Pełny protokół tekstowy dla tego podejścia eksperymentalnego jest dostępny w <a href="http://mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb1110/current/abstract?hd=author,Powers]">Current Protocols in Cell Biology</a>.

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

pozyskiwanie komórek jajowych od samic xenopus laevis

Obtaining Eggs from Xenopus laevis Females

Jaja *Xenopus laevis* w stanie nienaruszonym, lizowanym i/lub frakcjonowanym są przydatne w szerokim zakresie eksperymentów. Niniejszy protokół przedstawia sposób indukowania składania jaj, ich zbierania i usuwania otoczki galaretowatej oraz sortowania jaj w celu usunięcia osobników uszkodzonych.

Jaja Xenopus laevis w stanie nienaruszonym, lizowanym i/lub frakcjonowanym są przydatne w szerokim zakresie eksperymentów. Niniejszy protokół przedstawia sposób indukowania składania jaj, ich zbierania i usuwania otoczki galaretowatej, a także sortowania jaj w celu usunięcia osobników uszkodzonych.

Pozyskiwanie komórek jajowych od samic Xenopus laevis

Jaja *Xenopus laevis* w stanie nienaruszonym, lizowanym i/lub frakcjonowanym są przydatne w szerokim zakresie eksperymentów. Niniejszy protokół przedstawia sposób indukcji składania jaj, ...

Ekstrakty z jaj Xenopus laevis są użytecznym źródłem materiału cytoplazmatycznego i organelli do in vitro rekonstrukcji procesów komórkowych, takich jak montaż jądra komórkowego oraz import białek jądrowych. Oczywiście, zanim będzie można wykorzystać ekstrakty z jaj, należy najpierw pozyskać jaja od samic żab. Cześć, nazywam się Marie Cross i jestem doktorantką w laboratorium dr Maureen Power w Katedrze Biologii Komórki na Uniwersytecie Emory w Atlancie w stanie Georgia.Dzisiaj pokażemy Państwu, jak pozyskiwać i odmiatać jaja żelowe od dojrzałych samic Opus lavis. Procedura ta obejmuje następujące etapy: przygotowanie żab do składania jaj za pomocą serym gonadotropiny, indukowanie składania jaj za pomocą ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej oraz odsortowanie uszkodzonych jaj lub oocytów. Zapraszamy do rozpoczęcia.Aby wyprodukować jaja, dojrzałe samice żab są najpierw stymulowane gonadotropiną z surowicy ciężarnej klaczy. Aby rozpocząć procedurę stymulacji, należy przygotować zbiornik zawierający 100 mM chlorku sodu do przetrzymywania żab. Po wstrzyknięciu preparatu, stymulowane żaby powinny być utrzymywane w zagęszczeniu wynoszącym około jednej żaby na litr.Optymalną produkcję jaj utrzymuje się, trzymając żaby w temperaturze 18 °C. Używając igły o rozmiarze 27 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 1 ml, wstrzyknij żabie podskórnie do grzbietowego worka limfatycznego 0,5 ml roztworu gonadotropiny seryjnej klaczy w stężeniu 200 jednostek/ml.Przenieś żaby przygotowane do rozrodu z powrotem do zbiornika zawierającego 100 mM NaCl. Po dwóch do trzech dniach indukuj składanie jaj poprzez wstrzyknięcie żabom 0,5 ml roztworu gonadotropiny kosmicznej człowieka (hCG) o stężeniu 100 jednostek/ml. Ponownie wstrzyknij preparat podskórnie do grzbietowego worka limfatycznego.Po iniekcji umieść każdą żabę w pięciu litrach 100 mM chlorku sodu. Najlepiej umieścić każdą żabę w oddzielnym pojemniku, ponieważ jakość jaj różni się w zależności od osobnika. Około 16 do 22 godzin po iniekcji ludzkiej gonadotropiny kosmórkowej przenieś żabę do zbiornika z czystą wodą i przelej jaja do zlewki.Zaleca się obserwację żab przez jeden do dwóch dni w celu wykrycia objawów infekcji w miejscu wstrzyknięcia. Na tym etapie każde jajo jest otoczone przezroczystą galaretowatą otoczką, która zapobiega ich wzajemnemu dotykaniu; aby usunąć galaretkę z jaj, należy je jednokrotnie wypłukać w 2%L cysteinie o pH 8, a następnie inkubować w 100 bills roztworu 2%L cysteiny na żabę przez około pięć minut. W temperaturze pokojowej należy delikatnie i okresowo obracać jaja po upływie pięciu minut.Odlać roztwór cysteiny z jaj jeziornych i przemyć je trzykrotnie w 0,25-krotnym zmodyfikowanym roztworze Ringera. W celu usunięcia zanieczyszczeń, przełożyć jaja do szklanej szalki Petriego o średnicy 100 mm, pracując pod mikroskopem stereoskopowym. Usunąć uszkodzone jaja z szalki Petriego za pomocą pipety Pasteura.Dojrzałe jaja xip mają ciemno pigmentowaną połowę u góry i jasną połowę u dołu. W centrum ciemno pigmentowanej półkuli dojrzałego jaja powinna być widoczna biała kropka o rozmiarach punktowych, świadcząca o dojrzewaniu oocytu. Za dobre uznaje się jaja o równomiernej pigmentacji.Każde jajo bez tej białej plamki jest oocytem i należy je usunąć. Należy również usunąć wszystkie jaja, które są białe, powiększone lub niejednolicie pigmentowane. Jajo w szczególnie złym stanie będzie wyglądać jak biała, puszysta kulka z całkowicie zatarciem granicy między półkulami. Przesortowane jaja należy przemyć dwa do trzech razy, wlewając na nie bufor lizujący jaja, a następnie ostrożnie go zlewając, minimalizując liczbę wypłukanych jaj.Teraz można przeprowadzić lizę jaj i przygotować ekstrakty. Właśnie pokazaliśmy, jak pozyskiwać jaja od dojrzałych samic Xenopus laevis oraz jak usuwać z nich galaretkę. Koniecznie obejrzyjcie nasze dwa pozostałe filmy, w których pokazujemy, jak przygotować surowe ekstrakty z jaj oraz jak zrekonstytuować zbiórkę jądra in vitro z wykorzystaniem frakcjonowanych ekstraktów z jaj.To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

obtaining-eggs-from-xenopus-laevis-females

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pozyskiwanie jaj od samic Xenopus laevis

Emory University.  Jaja Xenopus laevis nienaruszone, zlizowane i/lub frakcjonowane są przydatne do szerokiej gamy eksperymentów. Protokół ten pokazuje, jak skłonić do składania jaj, zebrać i rozdrobnić jaja oraz posortować jaja w celu usunięcia wszelkich uszkodzonych jaj.

Summary

Jaja *Xenopus laevis* w stanie nienaruszonym, lizowanym i/lub frakcjonowanym są przydatne w szerokim zakresie eksperymentów. Niniejszy protokół przedstawia sposób indukowania składania jaj, ich zbierania i usuwania otoczki galaretowatej oraz sortowania jaj w celu usunięcia osobników uszkodzonych.

Pozyskiwanie komórek jajowych od samic Xenopus laevis

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Protokół

Oświadczenia

Przedruki i uprawnienia

Tagi