Technika pozyskiwania i pomiaru mediatorów biochemicznych w ranie chirurgicznej w określonych punktach czasowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Pozyskiwanie i pomiar mediatorów nocyceptywnych i zapalnych w ranach pooperacyjnych
W tym artykule
Retraction Notice
This article has been retracted at the request of the authors due to duplication of text in J Pain (Carvalho B, Clark DJ, Angst MS (2008) Local and Systemic Release of Cytokines, Nerve Growth Factor, Prostaglandin E2, and Substance P in Incisional Wounds and Serum Following Cesarean Delivery. J Pain 9: 650-657.) due to an honest mistake of the authors. View Retraction Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Opisujemy metodologię, która pozwala na pobieranie i pomiar zapalnych i nocyceptywnych mediatorów biochemicznych w miejscu rany pooperacyjnej. Pobieranie specyficznych dla miejsca markerów biochemicznych umożliwia nam ocenę zależności między stężeniami w ranie pooperacyjnej a poziomami w surowicy; określenie wszelkich powiązań między uwalnianiem mediatorów, bólem a spożyciem leków przeciwbólowych; oraz ocenę wpływu systemicznego i obwodowego podawania leków na biochemię rany pooperacyjnej.
Niniejszą metodologię zastosowano u zdrowych kobiet poddawanych planowemu cięciu cesarskiemu w znieczuleniu spinalnym. Przesącz z rany oraz mediatory surowicze, wraz z ocenami bólu i zużyciem leków przeciwbólowych, mierzono w 1, 6, 24 i 48 godzinach po cięciu cesarskim. Wykryte mediatory biochemiczne obejmowały IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-17, TNFα, INFγ, G-CSF, GM-CSF, MCP-1 i MIP-1β, czynnik wzrostu nerwów (NGF), prostaglandynę E2 (PG-E2) oraz substancję P. Nie stwierdzono korelacji między stężeniami cytokin w ranie i surowicy ani między ich profilami czasowego uwalniania (J Pain. 2008 Jul 9(7):650-7). Niniejszy artykuł opisuje i demonstruje wykonalność pobierania oraz analizy mediatorów nocyceptywnych i zapalnych w ranach chirurgicznych w określonych punktach czasowych. Brak istotnych korelacji między poziomami w surowicy i ranie wskazuje na znaczenie określania uwalniania specyficznego dla danego miejsca w przypadku badania ran chirurgicznych i lokalnych patologii.
Protokół
Zbiór mediatorów biochemicznych nocyceptywnych i zapalnych
- System do uśmierzania bólu On-Q® PainBuster® jest wprowadzany w warstwę podskórną przez zespół chirurgiczny bezpośrednio przed zamknięciem rany. System ten stale podaje sól fizjologiczną (lub anestetyk miejscowy) podskórnie do rany z prędkością 2 ml/h.
- W systemie zamontowano kurek trójdrożny, aby umożliwić aspirację wysięku z rany w określonych punktach czasowych.
- W punktach czasowych określonych przez protokół (np. 1, 6, 24 i 48 godzin po cięciu cesarskim) pobiera się 1 ml wysięku z rany do kubka polietylenowego zawierającego 30 μl inhibitora proteaz.
- W tych samych odstępach czasu pobiera się 10 ml krwi do probówki do pobierania krwi z zielonym korkiem zawierającej heparynę litową. Następnie do próbek krwi dodaje się 300 μl inhibitora proteaz.
- W ciągu 1 godziny od pobrania próbki są umieszczane na lodzie, a następnie wirowane przy 3000 rpm przez 10 min.
- Surowicę oraz nadsącz z rany należy oddzielić, przenieść do standardowej probówki do mikrocentryfugi i przechowywać w temperaturze -20°C.
Analiza testu
- Po zebraniu wszystkich próbek są one rozmrażane i analizowane jednocześnie.
- Następnie poziom cytokin mierzy się za pomocą płytki do wielomodułowego testu immunochemicznego typu bead array (17-multiplex). Technologia wielomodułowych testów immunoologicznych umożliwia analizę do 100 analitów w próbkach płynów ustrojowych o objętości zaledwie 50 μl, dając wyniki porównywalne z wynikami uzyskanymi za pomocą metody ELISA. Płytka ta pozwala na oznaczenie interleukiny 1ß (IL-1ß), interleukiny 2 (IL-2), interleukiny 4 (IL-4), interleukiny 5 (IL-5), interleukiny 6 (IL-6), interleukiny 7 (IL-7), interleukiny 8 (IL-8), interleukiny (IL-10), interleukiny 12 (IL-12), interleukiny 13 (IL-13), interleukiny 17 (IL-17), czynnika martwicy nowotworów α (TNFα), interferonu α (INFα), czynnika stymulującego wzrost kolonii granulocytów (G-CSF), czynnika stymulującego wzrost kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), białka chemoatraktanta monocytów 1 (MCP-1) oraz białka zapalnego makrofagów 1 (MIP-1β).
