$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Chromatografia kolumnowa jest elastyczną techniką oczyszczania złożonej mieszaniny związków znajdujących się w osadzie. Mieszaniny rozdzielają się, gdy przechodzą przez kolumnę i są zbierane we frakcje, z których każda zawiera inną klasę chemiczną związków. Dlatego chromatografia kolumnowa jest często stosowana jako dodatkowy etap oczyszczania po wstępnej izolacji pożądanego związku. Ekstrakty organiczne, takie jak całkowite ekstrakty lipidowe, mogą być złożonymi mieszaninami wielu związków. Niektóre techniki oczyszczania, takie jak zmydlanie, wprowadzają związki, które mogą uszkodzić instrumenty analityczne, dlatego muszą zostać usunięte przed analizą. Ten film jest częścią serii poświęconej ekstrakcji, oczyszczaniu i analizie lipidów z osadów. Po pobraniu całkowitego ekstraktu lipidowego z próbki osadowej, chromatografia kolumnowa jest stosowana do oczyszczania zarówno alkenonów, jak i GDGT, w zależności od pożądanej analizy.
W chromatografii kolumnowej mieszanina związków chemicznych jest ładowana na stałą fazę stacjonarną, taką jak żel krzemionkowy. Faza ruchoma, taka jak rozpuszczalnik organiczny, jest następnie używana do elucji lub usuwania związków z kolumny. Kolejność, w jakiej związki są eluowane, zależy od siły oddziaływań związków z żelem krzemionkowym i eluentem.
Eluat zbiera się we frakcjach, z których każda zawiera inne związki z mieszaniny. W zależności od właściwości związków, pojedynczy rozpuszczalnik może zapewnić wystarczającą separację i elucję wszystkich interesujących związków. W przeciwnym razie stosuje się wiele rozpuszczalników do elucji każdego związku będącego przedmiotem zainteresowania po kolei.
Związki polarne, które mają nierównomierny rozkład ładunku, silnie adsorbują się do polarnego żelu krzemionkowego, podczas gdy związki niepolarne adsorbują się słabo. Rozpuszczalniki polarne mają większe powinowactwo do żelu krzemionkowego i dlatego są silniejszymi eluentami niż rozpuszczalniki niepolarne. Tak więc rozpuszczalniki niepolarne eluują tylko związki niepolarne, podczas gdy rozpuszczalniki polarne eluują zarówno związki niepolarne, jak i polarne.
Gdy pożądane związki są umiarkowanie polarne, związki niepolarne należy zmyć z kolumny rozpuszczalnikiem niepolarnym przed użyciem rozpuszczalnika polarnego. Aby uniknąć elucji niepożądanych wysoce polarnych związków, takich jak kwasy, eluent polarny nie powinien mieć większej mocy eluującej niż jest to potrzebne dla najbardziej polarnego pożądanego związku.
Teraz, gdy rozumiesz zasady chromatografii kolumnowej, przejdźmy przez procedurę oczyszczania biomarkerów lipidowych z całkowitego ekstraktu lipidowego za pomocą chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym.
Aby usunąć zanieczyszczenia organiczne, należy spalać pipety ze szkła borokrzemianowego, fiolki ze szkła borokrzemianowego i watę szklaną przez 6 godzin w temperaturze 550 °C. Gdy szklane naczynia będą gotowe do użycia, ustaw stojak na pipety i fiolki. Zaopatrz się w gruszki do pipet, czystą pęsetę, szpatułkę laboratoryjną, żel krzemionkowy, heksan, dichlorometan i metanol. Za pomocą czystej pęsety umieść małą kępkę waty szklanej w otworze pipety. Delikatnie dociśnij watę szklaną do dna pipety za pomocą trzpienia innej pipety, aby utworzyć luźną zatyczkę. Ostrożnie załaduj żel krzemionkowy do pipety, aż będzie do połowy pełny. Zamocuj pipetę pionowo w stojaku. Zabezpiecz fiolkę ze szkła borokrzemianowego o pojemności 4 ml poniżej końcówki pipety w celu zebrania odpadów. W innej fiolce ze szkła borokrzemianowego zawiesić do 10 mg suchej próbki z procesu zmydlania w heksanie. Jeśli próbka przyklei się do ścianek fiolki, należy poddać ją sonikacji przez 5 minut. Można teraz rozpocząć procedurę chromatografii.
