Różnicowanie in vitro mysich embrionalnych komórek macierzystych (mES) metodą wiszącej kropli

Podsumowanie

Ten film pokazuje, jak przeprowadzić in vitro różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych myszy do ciał embrionalnych za pomocą metody wiszącej kropli.

Streszczenie

Komórki macierzyste mają niezwykły potencjał do przekształcania się w wiele różnych typów komórek. Kiedy komórka macierzysta dzieli się, każda nowa komórka ma potencjał, aby albo pozostać komórką macierzystą, albo stać się innym typem komórki o bardziej wyspecjalizowanej funkcji, Ta obiecująca nauka skłania naukowców do zbadania możliwości terapii komórkowych w leczeniu chorób. Podczas hodowli w zawiesinie bez czynników antyróżnicujących embrionalne komórki macierzyste spontanicznie różnicują się i tworzą trójwymiarowe agregaty wielokomórkowe. Te agregaty komórkowe nazywane są ciałami embrionalnymi (EB). Wisząca kultura kroplowa jest szeroko stosowaną metodą indukcji tworzenia EB. Zaokrąglone dno wiszącej kropli umożliwia agregację komórek ES, które mogą zapewnić komórkom mES dobre środowisko do tworzenia EB. Liczbę komórek ES zgromadzonych w wiszącej kropli można kontrolować, zmieniając liczbę komórek w początkowej zawiesinie komórek, która ma być zawieszona jako kropla na pokrywie szalki Petriego. Za pomocą tej metody możemy w powtarzalny sposób utworzyć jednorodne EB z wcześniej określonej liczby komórek ES.

Protokół

1. Kolbę T75 należy zżelatynizować 0,1% roztworem żelatyny i inkubować na płytce w inkubatorze do hodowli tkankowych o temperaturze 37°C, 5%_{CO2 przez} noc dzień wcześniej.
2. Wyjąć komórki mES z inkubacji, odessać pożywkę, przepłukać hodowlę komórek ES PBS, dodać 0,05% roztwór trypsyny, aby pokryć dno naczynia (płytka 2 ml/100 mm).
3. Inkubować w temperaturze 37°C przez około 1 minutę, aż komórki zaczną złuszczać się z płytki.
   
4. Delikatnie rozcierać (pipetować w górę iw dół) trypsynizowane komórki cztery do sześciu razy, aby rozproszyć komórki ES za pomocą zatkanej pipety Pasteura. Przenieść rozproszone komórki ES do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml zawierającej  wstępnie podgrzane (37°C) podłoże mES.
   
5. Zebrać komórki przez odwirowanie. Odessać supernatant, dodać 10 ml pożywki mES i pipetować w górę iw dół, aby utworzyć zawiesinę jednokomórkową.
   
6. Przenieść zawiesinę komórkową do kolby T75 wstępnie pokrytej 0,1% żelatyną i inkubować w temperaturze 37°C  z 5% CO₂ przez godzinę
   
   *Po godzinie fibroblasty przyczepiają się do płytki, ale komórki macierzyste pozostają w pożywce. Odpipetować pożywkę, aby pobrać komórki macierzyste.
   
   
7. Obracaj komórki z prędkością 1000 obr./min przez 5 minut i odessaj pożywkę mES. Następnie dodać kolejne 10 ml pożywki różnicującej mES i ponownie zawiesić komórki przez powtarzalne pipetowanie, aż pojawi się drobna zawiesina komórek.
8. Policz komórki za pomocą hemocytometru, użyj pożywki różnicującej, aby rozcieńczyć zawiesinę komórek macierzystych do stężenia od 400 do 500 komórek na 20ul (20ul / kroplę)  w sterylnej misce.
9. Podnieś pokrywkę, ostrożnie odwróć ją i umieść na naczyniu zawierającym 10 ml PBS.  Za pomocą pipety wielokanałowej nałóż rzędy kropli o wartości 20 ul na odwróconą do góry wewnętrznej powierzchni pokrywki naczynia do hodowli tkankowej.
10. Ostrożnie umieść naczynie w inkubatorze na 2 dni. Po dwóch dniach ostrożnie odwróć pokrywę płytki, odessaj 180 ul świeżej pożywki różnicującej i wlej kilka kropli do studzienki 96-dołkowej płytki mocującej ultranisko. Następnie nabierz kroplę za pomocą pipety i przenieś krople, jedna po drugiej, na płytkę 96-dołkową. Umieść płytki w inkubatorze bez przeszkód przez 3 dni.
    
11. Pokryj każdą studzienkę 48-dołkowej płytki do hodowli tkankowej 300ul 0,1% żelatyny. Po dodaniu żelatyny inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37°C dzień wcześniej przed przeniesieniem Ebs.
    
12. Następnego dnia odessać żelatynę z płytki 48-dołkowej. Następnie dodaj 300 ul pożywki różnicującej do każdej studzienki. Przenieś EB z 96 dołków na 48 dołków pokrytych żelatyną, jedna po drugiej. Zmień pożywkę następnego dnia, a następnie zmieniaj pożywkę co drugi dzień, aby utrzymać komórki.
    
13. Spontaniczne skurcze kardiaomyocytów powinny być widoczne w ciągu 7 dni.

Dyskusja

Wady metody wiszącej kropli są następujące: objętość cieczy w kropli jest ograniczona do mniej niż 50 ul ze względu na utrzymywanie wiszących kropli na pokrywie przez napięcie powierzchniowe i nie można zmienić podłoża do zawieszania kropli. Obserwacja powstawania EB w kroplach bezpośrednio za pomocą mikroskopii jest również bardzo trudna podczas uprawy. Co więcej, metoda wiszącego upuszczania składa się z dwóch kroków, dlatego seria kroków metody wiszącego upuszczania może być kłopotliwa.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik	DMEM	GIBCO, firmy Life Technologies	11965-092
Odczynnik do płodowej surowicy bydlęcej (FBS)		Hyclon	SH30070.03
Odczynnik L-glutaminy		GIBCO, firmy Life Technologies	25030
Odczynnik aminokwasów endogennych		GIBCO, firmy Life Technologies	11140-050
Penicyllina / Odczynnik Streptomycyny		GIBCO, firmy Life Technologies	15140-122
Odczynnik pirogronianu sodu		GIBCO, firmy Life Technologies	11360-70
β-mercapt– odczynnik do tanolu		Chemicon International	ES-007-E
czynnik hamujący białaczkę (LIF)	Odczynnik	Chemicon International	LIF2005
96-dołkowa ultraniska płytka mocująca	Narzędzie	Corning	3474