- Czynnik wzrostu nerwów mierzy się za pomocą przeciwciała NGF DY256, dodając go do płytki 17-plex przy użyciu zestawu do sprzęgania amin Bio-Plex.
- Każdy pomiar wykonuje się w dubletach zgodnie ze specyfikacją producenta. Krzywe wzorcowe dla każdego analitu generuje się przy użyciu dostarczonych przez producentów analitów referencyjnych w stężeniach 0.20, 0.78, 3.13, 12.5, 50, 200, 800, 3200 pg/ml oraz wzorca zerowego (sama sól fizjologiczna). Krzywe wzorcowe są uwzględniane w każdym przebiegu, a stężenia próbek obliczano za pomocą oprogramowania Bio-Plex Manager.
- Prostaglandynę E2 i substancję P mierzy się za pomocą wysokoczułych zestawów ELISA. Każdy test wykonuje się w dubletach zgodnie ze specyfikacją producenta.
Rycina 1: Poziomy w wysięku i surowicy różnych cytokin prozapalnych i przeciwzapalnych (interleukiny 1ß (IL-1ß), interleukiny 2 (IL-2), interleukiny 4 (IL-4), interleukiny 5 (IL-5), interleukiny 6 (IL-6), interleukiny 7 (IL-7), interleukiny 8 (IL-8), interleukiny (IL-10), interleukiny 12 (IL-12), interleukiny 13 (IL-13), interleukiny 17 (IL-17), czynnika martwicy nowotworów α (TNF-α), interferonu γ (INFγ), czynnika stymulującego wzrost kolonii granulocytów (G-CSF), czynnika stymulującego wzrost kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF), białka chemoatraktanta monocytów 1 (MCP-1) i białka zapalnego makrofagów 1 (MIP-1ß), poziomy czynnika wzrostu nerwów (NGF), prostaglandyny E2 (PG-E2) i substancji P (SP) (pg/mL) zmierzone w punkcie wyjścia oraz 6 i 24 godziny po cesarskim cięciu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
System przeciwbólowy On-Q® PainBuster® należy wprowadzić wzdłuż całego nacięcia w warstwę podskórną bezpośrednio przed zamknięciem rany. Ułatwia to aspirację za pomocą kurka trójdrożnego w określonych odstępach czasu. System On-Q® stale podaje sól fizjologiczną podskórnie do rany z prędkością 2 ml/h. Zapobiega to zakrzepom w cewniku i zwiększa niezawodność systemu w pobieraniu próbek wysięku. Jeśli aspiracja wysięku jest utrudniona (około 5% przypadków), należy rozważyć zmianę pozycji pacjenta (np. posadzenie go lub poło...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
Praca dr Carvalho jest wspierana przez grant badawczy Building Interdisciplinary Careers in Women's Health przyznany przez Office of Research on Women's Health oraz National Institute of Child Health and Human Development w ramach National Institutes of Health (5K12 HD043452). Dr Angst otrzymał materiały (system łagodzenia bólu pooperacyjnego On-Q® PainBuster®) oraz fundusze na przeprowadzenie analiz biochemicznych od firmy I-Flow (Lake Forest, CA).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| System do łagodzenia bólu pooperacyjnego On-Q® PainBuster® | I-Flow, Lake Forest, CA | ||
| Kompletny inhibitor proteinaz | Roche Group | ||
| Płyta do 17-multipleksowego immunoanalizy koralikowej Bio-PlexTM | Bio-Rad | ||
| Zestaw do sprzęgania aminowego Bio-Plex | Bio-Rad | ||
| Przeciwciało anty-NGF DY256 | R&D Systems | ||
| Zestawy ELISA do oznaczania prostaglandyny E2 i substancji P | Assay Designs |
Bibliografia
- Elshal, M. F., McCoy, J. P. Multiplex bead array assays: performance evaluation and comparison of sensitivity to ELISA. Methods. 38, 317-323 (2006).
- Heijmans-Antonissen, C., Wesseldijk, F., Munnikes, R. J., Huygen, F. J., van der Meijden, P., Hop, W. C., Hooijkaas, H., Zijlstra, F. J. Multiplex bead array assay for detection of 25 soluble cytokines in blister fluid of patients with complex regional pain syndrome type 1. Mediators Inflamm.. 28398, 1-8 (2006).
- Buvanendran, A., Kroin, J. S., Berger, R. A., Hallab, N. J., Saha, C., Negrescu, C., Moric, M., Caicedo, M. S., Tuman, K. J. Upregulation of prostaglandin E2 and interleukins in the central nervous system and peripheral tissue during and after surgery in humans. Anesthesiology. 104, 403-410 (2000).
- Holzheimer, R. G., Steinmetz, W. Local and systemic concentrations of pro- and anti-inflammatory cytokines in human wounds. Eur J Med Res. 5, 347-355 (2000).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.