Badanie zachowań węchowych u dorosłych myszy

Podsumowanie

Fundamentalne, a zarazem unikalne właściwości układu węchowego gryzoni sprawiły, że staje się on coraz częściej przedmiotem badań biologów. Istnieje zatem potrzeba opracowania stosunkowo prostego sposobu oceny jego funkcji. W niniejszej pracy opisujemy czułe testy służące do charakterystyki wrażliwości i preferencji węchowych myszy.

Streszczenie

Gryzoniowy system węchowy budzi coraz większe zainteresowanie naukowców i jest badany m.in. w ramach biologii systemowej ze względu na swoje stereotypowe, a jednocześnie przystępne obwody neuronalne. Ponadto wyjątkowa zdolność tego obszaru do generowania nowych neuronów przez całe życie organizmu sprawia, że jest on atrakcyjnym systemem zarówno dla biologów rozwoju, jak i regeneracyjnych. Takie zainteresowanie stwarza potrzebę znalezienia sposobu na szybką, a zarazem wiarygodną ocenę funkcji węchowych. Wiele testów zdolności węchowych jest złożonych, zmiennych lub nie została zaprojektowana specjalnie dla myszy. Ponadto niektóre testy są wrażliwe nie tylko na wady zdolności węchowych, ale również na deficyty pamięci, co utrudnia interpretację uzyskanych wyników.

W niniejszej pracy opisujemy prosty zestaw testów zaprojektowany w celu zidentyfikowania deficytów w czułości i preferencjach węchowych. Po pierwsze, wstępna ocena ogólnego stanu zdrowia pozwala na wyłonienie zwierząt odpowiednich do dalszych badań. Po drugie, myszy są poddawane działaniu różnych rozcieńczeń zapachów, aby ustalić, czy występuje różnica w progu detekcji. Po trzecie, myszom prezentuje się różne zapachy, zarówno atrakcyjne, jak i awersyjne, co pozwala na ocenę preferencji węchowych. Te proste badania powinny sprawić, że wstępna charakterystyka zachowań węchowych stanie się dostępna dla laboratoriów o różnym stopniu wyposażenia i doświadczenia.

Protokół

Ogólne badanie stanu zdrowia

Bardziej szczegółowe omówienie ogólnych badań stanu zdrowia można znaleźć w doskonałym opracowaniu dotyczącym fenotypowania behawioralnego autorstwa Jacqueline Crawley pt. What’s Wrong with my Mouse? ¹. W pierwszej kolejności stosujemy zmodyfikowany zestaw testów obserwacyjnych w celu oceny ogólnego stanu zdrowia badanego osobnika. Zestaw ten obejmuje elementy z kompleksowego protokołu oceny Samuela Irwina², co pozwala na szybką identyfikację osobników nieprzydatnych do dalszych badań. W skrócie, zmodyfikowany zestaw pozwala zidentyfikować zwierzęta z nieprawidłowościami fizycznymi (np. z silną niedowagą lub nadwagą, zaniedbaną pielęgnacją, dusznością) lub wykazujące nieprawidłową postawę, lokomocję bądź zachowanie. Wszystkie te objawy mogą świadczyć o chorobie. Właściwa będzie każda wstępna ocena, która w podobny sposób pozwala zidentyfikować osobniki niezdrowe.

Należy również zauważyć, że zwierzęta są traktowane w sposób humanitarny zarówno podczas ogólnego badania stanu zdrowia, jak i podczas późniejszych testów. Nie stosuje się znieczulenia ani leków przeciwbólowych, ponieważ testy te nie obejmują żadnych potencjalnie bolesnych procedur.

Testowanie wrażliwości węchowej

Test ten został zaprojektowany w celu wykrycia różnic w wrażliwości węchowej między dwiema grupami myszy (np. grupą zwierząt typu dzikiego a grupą mutantów). W teście tym przygotowuje się wielokrotne rozcieńczenia zapachu. Następnie naiwne zwierzę bada pojedyncze rozcieńczenie tego zapachu, a całkowity czas eksploracji (w ciągu 3 minut) zostaje zarejestrowany. Różne rozcieńczenia zapachu są testowane na odrębnych, naiwnych osobnikach, a całkowity czas eksploracji służy do wygenerowania krzywych zależności efektu od dawki dla każdej grupy myszy. W badaniu powinny uczestniczyć dwaj badacze, z czego jeden powinien być zaślepiony względem genotypów i/lub stanu badanych osobników.

