Badanie zachowań węchowych u dorosłych myszy

Podsumowanie

Fundamentalne, a zarazem unikalne właściwości układu węchowego gryzoni sprawiły, że staje się on coraz częściej przedmiotem badań biologów. Istnieje zatem potrzeba opracowania stosunkowo prostego sposobu oceny jego funkcji. W niniejszej pracy opisujemy czułe testy służące do charakterystyki wrażliwości i preferencji węchowych myszy.

Streszczenie

Gryzoniowy system węchowy budzi coraz większe zainteresowanie naukowców i jest badany m.in. w ramach biologii systemowej ze względu na swoje stereotypowe, a jednocześnie przystępne obwody neuronalne. Ponadto wyjątkowa zdolność tego obszaru do generowania nowych neuronów przez całe życie organizmu sprawia, że jest on atrakcyjnym systemem zarówno dla biologów rozwoju, jak i regeneracyjnych. Takie zainteresowanie stwarza potrzebę znalezienia sposobu na szybką, a zarazem wiarygodną ocenę funkcji węchowych. Wiele testów zdolności węchowych jest złożonych, zmiennych lub nie została zaprojektowana specjalnie dla myszy. Ponadto niektóre testy są wrażliwe nie tylko na wady zdolności węchowych, ale również na deficyty pamięci, co utrudnia interpretację uzyskanych wyników.

W niniejszej pracy opisujemy prosty zestaw testów zaprojektowany w celu zidentyfikowania deficytów w czułości i preferencjach węchowych. Po pierwsze, wstępna ocena ogólnego stanu zdrowia pozwala na wyłonienie zwierząt odpowiednich do dalszych badań. Po drugie, myszy są poddawane działaniu różnych rozcieńczeń zapachów, aby ustalić, czy występuje różnica w progu detekcji. Po trzecie, myszom prezentuje się różne zapachy, zarówno atrakcyjne, jak i awersyjne, co pozwala na ocenę preferencji węchowych. Te proste badania powinny sprawić, że wstępna charakterystyka zachowań węchowych stanie się dostępna dla laboratoriów o różnym stopniu wyposażenia i doświadczenia.

Protokół

Ogólne badanie stanu zdrowia

Bardziej szczegółowe omówienie ogólnych badań stanu zdrowia można znaleźć w doskonałym opracowaniu dotyczącym fenotypowania behawioralnego autorstwa Jacqueline Crawley pt. What’s Wrong with my Mouse? ¹. W pierwszej kolejności stosujemy zmodyfikowany zestaw testów obserwacyjnych w celu oceny ogólnego stanu zdrowia badanego osobnika. Zestaw ten obejmuje elementy kompleksowego protokołu oceny opracowanego przez Samuela Irwina², co pozwala na szybką identyfikację osobników nieprzydatnych do dalszych badań. W skrócie, zmodyfikowany zestaw pozwala zidentyfikować zwierzęta z wadami fizycznymi (np. z silną niedowagą lub nadwagą, z zaniedbaną sierścią, z dusznością) lub wykazujące nieprawidłową postawę, lokomocję bądź zachowania. Wszystkie te objawy mogą świadczyć o chorobie. Właściwa będzie każda wstępna ocena, która w podobny sposób pozwala zidentyfikować osobniki niezdrowe.

Należy również zauważyć, że zwierzęta są traktowane humanitarnie zarówno podczas ogólnego badania stanu zdrowia, jak i podczas następnych testów. Nie stosuje się znieczulenia ani leków przeciwbólowych, ponieważ testy te nie obejmują żadnych potencjalnie bolesnych procedur.

Badanie czułości węchu

Ten test został zaprojektowany w celu wykrycia różnic w czułości węchowej pomiędzy dwiema grupami myszy (np. grupą zwierząt typu dzikiego i grupą mutantów). W teście przygotowuje się wiele rozcieńczeń zapachu. Następnie naiwne zwierzę bada pojedyncze rozcieńczenie tego zapachu, a całkowity czas eksploracji (w ciągu 3 minut) zostaje zarejestrowany. Wiele rozcieńczeń zapachu jest testowanych na różnych, naiwnych osobnikach, a całkowity czas eksploracji służy do wygenerowania krzywych zależności dawka-odpowiedź dla każdej grupy myszy. W testowaniu powinny uczestniczyć dwie osoby, z czego jedna nie powinna znać genotypów i/lub stanu badanych osobników.

