Analiza węgla i azotu w próbkach środowiskowych
Źródło: Laboratoria Margaret Workman i Kimberly Frye - Depaul University
Analiza elementarna to metoda stosowana do określania składu pierwiastkowego…
1. Przygotowanie próbek gleby
- Suche próbki gleby w temperaturze 60 °C przez 48 h.
- Przełóż glebę przez sito o wymiarach 2 mm x 2 mm.
- Do młynka kulowego wsypujemy około 5 g ziemi i mielimy przez 2 minuty. Ważne jest, aby uzyskać jednorodną próbkę, ponieważ wielkość próbki będzie bardzo mała.
- Zmieloną ziemię włożyć do małego pojemnika i przechowywać w eksykatorze, aż będzie gotowa do użycia.
2. Ustawianie parametrów instrumentu
- Włącz instrument Flash EA 1112 z tyłu, przesuwając przełącznik w górę.
- Włącz komputer.
- Kliknij dwukrotnie ikonę "Eager 300", aby uruchomić oprogramowanie, które uruchamia instrument.
- Kliknij dwukrotnie ikonę "NC Soils", aby otworzyć metodę, która uruchamia konfigurację przyrządu dla gleb.
- Rozgrzej instrument, otwierając "Edytuj parametry analizatora elementarnego" i klikając przycisk "Wyślij". Parametry powinny być następujące (Patrz Rysunki 1–3):
a. Temperatury: Lewo = 900 °C, Prawo = 680 °C, Piekarnik = 50 °C
b. Przepływ gazu: Nośnik = 130 ml/min, Tlen = 250 mL/min, Odniesienie = 100 mL/min
c. Czas pracy cyklu = 360 s
d. Opóźnienie próbkowania = 12 s
e. Koniec wtrysku tlenu = 5 s
f. Detektor = Filament włączony - Utwórz przykładową tabelę, klikając "Edytuj przykładową tabelę", a następnie "Wypełnij przykładową tabelę". Zmień nazwę pliku na dzisiejszą datę. Wprowadź liczbę próbek, które planujesz uruchomić, w tym wzorce i ślepe próby. Następnie kliknij "Zamień", aby zastąpić ostatnią utworzoną tabelę próbną nową tabelą próbki.
3. Tworzenie krzywej standardowej
- Za pomocą kleszczy wyjmij jeden blaszany krążek z opakowania i uformuj go w kształt kubka za pomocą specjalnego urządzenia uszczelniającego. Unikaj dotykania blaszanego krążka palcami, aby uniknąć przenoszenia olejków z opuszków palców. (Patrz Rysunki 4–5)
- Za pomocą kleszczy umieść blaszany krążek na mikrowadze i wyzeruj wagę.
- Za pomocą kleszczy wyjmij krążek cynowy z mikrowagi i za pomocą mikroszpatułki umieść około 1 mg wzorca kwasu asparaginowego w krążku cyny.
- Zważyć krążek cynowy z wzorcem kwasu asparaginowego na mikrowadze. Wprowadź tę wagę do tabeli danych w oprogramowaniu Eager 300 na komputerze.
- Uszczelnij blaszany krążek kleszczami, aby żaden wzorzec kwasu asparaginowego nie wylał się z niego. Umieść blaszane opakowanie w automatycznym podajniku próbników. (Patrz Rysunek 6)
- Powtórz kroki 3.1 – 3.5, używając około 5 mg wzorca kwasu asparaginowego.
- Powtórz kroki 3.1 – 3.5, używając około 7,5 mg wzorca kwasu asparaginowego.
- Powtórz kroki 3.1 – 3.5, używając około 10 mg wzorca kwasu asparaginowego.
4. Załadunek do automatycznego podajnika próbek gleby
- Za pomocą kleszczy wyjmij jeden blaszany krążek z opakowania i uformuj go w kształt kubka za pomocą urządzenia uszczelniającego. Nie należy dotykać puszki palcami, aby uniknąć przenoszenia olejków z opuszków palców.
