Test nieswoistej aktywności proteazy firmy Sigma – kazeina jako substrat

Podsumowanie

Proteazy rozrywają wiązania peptydowe. W laboratorium często zachodzi konieczność pomiaru i/lub porównania aktywności proteaz. Test nieswoistej aktywności proteaz firmy Sigma może być stosowany jako zstandaryzowana procedura do oznaczania aktywności proteaz.

Streszczenie

Proteazy rozrywają wiązania peptydowe. W laboratorium często konieczne jest pomiar i/lub porównanie aktywności proteaz. Test niespecyficznej aktywności proteazy firmy Sigma może być wykorzystany jako zstandaryzowana procedura do oznaczania aktywności proteaz, co stosujemy w naszych procedurach kontroli jakości. W tym teście kazeina pełni rolę substratu. Podczas gdy badana proteaza trawi kazeinę, uwalniany jest aminokwas tyrozyna wraz z innymi aminokwasami i fragmentami peptydowymi. Odczynnik Folina i Ciocalteusa, czyli odczynnik Folina, reaguje przede wszystkim z wolną tyrozyną, tworząc niebieski chromofor, który jest mierzalny i określany jako wartość absorbancji w spektrofotometrze. Im więcej tyrozyny zostanie uwolnionych z kazeiny, tym więcej chromoforów powstaje, co świadczy o silniejszej aktywności proteazy. Wartości absorbancji wynikające z aktywności proteazy są porównywane z krzywą wzorcową, którą tworzy się poprzez reakcję znanych ilości tyrozyny z odczynnikiem F-C, aby skorelować zmiany absorbancji z ilością tyrozyny w mikromolach. Na podstawie krzywej wzorcowej można określić aktywność próbek proteazy w Jednostkach, które stanowią ilość ekwiwalentów tyrozyny w mikromolach uwalnianych z kazeiny na minutę.

Aby wyświetlić ten artykuł w języku chińskim, kliknij tutaj

Protokół

Przed rozpoczęciem analizy należy upewnić się, że poniższe odczynniki zostały prawidłowo przygotowane:

1. Bufor fosforanowo-potasowy 50 mM, pH 7.5. Przygotować, stosując 11.4 mg/ml fosforanu potasu dwuzasadowego, trihydratu w wodzie oczyszczonej i regulując pH za pomocą 1M HCl. Roztwór ten należy ogrzać do 37°C przed użyciem.
2. 0.65% (w/v) roztwór kazeiny, przygotowany poprzez wymieszanie 6.5 mg/ml kazeiny w buforze fosforanowo-potasowym 50 mM. Stopniowo zwiększać temperaturę roztworu przy delikatnym mieszaniu do 80-85 °C przez około 10 minut, aż do uzyskania homogennej dyspersji. Bardzo ważne jest, aby nie doprowadzić do zagotowania roztworu. Następnie, w razie potrzeby, należy wyregulować pH za pomocą NaOH i HCl.
3. 110 mM roztwór kwasu trójchlorooctowego, przygotowany poprzez rozcieńczenie roztworu stokowego 6.1N w stosunku 1:55 wodą oczyszczoną. Kwas trójchlorooctowy jest silnym kwasem i należy z nim obchodzić się ostrożnie.
4. 0.5 mM odczynnik Folina i Ciocalteu, lub odczynnik fenolowy Folina, który jest roztworem reagującym z tyrozyną w celu wywołania mierzalnej zmiany barwy bezpośrednio związanej z aktywnością proteaz. Odczynnik fenolowy Folina jest kwasem i należy z nim obchodzić się ostrożnie.
5. 500 mM roztwór węglanu sodu, przygotowany z użyciem 53 mg/ml bezwodnego węglanu sodu w wodzie oczyszczonej.
   Roztwór rozcieńczający enzym, składający się z 10 mM buforu octanu sodu z 5mM octanu wapnia, pH 7.5, w temperaturze 37°C. Roztwór ten służy do rozpuszczania stałych próbek proteazy lub rozcieńczania roztworów enzymów.
6. 1.1 mM roztwór stokowy standardu L-tyrozyny. Przygotowany przy użyciu 0.2 mg/ml L-tyrozyny w wodzie oczyszczonej i delikatnie podgrzany do czasu rozpuszczenia tyrozyny. Podobnie jak w przypadku kazeiny, nie wolno gotować tego roztworu. Pozostawić standard L-tyrozyny do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Roztwór ten zostanie następnie rozcieńczony w celu sporządzenia krzywej wzorcowej.
7. Roztwór proteazy. Bezpośrednio przed użyciem rozpuścić proteazę w roztworze rozcieńczającym enzym przygotowanym w kroku 6.

