Ekstrakcja biomarkerów z osadów - przyspieszona ekstrakcja rozpuszczalnikiem
Źródło: Laboratorium Jeffa Salacupa - Uniwersytet Massachusetts Amherst
Stwierdzono, że rozkład grupy organicznych biomarkerów zwanych tetraeterami gl…
1. Zebranie niezbędnych materiałów
- Wyodrębnij próbki. Próbki (w tym przypadku osad) są zamrażane, liofilizowane, kruszone i homogenizowane przed ekstrakcją, a następnie ekstrahowane w grupach w celu maksymalizacji wydajności.
- W zależności od wielkości próbki należy używać fiolek do pobierania próbek o objętości 40 lub 60 ml. Do tego eksperymentu używa się fiolek ze szkła borokrzemianowego (40 ml) i nakrętek bezpiecznych dla rozpuszczalników. Fiolki do spalania, pipety ze szkła borokrzemianowego i puszki wagowe w temperaturze 550 °C przez 6 godzin przed usunięciem ewentualnych zanieczyszczeń organicznych.
- Dichlorometan (DCM) i metanol są powszechne w większości laboratoriów geochemii organicznej. Używaj ich pojedynczo (najpierw metanol, a następnie DCM) do płukania narzędzi laboratoryjnych i szkła przed użyciem. Mieszanina dichlorometanu z metanolem (MeOH; 9:1) jest stosowana w wielu laboratoriach do wydajnej ekstrakcji biomarkerów o szerokim zakresie polarności. Rozpuszczalniki powinny być wolne od zanieczyszczeń organicznych.
- Zdobądź przyspieszony ekstraktor rozpuszczalnikowy do użycia w tym eksperymencie.
2. Przygotowanie komórek próbnych
- Zbierz jedną celę na próbkę dla każdej próbki, która ma zostać wyekstrahowana, oraz jedną ślepą próbę.
- Dla każdej komórki przykręć zaślepkę na jednym końcu korpusu ogniwa.
- Umieść spalony filtr z włókna szklanego na każdej komórce za pomocą pęsety przepłukanej rozpuszczalnikiem. Następnie delikatnie i powoli wciśnij filtr do komórki za pomocą tłoka filtra.
- Oznacz ciała komórek numerami (e.g. 1 - 22) dla każdej próbki i napisz "puste" na pustej komórce.
- Wypełnij puste miejsce ziemią okrzemkową (lub piaskiem) i zakryj drugą zaślepką. Dokręć ręcznie.
3. Przygotowanie próbek
- Umieść spaloną puszkę wagową na wadze laboratoryjnej, a następnie wytaruj.
- Przepłukać szpatułkę laboratoryjną rozpuszczalnikiem, a następnie za jej pomocą przenieść odpowiednią masę próbki do szalki wagowej i zapisać masę.
- Masa próbki różni się w zależności od zawartości materii organicznej. Stosunkowo chudy materiał materii organicznej (błoto morskie) może wymagać kilku gramów, podczas gdy materiał bogaty w materię organiczną (tkanka liści) może wymagać znacznie mniej.
- Przenieść cały materiał z blachy wagowej do przygotowanej celi ASE.
- Umieść kolejny filtr z włókna szklanego na górze komórki, a następnie powoli i delikatnie dociśnij, aż dotrze do górnej części próbki za pomocą tłoka filtra.
- Dodaj ziemię okrzemkową (lub piasek) do komórki, aż będzie prawie pełna. Uważaj, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia z gwintów korpusu komórki.
- Zakryj górną część komórki inną zaślepką.
- Powtórzyć kroki 3.1 - 3.6 dla każdej próbki.
4. Przygotowanie fiolek do pobrania
- Oznaczyć każdą fiolkę numerem odpowiadającej jej komórki (np. 1 - 22 lub ślepą) i zakryć nakrętką fiolki do pobierania ASE.
5. Ekstrakcja
- Umieść każdą komórkę próbki w ponumerowanym gnieździe na górnej tacy ASE.
- Umieścić odpowiednią fiolkę do zbierania w tym samym gnieździe numerycznym na dolnej tacy ASE.
- Utwórz metodę wyodrębniania przy użyciu klawiatury w środowisku ASE. Ekstrahować w temperaturze 100 °C i ciśnieniu 1 200 psi. Ekstrahować każdą próbkę 3 razy z 10-minutowym zatrzymaniem statycznym i przepłukać korpus komórki 50% jej całkowitej objętości między elektrostatycznymi uchwytami.
- Upewnij się, że butelka z rozpuszczalnikiem zawiera wystarczającą ilość rozpuszczalnika, aby wyekstrahować wszystkie próbki.
- Wypłucz ASE 3x przed rozpoczęciem pracy, naciskając przycisk "płukanie" na panelu sterowania ASE.
- Naciśnij start.