- Za pomocą kleszczy umieść blaszany krążek na mikrowadze i wyzeruj wagę.
- Wyjąć blaszany krążek z mikrowagi i umieścić około 50 mg homogenizowanej gleby w blaszanym krążku za pomocą mikroszpatułki.
- Zważyć blaszany krążek z próbką gleby na mikrowadze. Wprowadź tę wagę do tabeli danych w oprogramowaniu Eager 300 na komputerze.
- Uszczelnij blaszany krążek za pomocą kleszczy, aby gleba była zawarta. Przenieś blaszane opakowanie do tacy automatycznego podajnika próbników.
- Powtórz kroki 4.1 – 4.5 dla wszystkich próbek. Zaleca się przeprowadzenie trzech prób dla każdej próbki. Eksperyment z trzema egzemplarzami jest uważany za dobrą praktyczną zasadę, która pozwala wykluczyć błędy eksperymentalne.
5. Uruchamianie próbek
- Gdy na instrumencie zostaną osiągnięte odpowiednie temperatury, zaświeci się zielona kontrolka "Temperature Ready". U dołu ekranu komputera pojawi się również komunikat "Gotowy do analizy".
- Przed rozpoczęciem przykładowego przebiegu kliknij "Plik" i "Zapisz metodę", aby zapisać dane, które właśnie wprowadziłeś. Zaleca się zapisanie metody wraz ze swoim nazwiskiem i datą.
- Aby rozpocząć bieg, kliknij zieloną strzałkę i naciśnij "Rozpocznij teraz".
- Uruchomienie próbki zajmie około 6 minut.
- Po zakończeniu przebiegu możesz zobaczyć wyniki, klikając "Przeliczenie", a następnie "Podsumuj wyniki".
Rysunek 1. Ekran konfiguracji parametrów Flash EA 1112 1.
Rysunek 2. Ekran konfiguracji parametrów Flash EA 1112 2.
Rysunek 3. Ekran konfiguracji parametrów Flash EA 1112 3.
Rysunek 4. Wyjmowanie blaszanego krążka za pomocą kleszczy.
Rysunek 5. Blaszany krążek uformowany w kształt miseczki za pomocą urządzenia uszczelniającego.
Rysunek 6. Opakowanie cynowe umieszczane w podajniku próbek automatycznych.
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Analiza ilości węgla i azotu w próbkach środowiskowych - proces znany jako "analiza elementarna" - dostarcza ważnych informacji na temat ekologicznych właściwości środowiska.
Węgiel i azot to dwa najważniejsze pierwiastki potrzebne do życia. Węgiel jest podstawą związków organicznych, które stanowią podstawę wszystkich żywych istot i jest szczególnie przydatny jako miara dla cząsteczek takich jak węglowodany, podstawowe źródło energii dla organizmów. Z drugiej strony azot znajduje się w cząsteczkach takich jak nukleiny i aminokwasy. Służą one odpowiednio jako materiał genetyczny i jako elementy budulcowe białek wykorzystywanych przez organizmy do budowy i funkcji.
Ponieważ te różne klasy cząsteczek organicznych mają różne role biologiczne, organizmy potrzebują ich w różnych ilościach. Na przykład mikroorganizmy w glebie zazwyczaj wymagają źródeł pożywienia o stosunku C:N wynoszącym 24:1. Ponieważ różne resztki roślinne mają różne proporcje C:N, które wahają się od 13:1, takich jak lucerna, do 57:1, jak w przypadku kukurydzy, będą one rozkładane przez drobnoustroje w różnym tempie i w różnym stopniu, co z kolei wpłynie na sposób powrotu składników odżywczych do gleby.
W tym filmie przedstawimy zasady analizy składu pierwiastkowego węgla i azotu; protokół przeprowadzania analizy pierwiastkowej na próbkach gleby; I wreszcie niektóre zastosowania tej metody analizy w badaniach środowiskowych.