Główny badacz

1. Przygotuj cztery czyste klatki (8 H x 10 W x 18 L, w calach), wszystkie bez ściółki. Ustaw cztery klatki w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
2. Ustaw ścianki działowe między poszczególnymi arenami, używając nieprzezroczystego papieru filtracyjnego. Umieść czarny brystol na ostatniej ściance działowej w taki sposób, aby czarna strona wyścielała bok i dno klatki. Przykryj górę areny przezroczystym kawałkiem pleksiglasu, aby umożliwić oświetlenie areny światłem.
   (a) (b)
   Rysunek 1. Konfiguracja areny. (a) Prawidłowo osłonięta, pusta arena (b) Arena z badanym obiektem i nasączonym aromatem papierem filtracyjnym.


3. Rozpocznij habituację badanych obiektów. Umieść pierwszy obiekt w pierwszej klatce w celu habituacji. Po 15 minutach przenieś pierwszy obiekt do drugiej klatki. Oczyść pierwszą klatkę preparatem Quatricide TB. Następnie umieść drugi obiekt w pierwszej, oczyszczonej klatce. Kontynuuj ten proces z kolejnymi obiektami. Ostatecznie każdy obiekt powinien przejść habituację we wszystkich trzech klatkach przed umieszczeniem w arenie (czwartej i ostatniej klatce) na kolejne 15 minut habituacji przed rozpoczęciem testów.

Badacz zaślepiony

1. Przygotuj odpowiednią liczbę kwadratów papieru filtracyjnego o wymiarach 2 cali na 2 cale do próbek zapachowych.
2. Odpowiednio rozcieńcz wcześniej wybrany zapach. W przypadku próbek hydrofobowych, takich jak masło orzechowe, użyj oleju jako rozpuszczalnika; dla wszystkich pozostałych użyj wody destylowanej. Wymieszaj w wibratorze typu vortex.
3. Ustaw urządzenie do cyfrowego zapisu wideo na przeciwległym końcu komory bezpieczeństwa biologicznego w taki sposób, aby cały koniec klatki był w ostrości. Nagraj film próbny, aby upewnić się, że parametry są odpowiednie.
4. Zapisz kolejność testowania rozcieńczeń, dbając o randomizację kolejności prób.
5. Zapisz numer miotu i numery identyfikacyjne obiektu badawczego.
6. Po 15-minutowej habituacji obiektu w arenie, rozpocznij przygotowania do pierwszej próby. Pipetuj pierwsze rozcieńczenie w górę i w dół w probówce stożkowej, a następnie nanieś je na kwadrat papieru filtracyjnego. Powierzchnia papieru filtracyjnego powinna być optymalnie pokryta w ~85% (około 0.50 mls roztworu). Użyj chusteczki Kimwipe, aby upewnić się, że papier filtracyjny nie jest nadmiernie nasycony.
7. Rozpocznij nagrywanie wideo.
8. Umieść kwadrat papieru filtracyjnego w klatce po przeciwnej stronie aktualnego położenia zwierzęcia.
9. Uruchom pomiar czasu.
10. Po 3 minutach zatrzymaj nagrywanie i usuń rozcieńczony zapach.
11. Jeśli testowany jest tylko jeden zapach (np. cynamon), usuń pierwszego obiektu badawczego z areny. Powtórz kroki 6-11 dla każdego zwierzęcia, odpowiednio rozcieńczając zapach dla każdego obiektu. Jeśli jednak testowanych jest więcej niż jeden zapach, nie usuwaj obiektu badawczego z areny. Zamiast tego, uruchom pomiar czasu.
12. Odpowiednio rozcieńcz kolejny zapach, stosując te same metody, które wymieniono powyżej.
13. Po 1 minucie rozpocznij nagrywanie wideo. Umieść kwadrat papieru filtracyjnego z rozcieńczeniem kolejnego zapachu w klatce po przeciwnej stronie aktualnego położenia zwierzęcia.
14. Powtórz kroki 6-13 dla każdego zapachu, odnotowując numer pliku wideo dla każdej próby.
15. Powtórz kroki 6-14 dla każdego obiektu.
    