W razie potrzeby należy użyć stałej próbki proteazy o określonej aktywności, którą rozpuszcza się w rozcieńczalniku enzymów do stężenia 0,1-0,2 units/ml. Roztwór ten służy jako kontrola pozytywna w teście kontroli jakości oraz jako walidacja obliczeń, które zostaną wykonane w celu określenia aktywności enzymu.

Przygotowanie testu proteazy i krzywych wzorcowych

1. Aby rozpocząć ten pomiar, należy przygotować odpowiednie fiolki o pojemności około 15 ml. Dla każdego enzymu poddanego badaniu wymagane są 4 fiolki. Jedna fiolka posłuży jako próbka ślepa, a pozostałe trzy do pomiaru aktywności trzech rozcieńczeń proteazy. Wykorzystanie trzech rozcieńczeń jest pomocne przy wzajemnej weryfikacji końcowych obliczeń.
   1. Do każdego zestawu czterech fiolek należy dodać 5 ml 0,65% roztworu kazeiny. Następnie należy pozostawić je do wyrównania temperatury w kąpieli wodnej w 37°C przez około 5 minut.
   2. Do trzech fiolek z próbkami badawczymi, z wyłączeniem próbki ślepej, należy dodać zmienne objętości badanego roztworu enzymu. Próbki należy wymieszać przez delikatne obracanie i inkubować w 37°C przez dokładnie dziesięć minut. Przedmiotem pomiaru i porównania między próbkami badawczymi będzie aktywność proteazy oraz wynikające z niej uwalnianie tyrozyny w tym czasie inkubacji.
2. Po tej 10-minutowej inkubacji do każdej probówki należy dodać 5 ml odczynnika TCA, aby zatrzymać reakcję. Następnie do każdej probówki, w tym do próbki ślepej, należy dodać odpowiednią objętość roztworu enzymu tak, aby końcowa objętość roztworu enzymu w każdej probówce wynosiła 1 ml. Czynność ta ma na celu uwzględnienie wartości absorbancji samego enzymu oraz zapewnienie jednakowej końcowej objętości w każdej probówce. Roztwory należy inkubować w 37°C przez 30 minut.
   
   
   Podczas tej 30-minutowej inkubacji można przygotować rozcieńczenia wzorca tyrozyny. Należy użyć fiolek o pojemności 6 dramów (można je zastąpić probówkami polipropylenowymi), które bez trudu pomieszczą 8 ml. Do sześciu fiolek należy dodać roztwory stokowe wzorca tyrozyny 1,1 mM w następujących objętościach w ml: 0,05, 0,10, 0,20, 0,40, 0,50. Do próbki ślepej nie dodaje się wzorca tyrozyny. W przypadku nieczystych próbek badawczych, które wywołają niewielką zmianę barwy, mogą być wymagane niższe stężenia wzorców. Po dodaniu roztworu wzorca tyrozyny do każdego z nich należy dodać odpowiednią objętość wody oczyszczonej, aby doprowadzić objętość do 2 ml.
3. Po 30-minutowej inkubacji każdy z roztworów badawczych oraz próbkę ślepą należy przefiltrować za pomocą strzykawkowego filtra z polietersulfonu 0,45 µm. Filtracja jest niezbędna do usunięcia z próbek wszelkich substancji nierozpuszczalnych.
   1. Przesączone 2 ml próbek badawczych i filtrat próbki ślepej należy przenieść do 4 fiolek o pojemności co najmniej 8 ml. Można użyć tego samego rodzaju fiolek, w których przygotowano wzorce.
   2. Do wszystkich fiolek zawierających wzorce i ślepą próbkę wzorca należy dodać 5 ml węglanu sodu. Dla uzyskania najlepszych wyników należy bezzwłocznie dodać 1 ml odczynnika Folina.
   3. Węglan sodu dodaje się w celu zneutralizowania spadku pH spowodowanego dodaniem odczynnika Folina.
   4. Do próbek badawczych i ślepej próbki badawczej należy dodać węglan sodu. Roztwory te stają się mętne po dodaniu węglanu sodu. Następnie należy dodać odczynnik Folina, który zareaguje głównie z wolną tyrozyną.
   5. Fiolki należy wymieszać przez delikatne obracanie i inkubować w 37°C przez 30 minut.
   Po tej inkubacji powinno być zauważalne, że wzorce wykazują gradację barwy korelującą z ilością dodanej tyrozyny; najwyższe stężenia tyrozyny będą miały najciemniejszy kolor. W próbkach badawczych również można zauważyć wyraźną zmianę barwy. 2 ml tych roztworów należy przefiltrować za pomocą strzykawkowego filtra z polietersulfonu 0,45 µm do odpowiednich kuwet. Po wykonaniu pomiaru  można przejść do spektrofotometru w celu zarejestrowania wartości absorbancji.

