Usuwanie związków rozgałęzionych i cyklicznych przez addukcję mocznika w paleotermometrii Uk'37
Źródło: Laboratorium Jeffa Salacupa - Uniwersytet Massachusetts Amherst
Jak wspomniano w poprzednich filmach, produkt ekstrakcji rozpuszczalnikiem org…
1. Ustawienie i przygotowanie materiałów
- Uzyskać całkowity ekstrakt lipidowy (TLE) przy użyciu metody ekstrakcji rozpuszczalnikiem (Sonication, Soxhlet lub przyspieszona ekstrakcja rozpuszczalnikiem (ASE)).
- Kup następujące materiały w dowolnym sklepie chemicznym: pipety i żarówki ze spalonego szkła borokrzemianowego; czysta woda; heksan; dichlorometan (DCM); metanol; mocznik.
- Odczynniki powinny być czyste i wolne od węglowodorów. Alternatywnie, czystą wodę można uzyskać w laboratorium przy użyciu systemu oczyszczania wody.
- Zaopatrz się w 4-mililitrowe fiolki ze szkła borokrzemianowego z nakrętkami wyłożonymi PTFE.
2. Metody
- Przygotuj mieszaninę 2:1 DCM:Hexane (v:v).
- W kolbie Erlenmeyera wymieszać 200 ml DCM i 100 ml heksanu.
- Przygotować mieszaninę mocznika z metanolem (100 mg/ml).
- Wlać 300 ml metanolu do kolby Erlenmeyera.
- Dodaj 300 mg mocznika.
- Mieszać na automatycznej płytce mieszającej, aż mocznik całkowicie się rozpuści.
- Zacznij od suchej próbki w fiolce o pojemności 4 ml.
- Zawiesić próbkę w 1,5 ml mieszaniny DCM:Hexane (v:v) w stosunku 2:1.
- Jeśli próbka nie rozpuści się całkowicie, należy przeprowadzić sonikację przez 5 minut.
- Do tej mieszaniny dodaj 1,5 ml mocznika w metanolu.
- Po tym dodaniu obserwuj, czy nie utworzy się biały osad. Sygnalizuje to tworzenie się kryształów mocznika.
- Delikatnie osusz kryształy pod azotem, używając delikatnego ciepła. Upewnij się, że cały rozpuszczalnik wyparował przed przejściem do następnego kroku.
- Przepłucz kryształy 3x około 1 ml heksanu. Usuń heksan między każdym płukaniem za pomocą szklanej pipety, aby przenieść go do fiolki oznaczonej jako "non-addduct".
- Rozpuść kryształy w 2 ml czystej wody. Wstrząśnij, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.
- Wyekstrahuj fazę wodną heksanem, dodając 1 ml i delikatnie wstrząsając przez 5 s.
- Pozwól, aby heksan i woda całkowicie się rozdzieliły, a następnie usuń około 75% heksanu za pomocą szklanej pipety i przenieś go do fiolki oznaczonej "adduktem".
- Powtórz krok 2.10 dwa razy.
- Wodę i roztwór mocznika należy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady.
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Addukcja mocznika to technika, która oddziela alkenony o prostych łańcuchach od związków silnie rozgałęzionych i cyklicznych.
Mocznik to związek organiczny, który tworzy porowatą strukturę krystaliczną. Kryształ może uwięzić niektóre cząsteczki, tworząc addukt, podczas gdy inne nie mogą zmieścić się w strukturze.
Addukcja mocznika wykorzystuje różne rozmiary i kształty związków do ich oddzielenia ? Podobnie jak maszyna do liczenia monet sortuje słoik z drobnymi.?
Ten film jest częścią serii poświęconej ekstrakcji, oczyszczaniu i analizie lipidów z osadów. Zilustruje zastosowanie addukcji mocznika do przeprowadzenia oczyszczania z wykluczenia wielkości na próbce do paleotermometrii alkenonu.
Addukcja mocznika to metoda oczyszczania oparta na wykluczeniu wielkości. Oddziela związki o prostych łańcuchach lub rzadko rozgałęziających się ? takie jak N-alkany i alkenony - od tych, które są silnie rozgałęzione i/lub cykliczne.? ? ? ? ??