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Przyspieszona ekstrakcja rozpuszczalnikowa jest szybką, wydajną i wysokowydajną techniką stosowaną do oddzielania biomarkerów organicznych od dużej liczby próbek osadów geologicznych.
Tradycyjnie stosuje się metody ekstrakcji, takie jak sonikacja lub Soxhlet, jednak wadą tych protokołów jest to, że są one zbyt wolne, aby przetworzyć wystarczającą ilość materiału do szczegółowej rekonstrukcji paleoklimatu. Nowsza technika, przyspieszona ekstrakcja rozpuszczalnikiem (metoda ASE), została opracowana z myślą o wydajności i wysokiej przepustowości.
Metoda ASE wykorzystuje kombinację wysokich temperatur i wysokiego ciśnienia do ekstrakcji próbek i może przeprowadzić wiele próbek w jednym, stosunkowo szybkim cyklu przygotowawczym.
Ten film jest trzecim z serii szczegółowo opisującej, jak wyodrębnić biomarkery z osadu. Omówi procedurę i zapewni wgląd w zalety ASE w porównaniu z sonikacją lub ekstrakcją Soxhleta.
W przyspieszonej ekstrakcji rozpuszczalnikiem próbki są ładowane do stalowych komórek, które są następnie ładowane do karuzeli. Fiolki do pobierania próbek dla każdej komórki próbki są również ładowane do oddzielnej karuzeli. Przyrząd ładuje próbkę do wewnętrznego pieca. Rozpuszczalnik jest pompowany z butelki z rozpuszczalnikiem przez szereg zaworów, aż do osiągnięcia wystarczającego ciśnienia.
Ciśnienie to jest utrzymywane przez czas podyktowany przez próbkę i analit. Następnie rozpuszczalnik jest przepłukiwany z celi próbki przez stalową linię do odpowiedniej fiolki zbiorczej. Proces ten można powtarzać wiele razy. Temperaturę, ciśnienie i czas trwania można dostosować do próbki.
Zastosowana wysoka temperatura zwiększa kinetykę ekstrakcji, podczas gdy wysokie ciśnienie zapobiega ulatnianiu się rozpuszczalnika. Fiolka do pobierania zawiera teraz całkowity ekstrakt lipidowy, a to, co pozostało w komórce próbki, nazywa się pozostałością. Obejmuje materiał nieorganiczny, a także materiał organiczny, który nie jest ekstrahowany rozpuszczalnikiem, zwany kerogenem.
Teraz, gdy jesteśmy już zaznajomieni z zasadami przyspieszonej ekstrakcji rozpuszczalnikiem, przyjrzyjmy się, jak odbywa się to w laboratorium.
Po zebraniu interesujących nas próbek; liofilizować, homogenizować i odkażać, jak pokazano w innym filmie z tej serii.
Po przygotowaniu wszystkich próbek należy zmontować jedną celę dla każdej z nich, która ma zostać wyekstrahowana, i jedną dodatkową dla ślepej próby. Aby to zrobić, przykręć zaślepkę do korpusu ogniwa. Za pomocą pęsety przepłukanej rozpuszczalnikiem umieść na każdym z nich spalony filtr z włókna szklanego. Powoli i delikatnie dociśnij filtr w dół za pomocą tłoka.
Oznacz ciała komórek numerami dla każdej próbki i oznacz ślepą próbę osobno.? Umieść spaloną blachę wagową na wadze laboratoryjnej i wytaruj. Przepłukać szpatułkę rozpuszczalnikiem, a następnie za jej pomocą przenieść 5 do 10 g próbki do szalki wagowej i zapisać masę.
Przenieś cały materiał z tacy wagowej do odpowiedniej komórki. Umieść kolejny filtr z włókna szklanego na górze i delikatnie ubijaj, aż dotrze do górnej części próbki.
Dodaj dyspergator, taki jak ziemia okrzemkowa lub piasek, aż będzie prawie pełny, uważając, aby nie dostały się żadne zanieczyszczenia do nici ciała komórki. Zakryj górną część komórki inną zaślepką. Powtórz te kroki dla każdej próbki i ślepej próby.
Oznaczyć każdą fiolkę zbiorczą numerem odpowiadającej jej komórki lub ślepej próbki, a nakrętkę nakrętką fiolki. Umieść każdą komórkę w ponumerowanym gnieździe na górnej zasobniku środowiska ASE. Ustaw parametry metody wyodrębniania za pomocą klawiatury w środowisku ASE, aby wyodrębnić na 100 ? C?i 1,200 psi. Ekstrahować każdą próbkę 3 razy z 10-minutowym zatrzymaniem statycznym i przepłukać korpus komórki 50% jej całkowitej objętości między elektrostatycznymi uchwytami.
Następnie upewnij się, że butelka z rozpuszczalnikiem zawiera wystarczającą ilość do ekstrakcji wszystkich próbek. Przepłucz przewody przyrządów 3 razy przed rozpoczęciem biegu. Na koniec naciśnij start.