Główny badacz

1. Przygotuj cztery czyste klatki (8 H x 10 W x 18 L, w calach), wszystkie bez ściółki. Ustaw cztery klatki w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
2. Ustaw przegrody między poszczególnymi arenami, używając nieprzezroczystego papieru filtracyjnego. Umieść czarną płytę z brystolu na ostatniej przegrodzie w taki sposób, aby czarna strona wyścielała bok i dno klatki. Przykryj górę areny przezroczystą płytą z pleksiglasu, aby umożliwić oświetlenie areny.
   (a) (b)
   Rycina 1. Konfiguracja areny. (a) Odpowiednio wyłożona, pusta arena (b) Arena z badanym zwierzęciem i zapachowym papierem filtracyjnym.


3. Rozpocznij habituację zwierząt. Umieść pierwsze zwierzę w pierwszej klatce w celu habituacji. Po 15 minutach przenieś pierwsze zwierzę do drugiej klatki. Oczyść pierwszą klatkę preparatem Quatricide TB. Następnie umieść drugie zwierzę w pierwszej, oczyszczonej klatce. Kontynuuj ten proces z kolejnymi zwierzętami. Ostatecznie każde zwierzę powinno przejść habituację we wszystkich trzech klatkach przed umieszczeniem w arenie (czwartej i ostatniej klatce) na kolejne 15 minut habituacji przed testem.

Badacz zaślepiony

1. Przygotuj odpowiednią liczbę kwadratów papieru filtracyjnego o wymiarach 2 cal x 2 cale dla próbek zapachowych.
2. Właściwie rozcieńcz wcześniej wybrany zapach. W przypadku próbek hydrofobowych, takich jak masło orzechowe, jako rozpuszczalnika należy użyć oleju; dla pozostałych próbek należy użyć wody destylowanej. Wymieszaj w wortexie.
3. Ustaw cyfrowe urządzenie do nagrywania wideo na dalekim końcu komory bezpieczeństwa biologicznego w taki sposób, aby cały koniec klatki znajdował się w polu ostrości. Nagraj film próbny, aby upewnić się, że parametry są odpowiednie.
4. Zapisz kolejność, w jakiej będą testowane rozcieńczenia, dbając o randomizację kolejności prób.
5. Zapisz numery lęgu i identyfikacyjne badanych osobników.
6. Po 15-minutowej habituacji osobnika w arenie, rozpocznij przygotowania do pierwszej próby. Pipetuj pierwsze rozcieńczenie w górę i w dół w probówce stożkowej, a następnie nanieś je na kwadrat papieru filtracyjnego. Powierzchnia papieru filtracyjnego powinna być optymalnie pokryta w ~85% (około 0.50 mls roztworu). Użyj chusteczki Kimwipe, aby upewnić się, że papier filtracyjny nie jest nadmiernie nasycony.
7. Rozpocznij nagrywanie wideo.
8. Umieść kwadrat papieru filtracyjnego w klatce po przeciwnej stronie aktualnego położenia zwierzęcia.
9. Uruchom pomiar czasu.
10. Po 3 minutach zatrzymaj nagrywanie i usuń rozcieńczony zapach.
11. Jeśli testowany jest tylko jeden zapach (np. cynamonu), usuń pierwszego badanego osobnika z areny. Powtórz kroki 6-11 dla każdego zwierzęcia, odpowiednio rozcieńczając zapach dla każdego osobnika. Jeśli jednak testowanych jest więcej niż jeden zapach, nie usuwaj badanego osobnika z areny. Zamiast tego rozpocznij pomiar czasu.
12. Odpowiednio rozcieńcz kolejny zapach, stosując te same metody, które wymieniono powyżej.
13. Po 1 minucie rozpocznij nagrywanie wideo. Umieść kwadrat papieru filtracyjnego z rozcieńczeniem kolejnego zapachu w klatce po przeciwnej stronie aktualnego położenia zwierzęcia.
14. Powtórz kroki 6-13 dla każdego zapachu, odnotowując numer pliku wideo dla każdej próby.
15. Powtórz kroki 6-14 dla każdego osobnika.
    
