Różnicowanie in vitro mysich embrionalnych komórek macierzystych (mES) z wykorzystaniem metody wiszącej kropli

Podsumowanie

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób przeprowadzania różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w ciała zarodkowe z wykorzystaniem metody wiszących kropli.

Streszczenie

Komórki macierzyste posiadają niezwykły potencjał do różnicowania się w wiele różnych typów komórek. Podczas podziału komórki macierzystej każda nowa komórka może pozostać komórką macierzystą lub przekształcić się w inny typ komórki o bardziej wyspecjalizowanej funkcji. Te obiecujące perspektywy naukowe skłaniają badaczy do analizy możliwości zastosowania terapii komórkowych w leczeniu chorób. Podczas hodowli w zawiesinie bez czynników przeciwróżnicujących, embrionalne komórki macierzyste spontanicznie różnicują się i tworzą trójwymiarowe agregaty wielokomórkowe. Agregaty komórkowe te nazywa się ciałami embrionalnymi (EB). Hodowla w kropli wiszącej jest powszechnie stosowaną metodą indukcji powstawania EB. Zaokrąglone dno kropli wiszącej umożliwia agregację komórek ES, co zapewnia komórkom mES odpowiednie środowisko do tworzenia ciał EB. Liczbę komórek ES agregujących się w kropli wiszącej można kontrolować poprzez zmianę liczby komórek w początkowej zawiesinie komórkowej, która jest zawieszana w formie kropli z pokrywki szalki Petriego. Stosując tę metodę, możemy w sposób powtarzalny tworzyć jednorodne ciała EB z określonej liczby komórek ES.

Protokół

1. Przetraktować kolbę T75 0,1% roztworem żelatyny i inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C i 5% CO₂ przez noc, dzień przed eksperymentem.
2. Wyjąć komórki mES z inkubatora, odessać medium, przepłukać hodowlę komórek ES za pomocą PBS, a następnie dodać 0,05% roztwór trypsyny, aby pokryć dno naczynia (2 ml/płytka 100 mm).
3. Inkubować w temperaturze 37°C przez około 1 minutę, aż komórki zaczną odklejać się od płytki.
   
4. Delikatnie triturować (pipetować w górę i w dół) trypsynizowane komórki od czterech do sześciu razy za pomocą zapchanej pipety Pasteura, aby rozproszyć komórki ES. Przenieść rozproszone komórki ES do stożkowej probówki wirówki o pojemności 15 ml zawierającej  uprzednio podgrzane (37°C) medium mES.
   
5. Zebrać komórki przez wirowanie. Odessać supernatant, dodać 10 ml medium mES i pipetować w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.
   
6. Przenieść zawiesinę komórkową do kolby T75 uprzednio pokrytej 0,1% żelatyną i inkubować w temperaturze 37°C  przy 5% CO₂ przez jedną godzinę.
   
   *Po godzinie fibroblasty przyłączą się do płytki, natomiast komórki macierzyste pozostaną w medium. Odessać medium pipetą, aby zebrać komórki macierzyste.
   
   
7. Wirować komórki z prędkością 1000 rpm przez 5 min i odessać medium mES. Następnie dodać kolejne 10 ml medium różnicującego mES i resuspenderć komórki poprzez wielokrotne pipetowanie, aż powstanie jednorodna zawiesina komórek.
8. Policzyć komórki za pomocą hemocytometru; użyć medium różnicującego do rozcieńczenia zawiesiny komórek macierzystych do stężenia od 400 do 500 komórek na 20 µl (20 µl/kropla)  w sterylnym naczyniu.
9. Podnieść pokrywkę, ostrożnie ją odwrócić i położyć na naczyniu zawierającym 10 ml PBS.  Używając pipety wielokanałowej, nanieść rzędy kropli o objętości 20 µl na odwróconą wewnętrzną powierzchnię pokrywki naczynia do hodowli tkanek.
10. Ostrożnie umieścić naczynie w inkubatorze na 2 dni. Po dwóch dniach ostrożnie odwrócić pokrywkę płytki, odessać 180 µl świeżego medium różnicującego i nanieść kilka kropli do dołka płytki 96-dołkowej o ultraniskiej adhezji (ultralow attachment plate). Następnie pobrać kroplę pipetą i przenosić krople pojedynczo do płytki 96-dołkowej. Umieścić płytki w inkubatorze bez zakłóceń na 3 dni.
    
11. Pokryć każdy dołek 48-dołkowej płytki do hodowli tkanek 300 µl 0,1% żelatyny. Po dodaniu żelatyny inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37°C na dzień przed przeniesieniem ciał embrioidalnych (EB).
    
12. Następnego dnia odessać żelatynę z płytki 48-dołkowej. Następnie dodać 300 µl medium różnicującego do każdego dołka. Przenieść EB z płytek 96-dołkowych do 48-dołkowych płytek pokrytych żelatyną, jedna po drugiej. Wymienić medium następnego dnia, a następnie wymieniać medium co drugi dzień w celu utrzymania komórek.
    
13. Spontaniczne skurcze kardiomiocytów powinny stać się widoczne w ciągu 7 dni.

Dyskusja

Wady metody wiszącej kropli są następujące: objętość cieczy w kropli jest ograniczona do mniej niż 50ul ze względu na konieczność utrzymania kropli na pokrywce za pomocą napięcia powierzchniowego, a wymiana medium w wiszących kroplach jest niemożliwa. Bezpośrednia obserwacja tworzących się w kroplach ciał embrioidalnych (EB) za pomocą mikroskopii podczas hodowli jest również bardzo trudna. Ponadto metoda wiszącej kropli składa się z dwóch etapów, w związku z czym seria kroków w tej metodzie może być kłopotliwa.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	11965-092
Płodowa surowica bydlęca (FBS)	Odczynnik	Hyclone	SH30070.03
L-glutamina	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	25030
Niezbędne aminokwasy	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	11140-050
Penicylina / Streptomycyna	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Pirowinian sodu	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	11360-70
β-merkapto–etanol	Odczynnik	Chemicon International	ES-007-E
czynnik hamujący białaczkę (LIF)	Odczynnik	Chemicon International	LIF2005
płytka 96-dołkowa o bardzo niskiej adhezji	Narzędzie	Corning	3474