Analizę pierwiastkową można przeprowadzić na wiele sposobów, takich jak wykorzystanie określonych reakcji chemicznych, często z udziałem mocnych kwasów, w wyniku których powstają charakterystyczne produkty, które można wykryć. Dużym ulepszeniem metodologii analizy elementarnej było opracowanie techniki błyskawicznego spalania, która wyeliminowała konieczność stosowania niebezpiecznych substancji chemicznych, znacznie uprościła i przyspieszyła proces oraz pozwoliła na automatyzację.
Podstawą analizy elementarnej opartej na spalaniu błyskawicznym jest utlenienie próbki w "komorze utleniającej" poprzez spalenie jej w obecności tlenu w wysokich temperaturach około 1000 ? C w obecności katalizatora, który przyspiesza reakcję. W ten sposób węgiel w próbce zamienia się w gazowy dwutlenek węgla, a azot w tlenek azotu i gazowy azot. Obojętny "gaz nośny", taki jak hel, jest następnie używany do transportu tych produktów spalania do "komory redukcyjnej" z wypełnieniem miedzianym, gdzie tlenki azotu są dalej przekształcane w gazowy azot. Nadmiar pary wodnej jest usuwany z mieszaniny gazów przez filtrację za pomocą środka osuszającego, takiego jak nadchloran magnezu.
Produkty spalania błyskawicznego można następnie oddzielić za pomocą chromatografii gazowej, podczas której cząsteczki gazu przechodzą przez rurki, zwane kolumną, zawierające cienką powłokę cieczy lub polimeru. Gazy wielokrotnie rozpuszczają się i odparowują z tego substratu, gdy przechodzą przez kolumnę, z szybkością zależną od tego, jak silnie cząsteczki oddziałują z substratem i gazem nośnym. Gatunek, który spędza więcej czasu rozpuszczony w podłożu, będzie przemieszczał się wolniej przez kolumnę, umożliwiając w ten sposób różnicowanie gazów.
Po opuszczeniu kolumny gazy można zidentyfikować, na przykład poprzez wykrycie, jak dobrze przewodzą ciepło, co jest właściwością znaną jako przewodność cieplna. Kreśląc czas potrzebny każdemu gazowi na przejście przez cewkę, naukowcy uzyskują "chromatogram" z pikami, które reprezentują każdy gaz. Obliczając wykryte ilości dwutlenku węgla i azotu gazowego przy użyciu obszaru pod odpowiednimi pikami, można następnie wywnioskować stosunek C:N w pierwotnej próbce.
Teraz, gdy rozumiesz zasady analizy pierwiastkowej węgla i azotu przy użyciu metody spalania błyskawicznego, przejdźmy do protokołu wykonywania tego za pomocą automatycznego analizatora elementarnego.
Aby przygotować próbki gleby do analizy, najpierw wysusz próbki w 60 ? C piekarnik przez 48 godzin. Następnie przepuść wysuszoną ziemię przez sito 2 x 2 mm i wyrzuć wszelkie cząstki gleby, które nie przejdą. Następnie za pomocą młynka kulowego zmielić około 5 g gleby przez 2 minuty, aby uzyskać jednorodny proszek. Umieść zmieloną ziemię w małym pojemniku, takim jak fiolka z polietylenu, i przechowuj ją w eksykatorze, aż będzie gotowa do użycia.
Ustaw parametry analizy w analizatorze elementarnym zgodnie z instrukcjami producenta. Należą do nich temperatury pieca utleniającego, pieca redukcyjnego i pieca do chromatografii gazowej, natężenie przepływu gazu nośnego, szybkość wtrysku tlenu, natężenie przepływu gazu odniesienia, czas trwania cyklu, opóźnienie między upuszczeniem próbki a wstrzyknięciem tlenu do komory utleniającej oraz czas wtrysku tlenu.
Aby ilościowo określić skład próbki, najpierw tworzy się krzywą wzorcową przy użyciu różnych ilości związku o znanym składzie, takiego jak kwas asparaginowy.