    Rysunek 2. Reprezentatywne wyniki sesji testowania czułości węchowej. Każda mysz z grupy kontrolnej (Grupa A) lub grupy eksperymentalnej (Grupa B) była eksponowana na jedno z pięciu różnych rozcieńczeń ekstraktu z cynamonu na papierze filtracyjnym podczas jednej, trzyminuotowej sesji. Oceńiono całkowity czas spędzony na eksploracji papieru filtracyjnego. Myszy w Grupie A wykazują większą czułość węchową niż myszy w Grupie B.

Testy preferencji węchowych

Test ten został zaprojektowany w celu zidentyfikowania konkretnych deficytów detekcji, a mianowicie zdolności do wyczuwania zapachów atrakcyjnych lub awersyjnych. Poniższa procedura w znacznym stopniu opiera się na protokole Kobayakawa, K. i wsp.3. Ponownie w badaniu powinny uczestniczyć dwie osoby, z czego jedna powinna nie znać genotypów i/lub stanu badanych osobników. Całkowity czas eksploracji dla różnych zapachów jest ponownie rejestrowany (na podstawie analizy nagrań wideo). Zapachy, dla których całkowity czas eksploracji był dłuższy niż w przypadku wody, określa się jako „atrakcyjne”, natomiast te, dla których czas był krótszy niż dla wody, nazywa się „awersyjnymi”. Badacz analizuje następnie, czy te same zapachy są „atrakcyjne” lub „awersyjne” dla różnych osobników testowych.

Prosimy o wykonanie kroków 1-3 w sekcji Testowania Czułości Węchowej dla głównego badacza.

Zasłonięty badacz

Procedura testowania preferencji węchowych jest taka sama, z niewielkimi modyfikacjami kroków 2 i 4. Należy postępować zgodnie z krokami 1-15 w sekcji Testowania Wrażliwości Węchowej dla badacza prowadzącego próbę ślepą, z następującymi zmianami: w kroku 2, korzystając z wcześniej wybranych zapachów (kombinacji zapachów atrakcyjnych i awersyjnych), należy przygotować w probówkach stożkowych odpowiednio rozcieńczone roztwory każdego z nich. W przypadku próbek hydrofobowych, takich jak masło orzechowe, należy użyć oleju jako rozpuszczalnika; dla wszystkich pozostałych należy użyć wody destylowanej. Wymieszać w wirówce Vortex. W kroku 4, zamiast zapisywać rozcieńczenie do przetestowania, należy zapisać kolejność badanych różnych zapachów, randomizując kolejność prób.

Test ten został zaprojektowany w celu zidentyfikowania konkretnych deficytów detekcji, a mianowicie zdolności do wyczuwania zapachów atrakcyjnych lub awersyjnych. Poniższa procedura w znacznej mierze opiera się na protokole Kobayakawa, K. et al.³. Ponownie w testach powinni uczestniczyć dwaj badacze, z czego jeden nie powinien znać genotypów i/lub stanu badanych osobników. Całkowity czas eksploracji jest ponownie rejestrowany (na podstawie analizy nagrania wideo) dla różnych zapachów. Zapachy, w przypadku których całkowity czas eksploracji jest dłuższy niż dla wody, określa się jako „atrakcyjne”, natomiast te z czasem krótszym niż dla wody nazywa się „awersyjnymi”. Następnie badacz analizuje, czy te same zapachy są „atrakcyjne” lub „awersyjne” dla różnych osobników testowych.

Prosimy o wykonanie kroków 1-3 w sekcji badania wrażliwości węchowej dla głównego badacza.

Badacz zaślepiony

Procedura testowania preferencji węchowych jest taka sama, z niewielkimi modyfikacjami kroków 2, 4 i 13. Należy postępować zgodnie z krokami 1-15 w sekcji Testowania Wrażliwości Węchowej dla badacza prowadzącego próbę ślepą, z następującymi zmianami: w kroku 2, używając wcześniej wybranych zapachów (kombinacji zapachów atrakcyjnych i awersyjnych), przygotować w probówkach stożkowych odpowiednio rozcieńczone roztwory każdego z nich. W przypadku próbek hydrofobowych, takich jak masło orzechowe, jako rozpuszczalnik należy użyć oleju; dla wszystkich pozostałych należy użyć wody destylowanej. Wymieszać w wstrząsarku typu vortex. W kroku 4, zamiast zapisywać rozcieńczenie do przetestowania, należy zapisać kolejność różnych zapachów, które zostaną przebadane, randomizując tę kolejność w każdej próbie. W kroku 13 kwadrat papieru filtracyjnego z kolejnym zapachem należy umieścić w klatce po przeciwnej stronie względem obecnej pozycji zwierzęcia.