Aby rozpocząć chromatografię, przemyj kolumnę z żelem krzemionkowym 3 objętościami heksanu w celu usunięcia pęcherzyków powietrza i zanieczyszczeń. Następnie należy zastąpić fiolkę z odpadami pustą fiolką na frakcję niepolarną. Za pomocą szklanej pipety załadować próbkę do kolumny i pozwolić, aby zawiesina wsiąknęła w żel krzemionkowy. Pracuj szybko, aby kolumna nie wyschła podczas zabiegu. Przepłukać fiolkę z próbką dwukrotnie małymi porcjami heksanu i przenieść każde płukanie do kolumny. Kontynuuj dodawanie heksanu do kolumny, aż fiolka do zbierania będzie prawie pełna. Poczekaj, aż cały heksan zakończy wnikanie do żelu krzemionkowego. Następnie należy wymienić napełnioną fiolkę na pustą fiolkę na frakcję śródbiegunową. Następnie przepłukać fiolkę z próbką DCM i dodać ją do kolumny 3 razy. Kontynuuj dodawanie DCM do kolumny, aż fiolka do pobierania będzie prawie pełna. Poczekaj, aż DCM zakończy zanurzanie się w żelu krzemionkowym, a następnie wymień napełnioną fiolkę na pustą fiolkę na frakcję polarną. Powtórz ten proces z metanolem.
Gdy fiolka jest prawie pełna, poczekaj, aż metanol przestanie kapać do fiolki, a następnie zakryj wszystkie fiolki. Frakcja środkowobiegunowa zawiera pożądane alkenony, podczas gdy GDGT znajdują się we frakcji polarnej. W przypadku szczególnie brudnych lub złożonych próbek alkenonów, frakcja środkowopolarna musi być dodatkowo oczyszczona przez addukcję mocznika przed analizą.
Chromatografia kolumnowa jest szeroko stosowana w chemii jako technika analityczna i oczyszczająca.
Nanorurki węglowe (CNT) są coraz częściej stosowane w wielu gałęziach przemysłu, ale rosną obawy dotyczące ich wpływu na zdrowie ludzi. Zmiana właściwości CNT zmienia sposób, w jaki zachowują się one w wodzie i glebie. Aby zbadać, jak dobrze porowate media, takie jak piasek i brud, zatrzymują CNT, przygotowano kolumnę, w której fazą stacjonarną była porowata gleba. Po pierwsze, frakcje zostały zebrane podczas ładowania roztworu CNT na kolumnę, aby przeanalizować transport CNT przez glebę. Następnie CNT nadal zaadsorbowane w glebie zostały wymyte, a frakcje przeanalizowane pod kątem ilości CNT, które pozostały w glebie. Wyniki dostarczają informacji na temat związku między funkcjonalizacją powierzchni CNT a mechanizmami ich transportu w środowisku.
Chromatografia kolumnowa może być stosowana zarówno w dużej, jak i małej skali, dlatego jest stosowana przy projektowaniu syntez do zastosowań przemysłowych. Nici pajęcze mają doskonałą wytrzymałość na rozciąganie i ciągliwość, ale nie można ich zbierać na skalę przemysłową. Po syntezie białek jedwabiu rekombinowane białka jedwabiu są oczyszczane za pomocą chromatografii powinowactwa, w której faza stacjonarna jest zaprojektowana tak, aby wychwytywać tylko pożądaną cząsteczkę. Dokładne mycie i elucja dostarczają czystych frakcji białkowych potrzebnych do przędzenia pajęczej nici na dużą skalę.
Do chromatografii kolumnowej dostępnych jest wiele faz stacjonarnych. Jedna faza stacjonarna może nie być odpowiednia dla wszystkich potencjalnych produktów syntezy o szerokim zakresie podstawnikowym, takiej jak synteza jodozyrydyny. Produkt surowy miesza się z różnymi fazami stacjonarnymi i rozkład ocenia się za pomocą NMR protonu. Ponieważ proton NMR jest bardzo czuły, wiele faz stacjonarnych można przesiewać pod kątem rozkładu produktu przy użyciu niewielkiej ilości surowego produktu. Następnie przeprowadza się chromatografię kolumnową z optymalną fazą stacjonarną, co pozwala na oczyszczenie nowych i wysoce reaktywnych związków.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do chromatografii kolumnowej w celu oczyszczenia całkowitego ekstraktu lipidowego. Poniższy film pokaże, jak dalej oczyszczać złożone mieszaniny zawierające alkenony.
Dzięki za oglądanie!