Aby to zrobić, najpierw użyj kleszczyków, aby wyjąć z opakowania cynowy krążek do przechowywania próbki i uformować go w kształt kubka za pomocą specjalistycznego urządzenia uszczelniającego. Unikaj dotykania blaszanego krążka palcami, ponieważ może to doprowadzić do przeniesienia olejów na krążek.
Teraz umieść blaszany kubek na mikrowadze i ustaw tarę. Wyjmij blaszany kubek, a następnie za pomocą mikroszpatułki umieść w nim około 1 mg wzorca kwasu asparaginowego. Zważ filiżankę i zapisz masę. Następnie uszczelnij blaszany kubek i umieść go w automatycznym podajniku próbek, który automatycznie dostarczy każdą próbkę do komory reakcyjnej.
Powtórz powyższe kroki dla kilku ilości wzorca. Następnie umieść wszystkie wzorce w podajniku próbek.
Dozować i ważyć próbki gleby w blaszanych kubkach podobnie jak wzorce, używając około 50 mg każdej homogenizowanej próbki gleby. Przygotować każdą próbkę w trzech egzemplarzach.
Po umieszczeniu wszystkich próbek w automatycznym podajniku próbek i osiągnięciu odpowiednich temperatur w urządzeniu, należy uruchomić pomiary. Oprogramowanie przyrządu wygeneruje chromatogram dla każdego wzorca i próbki.
W zależności od zastosowanych parametrów, pik dla azotu gazowego powinien przypadać na około 110 s na chromatogramie, natomiast pik dwutlenku węgla jest wykrywany na około 190 s. Krzywe standardowe są generowane przy użyciu kwasu asparaginowego, którego stosunek węgla do azotu wynosi 4 do 1. Dzięki tej wiedzy, wraz ze stężeniem każdego wzorca, powierzchnia pod każdym pikiem może być wykorzystana do obliczenia ilości azotu i węgla w każdej próbce.
Na podstawie masy pierwotnej próbki można obliczyć procentową zawartość azotu i procentową zawartość węgla w każdej próbce. W tej demonstracji stwierdzono, że stosunek C:N w tej próbce gleby wynosi około 13:1, czyli jest niższy niż stosunek 14,25:1 zwykle spotykany dla gleby pod otwartymi terenami leśnymi i wskazujący na lasy zdominowane przez inwazyjne drzewa kruszyny.
Analiza zawartości węgla i azotu może być stosowana nie tylko do gleby, ale także do różnych próbek środowiskowych i ma szerokie zastosowanie w badaniach środowiskowych.
W tym przykładzie naukowcy pobrali próbki wody z różnych siedlisk morskich, takich jak rafy koralowe. Aby zrozumieć dostępność organicznych składników odżywczych dla morskich społeczności mikroorganizmów, zmierzono różne parametry chemiczne, w tym analizę pierwiastków węgla i azotu. Poziomy rozpuszczonego węgla organicznego mierzono bezpośrednio z próbki wody, podczas gdy cząstki organiczne filtrowano z wody i analizowano.
Analiza elementarna może być również wykorzystywana do monitorowania utraty składników odżywczych w odpływie z nawadniania krajobrazów miejskich i trawników, co może zanieczyszczać zasoby wodne. Naukowcy stworzyli tu poletka testowe, aby symulować krajobrazy miejskie i lepiej zrozumieć ten proces. Do analizy określonych składników odżywczych, takich jak azotany i amoniak, w zebranym odpływie zastosowano różnorodne testy chemiczne, a do pomiaru poziomów rozpuszczonego węgla organicznego i azotu zastosowano analizę pierwiastkową opartą na spalaniu.
