągu 7 dni.

The disadvantages of hanging drop method are as follows: the liquid volume of a drop is limited to less than 50ul due to maintaining hanging drops on the lid by surface tension, and it’s impossible to change the medium for hanging drops. Observation of forming EBs in drops directly with microscopy is also very difficult during cultivation. Further more , the hanging drop method consists of two steps, therefore, a series of step of the hanging drop method may be troublesome.