Wyjąć fiolkę z ASE. Teraz, gdy biomarkery zostały wyekstrahowane, należy je oczyścić przed analizą.
Przyspieszona ekstrakcja rozpuszczalnikiem to wszechstronna technika, która może być wykorzystywana do różnych zastosowań, z których niektóre są badane tutaj.
Przyspieszona ekstrakcja rozpuszczalnikiem może być również stosowana do innych rodzajów próbek, w tym żywności. Analiza pozostałości w celu zbadania zanieczyszczenia pestycydami jest często przeprowadzana w obiektach regulacyjnych i przemysłowych w celu ustalenia bezpieczeństwa i jakości produktów spożywczych, takich jak owoce lub warzywa. ASE może być stosowany do ekstrakcji pestycydów chloroorganicznych z próbek żywności oraz określania rodzajów lub poziomów pozostałości obecnych w produkcie. Informacje te można następnie wykorzystać do ustalenia, czy produkt nadaje się do spożycia przez ludzi lub zwierzęta. Na przykład dieldryna powinna znajdować się w przedziale od 0 do 0,1 części na milion w żywności, w zależności od produktu.
Składniki odżywcze żywności można również ekstrahować za pomocą ASE. Na przykład produkty takie jak czekolada, które mogą mieć wysoką grawimetryczną zawartość tłuszczu, mogą być ekstrahowane. Używając ASE z eterem naftowym jako rozpuszczalnikiem, tłuszcz można oddzielić od próbek czekolady i poddać analizie ilościowej w celu określenia dokładnej procentowej zawartości tłuszczu na znaną ilość czekolady. Korzystając z tych informacji, organy regulacyjne mogą weryfikować oświadczenia producentów czekolady lub producenci mogą uzyskiwać informacje w celu tworzenia dokładnych etykiet żywności.
Właśnie obejrzeliście wprowadzenie JoVE do ekstrakcji biomarkerów lipidowych za pomocą przyspieszonej ekstrakcji rozpuszczalnikowej (ASE). Metody dalszego przetwarzania i analizy można znaleźć w kolejnych filmach.
Dzięki za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: Why is accelerated solvent extraction better than sonication or Soxhlet extraction?
Accelerated solvent extraction is faster and more efficient than traditional methods like sonication or Soxhlet extraction. ASE combines high temperature and high pressure to extract biomarkers from sediment samples in a single, relatively fast preparation run. This high-throughput capability enables researchers to process hundreds or thousands of samples needed for detailed paleoclimate reconstruction, which older extraction methods cannot achieve.
Q2: How do temperature and pressure work together in accelerated solvent extraction?
In accelerated solvent extraction, high temperature increases the kinetics of the extraction process, speeding up biomarker separation from sediment. High pressure simultaneously keeps the solvent from volatizing, or evaporating, during extraction. This combination of elevated temperature and pressure allows the ASE method to efficiently extract organic compounds while maintaining solvent integrity throughout the procedure.
Q3: What materials are used to prepare samples for accelerated solvent extraction?
Samples are loaded into steel cells with combusted glass fiber filters placed above and below the sediment material. A dispersant such as diatomaceous earth or sand is added to fill the cell and improve solvent contact. End caps seal the cell, and collection vials receive the extracted material. All glassware and filters are combusted to remove organic contaminants before use.
Q4: What is the difference between a total lipid extract and kerogen in ASE?
A total lipid extract is the organic material dissolved by the solvent and collected in the vial after accelerated solvent extraction. Kerogen is the non-extractable organic material that remains in the sample cell after extraction. The residue left behind comprises both non-organic material and kerogen, representing compounds that are not solvent-extractable.
Q5: How can accelerated solvent extraction be used for food safety testing?
Accelerated solvent extraction can extract organochlorine pesticides and other residues from food samples like fruits and vegetables. ASE determines the types and levels of pesticide contamination present, helping regulatory and industrial facilities verify whether produce is safe for human or animal consumption. For example, dieldrin levels must remain within 0 to 0.1 parts per million depending on the product.
Q6: What role do biomarkers play in paleoclimate reconstruction?
Biomarkers like glycerol-dialkyl glycerol-tetraethers (GDGTs) are produced by archaea and bacteria and change predictably in response to air or water temperature. The distribution of these biomarkers in sediment sequences of known age allows scientists to reconstruct past temperature changes on decadal to millennial timescales. This paleoclimate data requires rapid analysis of hundreds or thousands of samples, making accelerated solvent extraction essential.
Q7: What happens to the extracted biomarkers after accelerated solvent extraction?
After accelerated solvent extraction, the total lipid extract containing biomarkers must be purified before analysis. The purification process removes unwanted compounds and concentrates the target biomarkers. Purification of a total lipid extract with column chromatography is a common next step in preparing samples for detailed chemical and paleoclimate analysis.