Wreszcie, analiza stosunku C:N w tuszach roślinożerców ujawniła interesujący związek między ryzykiem drapieżnictwa a tempem rozkładu w glebie. W tym badaniu koniki polne były hodowane z ryzykiem drapieżnictwa ze strony pająków lub bez niego. Zwłoki tych koników polnych pozwolono następnie rozłożyć na poletkach glebowych, a szczątki roślinne zostały później dodane do gleby w celu rozkładu.
Analiza elementarna wykazała nieznacznie zwiększony stosunek C:N u koników polnych hodowanych z ryzykiem drapieżnictwa, ale to z kolei doprowadziło do znacznego zmniejszenia tempa rozkładu w glebie, w której konik polny uległ rozkładowi, wskazując na nieoczekiwaną złożoną dynamikę obiegu składników odżywczych w ekosystemie.
Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat analizy węgla i azotu w próbkach środowiska. Powinieneś teraz zrozumieć zasady stojące za tą metodą analizy; jak to zrobić za pomocą analizatora pierwiastków spalania błyskawicznego; i niektóre z jego zastosowań w naukach o środowisku. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why are carbon and nitrogen important elements to measure in environmental samples?
Carbon and nitrogen are essential for life and indicate ecological properties of environments. Carbon forms organic compounds and carbohydrates that provide energy to organisms, while nitrogen comprises nucleic acids and amino acids that serve as genetic material and protein building blocks. Measuring their amounts reveals nutrient availability and decomposition dynamics in soil and other environmental systems.
Q2: How does the C:N ratio affect decomposition rates in soil?
Different organisms require specific C:N ratios for optimal decomposition. Microorganisms in soil typically need a 24:1 ratio, but plant residues vary widely—alfalfa has 13:1 while corn has 57:1. These different ratios cause microbes to decompose plant materials at different rates and extents, directly affecting how nutrients are recycled and returned to the soil ecosystem.
Q3: What is the flash combustion technique and why is it preferred for elemental analysis?
Flash combustion oxidizes samples by burning them at approximately 1,000°C in the presence of oxygen and a catalyst. This converts carbon to carbon dioxide and nitrogen to nitrogen oxides and gases. Unlike older methods using dangerous chemicals, flash combustion eliminates toxic reagents, simplifies the process, speeds up analysis, and enables automation, making it safer and more efficient for environmental research.
Q4: How does gas chromatography separate combustion products in elemental analysis?
Gas chromatography separates gases by passing them through a column coated with liquid or polymer substrate. Gases dissolve and vaporize at different rates depending on their molecular interactions with the substrate and carrier gas. Species that interact more strongly spend longer dissolved in the substrate, traveling more slowly through the column, allowing differentiation and identification of carbon dioxide and nitrogen gases.
Q5: What preparation steps are necessary before analyzing soil samples for carbon and nitrogen?
Soil samples must be dried in a 60°C oven for 48 hours, then passed through a 2 x 2-mm sieve to remove large particles. Approximately 5 grams of dried soil is ground for 2 minutes using a ball mill grinder to create a homogeneous powder. The milled soil is stored in a polyethylene vial in a desiccator until analysis to maintain sample integrity and prevent contamination.
Q6: How are standard curves created for quantifying carbon and nitrogen in samples?
Standard curves use compounds of known composition, such as aspartic acid with a 4:1 carbon-to-nitrogen ratio. Multiple amounts of the standard are weighed in tin cups, sealed, and analyzed using the elemental analyzer. The resulting chromatograms show peak areas for nitrogen gas and carbon dioxide at characteristic times. These peak areas are used to calculate the amount of nitrogen and carbon in unknown soil samples.
Q7: What environmental applications use carbon and nitrogen elemental analysis?
Elemental analysis applies to marine habitats, urban runoff monitoring, and ecosystem studies. Researchers measure dissolved organic carbon in water samples and analyze particulate organic matter from coral reefs. The technique monitors nutrient loss in irrigation runoff that pollutes water supplies and reveals links between predation stress and decomposition rates by analyzing C:N ratios in herbivore carcasses, demonstrating soil nutrient analysis nitrogen phosphorus and potassium dynamics.