    Rycina 2. Reprezentatywne wyniki sesji testowania wrażliwości węchowej. Każda mysz z grupy kontrolnej (Grupa A) lub grupy eksperymentalnej (Grupa B) była eksponowana na jedno z pięciu różnych rozcieńczeń ekstraktu z cynamonu na papierze filtracyjnym podczas jednej, 3-minutowej sesji. Oceńiono całkowity czas spędzony na badaniu papieru filtracyjnego. Myszy w Grupie A wykazują większą wrażliwość węchową niż myszy w Grupie B.

Testy preferencji zapachowych

Test ten został zaprojektowany w celu zidentyfikowania konkretnych deficytów detekcji, a mianowicie zdolności do wykrywania zapachów atrakcyjnych lub awersyjnych. Poniższa procedura w znacznym stopniu opiera się na protokole Kobayakawa, K., et al.3. Ponownie, w testowaniu powinny uczestniczyć dwie osoby, z których jedna nie zna genotypów i/lub stanu badanych osobników. Całkowity czas eksploracji dla poszczególnych zapachów jest ponownie rejestrowany (podczas analizy nagrania wideo). Zapachy, dla których całkowity czas eksploracji jest dłuższy niż dla wody, określa się jako „atrakcyjne”, natomiast zapachy o czasie krótszym niż dla wody nazywa się „awersyjnymi”. Następnie badacz analizuje, czy te same zapachy są „atrakcyjne” lub „awersyjne” dla różnych osobników testowych.

Należy wykonać kroki 1-3 opisane w sekcji Testowanie Czułości Węchu dla głównego badacza.

Badacz zaślepiony

Procedura testowania preferencji węchowych jest taka sama, z niewielkimi modyfikacjami kroków 2 i 4. Należy postępować zgodnie z krokami 1-15 opisanymi w sekcji Testowania Wrażliwości Węchowej dla badacza zaślepionego, z następującymi zmianami: w kroku 2, wykorzystując wcześniej wybrane zapachy (kombinację zapachów atrakcyjnych i awersyjnych), należy przygotować odpowiednio rozcieńczone roztwory każdego z nich w probówkach stożkowych. W przypadku próbek hydrofobowych, takich jak masło orzechowe, należy użyć oleju jako rozpuszczalnika; dla wszystkich pozostałych należy użyć wody destylowanej. Następnie należy wymieszać próbki w wstrząsarku typu vortex. W kroku 4, zamiast zapisywać rozcieńczenie do przetestowania, należy zapisać kolejność różnych zapachów, które zostaną przetestowane, randomizując kolejność prób.

Test ten został zaprojektowany w celu zidentyfikowania konkretnych deficytów w detekcji, a mianowicie zdolności do wyczuwania zapachów atrakcyjnych lub awersyjnych. Poniższa procedura w dużym stopniu opiera się na protokole Kobayakawa, K. et al.³. Ponownie w testowaniu powinny brać udział dwie osoby, z czego jedna powinna być oślepiona w kwestii genotypów i/lub stanu badanych osobników. Całkowity czas eksploracji dla różnych zapachów jest ponownie rejestrowany (podczas analizy nagrania wideo). Zapachy, dla których całkowity czas eksploracji jest dłuższy niż w przypadku wody, określa się jako „atrakcyjne”, natomiast te, dla których czas ten jest krótszy niż dla wody, nazywa się „awersyjnymi”. Następnie badacz analizuje, czy te same zapachy są „atrakcyjne” lub „awersyjne” dla różnych osobników testowych.

Prosimy o wykonanie kroków 1-3 w sekcji Testowania wrażliwości węchowej dla głównego badacza.

Badacz zaślepiony

Procedura testowania preferencji węchowych jest taka sama, z niewielkimi modyfikacjami kroków 2, 4 i 13. Należy postępować zgodnie z krokami 1-15 w sekcji Testowania Czułości Węchowej dla badacza prowadzącego próbę ślepą, z następującymi zmianami: w kroku 2, używając wcześniej wybranych zapachów (kombinacji zapachów atrakcyjnych i awersyjnych), należy przygotować odpowiednio rozcieńczone roztwory każdego z nich w probówkach stożkowych. W przypadku próbek hydrofobowych, takich jak masło orzechowe, należy użyć oleju jako rozpuszczalnika; dla wszystkich pozostałych należy użyć wody destylowanej. Wymieszać w wortexie. W kroku 4, zamiast zapisywać rozcieńczenie do przetestowania, należy zapisać kolejność różnych zapachów, które zostaną przetestowane, randomizując tę kolejność w każdej próbie. W kroku 13 należy umieścić kwadrat z papieru filtracyjnego z kolejnym zapachem w klatce po przeciwnej stronie aktualnego położenia zwierzęcia.

Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki sesji testu preferencji węchowych. Każda mysz była eksponowana na każdy z różnych zapachów na papierze filtrującym podczas jednej, trzyminutowej sesji. Oceniano całkowity czas poświęcony na eksplorację papieru filtrującego. Masło orzechowe i wanilia są zapachami atrakcyjnymi (czas eksploracji_zapach > czas eksploracji_woda), a kwas 2-metylobutyrowy jest awersyjny (czas eksploracji_zapach < czas eksploracji_woda).

Ocena testów węchowych

Po zarejestrowaniu wszystkich filmów dotyczących wrażliwości i preferencji węchowych należy przeanalizować całkowity czas spędzony na eksploracji każdego rozcieńczenia/zapachu. Wszystkie filmy powinny zostać przeanalizowane przez badacza prowadzącego analizę w ślepej próbie w celu zapewnienia spójności wyników.

1. Przejrzyj film, zwracając uwagę na następujące momenty: a) umieszczenie papieru filtracyjnego w arenie, b) zbliżenie się myszy do papieru filtracyjnego, c) rozpoczęcie badania papieru filtracyjnego przez mysz oraz d) upływ trzech minut (od momentu umieszczenia papieru filtracyjnego w arenie). Wiedza o tym, kiedy skupić się na zachowaniu myszy, ułatwia dokładne określenie całkowitego czasu poświęconego na eksplorację podczas późniejszej analizy.
2. Przeanalizuj film. Zanotuj czas, w którym mysz po raz pierwszy bada papier filtracyjny (latencja).
3. Za pomocą stopera zmierz czas wszystkich interakcji w ciągu trzech minut od umieszczenia papieru filtracyjnego w arenie. Czas badania definiuje się jako każdy moment, w którym nozdrza myszy znajdują się w odległości < 1 mm od papieru filtracyjnego. Ważne jest, aby nie wliczać czasu, w którym mysz znajduje się w bliskim sąsiedztwie papieru filtracyjnego, ale nie bada go aktywnie. Do całkowitego czasu eksploracji nie należy wliczać epizodów gryzienia i lizania papieru ani siedzenia na nim. Niezbędne jest ścisłe i konsekwentne przestrzeganie tych zasad, aby rzetelnie przeanalizować zachowanie węchowe.
4. Zapisz czas latencji, całkowity czas badania papieru filtracyjnego oraz numer pliku wideo.

Dyskusja

Wymienione testy pozwalają na szybką i wiarygodną ocenę podstawowej funkcji węchowej. Należy jednak pamiętać, że wiarygodność ta wymaga właściwego doboru i przygotowania osobników do badań. Zwierzęta chore lub w inny sposób upośledzone często wykazują niespójne wyniki. Kluczowe jest również habituowanie badanych osobników. Stwierdzono, że wykorzystanie wielu klatek podczas procesu habituacji pozwala zwierzętom oswoić się z obsługą przez eksperymentatora oraz zmianą otoczenia. Zauważono również, że czas krótszy niż wskaza...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas 2-metylomasłowy	Odczynnik	Sigma-Aldrich	W269506	Stosowane stężenia:9,16 x 10-1 – 10-8 M (w H20)
Naturalny ekstrakt z wanilii	Odczynnik	McCormick & Co.	n/d	Stosowane stężenia:rozcieńczenie 10-1 – 10-5 (w H20)
Masło orzechowe (Skippy, Extra Crunchy)	Odczynnik	Unilever	n/d	Stosowane stężenia:10% (w/v), w oleju mineralnym
Ekstrakt z cynamonu	Odczynnik	McCormick & Co.	n/d	Stosowane stężenia:rozcieńczenie 10-1 – 10-5 (w H20)
Olej mineralny, lekki	Odczynnik	Fisher Scientific	O121-1	Stosowane stężenia:n/d