Pomiar absorbancji i obliczanie aktywności enzymu

1. Absorbancję próbek pomiarza się za pomocą spektrofotometru przy długości fali 660nm. Droga optyczna jest ustawiona na 1cm. Należy zapisać wartości absorbancji dla standardów, ślepej próby standardu, poszczególnych próbek badawczych oraz ślepej próby badawczej. Po zebraniu wszystkich danych można sporządzić krzywą wzorcową. W celu wygenerowania krzywej należy obliczyć różnicę absorbancji między standardem a ślepą próbą standardu. Jest to wartość absorbancji przypisywana ilości tyrozyny w roztworach standardowych. Po tym prostym obliczeniu należy stworzyć krzywą wzorcową za pomocą programu graficznego, nanosząc zmianę absorbancji standardów na oś Y, a ilość w mikromolach dla każdego z 5 standardów na oś X.
   
   

   Objętość standardu tyrozyny>	uMole tyrozyny>
   0,05	0,055
   0,10	0,111
   0,20	0,221
   0,40	0,442
   0,50	0,553

2. Po wprowadzeniu punktów danych należy wyznaczyć linię trendu i odpowiadające jej równanie nachylenia.
   
   
   Zmianę absorbancji w próbkach badawczych wyznacza się obliczając różnicę między absorbancją próbki badawczej a absorbancją ślepej próby badawczej. Podstawienie wartości absorbancji jednej z próbek badawczych do równania nachylenia i rozwiązanie go pozwoli uzyskać liczbę mikromoli tyrozyny uwolnionej podczas tej konkretnej reakcji proteolitycznej. Aby obliczyć aktywność enzymu w jednostkach/ml, należy wykonać następujące obliczenie:
   
   
   (uwolnione ekwiwalenty umole tyrozyny) x (11)
   Jednostki/ml enzymu = __________________________________________
   
   (1) x (10) x (2)
   
   
   11= Całkowita objętość testu (w mililitrach)
   10= Czas testu (w minutach) zgodnie z definicją jednostki
   1= Objętość enzymu (w mililitrach) użytego w teście
   2= Objętość (w mililitrach) użyta w oznaczaniu kolorymetrycznym
   
   
   Należy wziąć liczbę uwolnionych ekwiwalentów mikromoli tyrozyny uzyskaną z równania nachylenia i pomnożyć ją przez całkowitą objętość testu w ml, która w naszym przypadku wynosi 11ml. Wartość tę należy podzielić przez trzy inne wielkości: czas testu, który trwał 10 minut, objętość enzymu użytego w teście, która była zmienna (przyjmijmy 1ml), oraz objętość w mililitrach użytą w detekcji kolorymetrycznej, która może się różnić w zależności od użytej kuwety. My użyliśmy 2ml.
3. Iloraz mikromoli tyrozyny i czasu w minutach daje pomiar aktywności proteazy nazywany „jednostkami”. Możemy skrócić jednostki pomiaru objętości w liczniku i mianowniku, otrzymując pomiar aktywności enzymu w jednostkach/ml. Aby określić aktywność w stałej próbce proteazy rozcieńczonej w rozcieńczalniku enzymu, dzielimy aktywność w jednostkach/ml przez stężenie substancji stałej pierwotnie użytej w tym teście w mg/ml, co daje nam aktywność w jednostkach/mg.
   
   
   Jednostki/ml enzymu
   Jednostki/mg substancji stałej = _____________________
   
   mg substancji stałej/ ml enzymu
   
   

Dyskusja

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób analizy aktywności proteazy z wykorzystaniem uniwersalnego testu aktywności proteazy firmy Sigma. Ponadto test ten jest przydatny do upewnienia się, że nasze proteazy mają precyzyjnie określoną aktywność przed ich dostarczeniem do Państwa eksperymentów. Jak Państwo zauważyli, podczas wykonywania tej procedury niezwykle ważne jest, aby powoli podgrzewać zarówno roztwory kazeiny, jak i tyrozyny i nie dopuścić do ich zagotowania. Krytyczne jest również przygotowanie oddzielnych prób ślepych zarówno dla wzorców, jak i dla każdej z badanych próbek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Proteaza	Sigma-Aldrich	P4630
Fosforan potasu, dwuzasadowy, trihydrat	Sigma-Aldrich	P5504
Kazeina	Sigma-Aldrich	C7078
Kwas trójchlorooctowy	Sigma-Aldrich	T0699
Folin &odczynnik fenolowy Ciocalteu	Sigma-Aldrich	F9252
Węglan sodu, bezwodny	Sigma-Aldrich	S2127
Octan sodu, trihydrat	Sigma-Aldrich	S8625
Octan wapnia	Sigma-Aldrich	C1000
L-tyrozyna, wolna zasada	Sigma-Aldrich	T3754
Zestaw Protease Profiler	Sigma-Aldrich	PP0500
Zestaw do fluorescencyjnej detekcji proteaz	Sigma-Aldrich	PF0100