Rycina 3. Reprezentatywne wyniki jednej sesji testu preferencji zapachowych. Każda mysz była wystawiona na działanie poszczególnych zapachów naniesionych na papier filtracyjny podczas jednej, trzyminuotowej sesji. Oceńiono całkowity czas spędzony na badaniu papieru filtracyjnego. Masło orzechowe i wanilia są zapachami atrakcyjnymi (czas badania_zapach > czas badania_woda), natomiast kwas 2-metylobutyrylowy jest zapachem awersyjnym (czas badania_zapach < czas badania_woda).

Punktacja testów węchowych

Po zarejestrowaniu wszystkich filmów dotyczących wrażliwości węchowej i preferencji, należy przeanalizować całkowity czas spędzony na eksploracji każdego rozcieńczenia/zapachu. Wszystkie filmy powinny zostać przeanalizowane przez badacza pracującego w ślepej próbie w celu zapewnienia spójności.

1. Przejrzyj nagranie wideo, zwracając uwagę na następujące momenty: a) umieszczenia papieru filtracyjnego w arenie, b) zbliżenia się myszy do papieru filtracyjnego, c) rozpoczęcia badania papieru filtracyjnego przez mysz oraz d) upływu trzech minut (od momentu umieszczenia papieru filtracyjnego w arenie). Wiedza o tym, kiedy skupić się na zachowaniu myszy, ułatwia dokładne określenie całkowitego czasu spędzonego na eksploracji podczas analizy.
2. Przejrzyj nagranie wideo. Odnotuj czas, w którym mysz po raz pierwszy zbadała papier filtracyjny (latencja).
3. Za pomocą stopera zmierz wszystkie okresy badania papieru w ciągu trzech minut od jego umieszczenia w arenie. Czas badania definiuje się jako każdy moment, w którym nozdrza myszy znajdują się w odległości < 1 mm od papieru filtracyjnego. Ważne jest, aby nie wliczać czasu, w którym mysz znajduje się w bliskim sąsiedztwie papieru filtracyjnego, ale nie bada go aktywnie. W całkowitym czasie eksploracji nie należy uwzględniać epizodów gryzienia i lizania papieru ani epizodów siedzenia na papierze. Niezbędne jest ścisłe i konsekwentne przestrzeganie tych zasad, aby rzetelnie przeanalizować zachowanie węchowe.
4. Zapisz czas latencji, całkowity czas spędzony na badaniu papieru filtracyjnego oraz numer pliku wideo.

Dyskusja

Wymienione testy pozwalają na szybką i wiarygodną ocenę podstawowej funkcji węchowej. Należy jednak pamiętać, że wiarygodność ta wymaga właściwego doboru i przygotowania osobników do badań. Zwierzęta chore lub w inny sposób upośledzone często wykazują niespójne wyniki. Kluczowe jest również habituowanie badanych osobników. Stwierdzono, że wykorzystanie wielu klatek podczas procesu habituacji pozwala zwierzętom oswoić się z obsługą przez eksperymentatora oraz zmianą otoczenia. Zauważono również, że czas krótszy niż wskaza...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Kwas 2-metylomasłowy	Odczynnik	Sigma-Aldrich	W269506	Stosowane stężenia:9,16 x 10-1 – 10-8 M (w H20)
Naturalny ekstrakt z wanilii	Odczynnik	McCormick & Co.	n/d	Stosowane stężenia:rozcieńczenie 10-1 – 10-5 (w H20)
Masło orzechowe (Skippy, Extra Crunchy)	Odczynnik	Unilever	n/d	Stosowane stężenia:10% (w/v), w oleju mineralnym
Ekstrakt z cynamonu	Odczynnik	McCormick & Co.	n/d	Stosowane stężenia:rozcieńczenie 10-1 – 10-5 (w H20)
Olej mineralny, lekki	Odczynnik	Fisher Scientific	O121-1	Stosowane stężenia:n/d