Jest to możliwe dzięki specjalnej strukturze krystalicznej mocznika. Kiedy tworzy się kryształ mocznika, między poszczególnymi cząsteczkami tworzą się niewielkie przestrzenie. Przestrzenie te są długie i wąskie - więc związki o prostych łańcuchach lub rzadko rozgałęziających się mogą zmieścić się w sieci krystalicznej, podczas gdy związki silnie rozgałęzione i cykliczne są zbyt duże.
Kryształy mocznika są następnie przemywane rozpuszczalnikiem niepolarnym, oddzielając wyłączone cząsteczki od dołączonych cząsteczek liniowych. Umyte cząsteczki można ekstrahować i analizować bezpośrednio, podczas gdy kryształy muszą zostać rozpuszczone w wodzie, aby najpierw uwolnić związki liniowe z powrotem do roztworu. Następnie stosuje się inny rozpuszczalnik apolarny do ekstrakcji pożądanych związków z wody.
Zarówno włączone, jak i wykluczone cząsteczki mogą dostarczyć cennych informacji. Na przykład silnie rozgałęzione izoprenoidy, wytwarzane przez okrzemki lodu morskiego, mogą być wskaźnikiem istnienia sezonowego lodu morskiego na dużych szerokościach geograficznych. Związki cykliczne mogą odzwierciedlać obecność dawnych pożarów. Prostopadłe alkany i alkenony są powszechnymi wskaźnikami zastępczymi struktury ekosystemu i temperatury powierzchni morza.
Oczyszczanie zapewniane przez addukcję mocznika nie zawsze jest konieczne, ponieważ niektóre interesujące związki można analizować bezpośrednio z niezmienionej wyekstrahowanej próbki organicznej. W skrajnych przypadkach - np. w osadach pozyskanych z obszarów silnie zanieczyszczonych, takich jak ujścia rzek w pobliżu ośrodków przemysłowych - może być konieczne addukowanie mocznika w celu usunięcia nieznanych związków, które koeluują podczas analizy.
Teraz, gdy rozumiesz addukcję mocznika, jesteś gotowy do rozpoczęcia procedury.
Na początek zdobądź wysuszony całkowity ekstrakt lipidowy ? czy TLE ? który został wyekstrahowany z próbki i oczyszczony za pomocą zmydlania i chromatografii kolumnowej.
Następnie przygotuj roztwory addukcyjne mocznika zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Upewnij się, że wszystkie składniki są czyste i wolne od węglowodorów.
Zawiesić próbkę w 1,5 ml roztworu DCM/heksanu. Jeśli TLE nie rozpuści się całkowicie, należy poddać sonikacji przez 5 minut. Dodać 1,5 ml roztworu mocznika i metanolu. Uważaj na tworzenie się białego osadu, ponieważ sygnalizuje to tworzenie się kryształów mocznika. Następnie delikatnie osusz kryształy mocznika pod azotem, używając delikatnego ciepła. Pamiętaj, aby odparować cały rozpuszczalnik. Po całkowitym wyschnięciu kryształów spłucz je 3 razy około 1 ml heksanu. Użyj szklanej pipety, aby usunąć heksan między każdym płukaniem i przenieś go do świeżej fiolki. Jest to oznaczone jako "non-addduct". Następnie rozpuść kryształy w 2 ml czystej wody. Wstrząśnij, aby zapewnić całkowite rozpuszczenie.
Aby wyekstrahować biomarkery z dodanej wody, dodaj 1 ml heksanu, zakręć i delikatnie wstrząsaj przez 5 s.
Pozostaw roztwór do spoczynku, aż heksan i woda całkowicie się rozdzielą. Następnie, za pomocą szklanej pipety, usuń około 75% heksanu i przenieś go do nowej fiolki. Jest to oznaczone jako "przywodzenie".
Powtórz ten proces ekstrakcji dwukrotnie, za każdym razem dodając 1 ml heksanu. Połączyć trzy addukty w jednej fiolce. Wodę i roztwór mocznika należy wyrzucić do odpowiedniego pojemnika na odpady. Próbka jest teraz gotowa do analizy.
Addukcja mocznika ma kilka zastosowań w separacji i oczyszczaniu cząsteczek organicznych.
Izotop to odmiana pierwiastka chemicznego, która różni się ilością neutronów, a tym samym różni się masą atomową. Pierwiastek może mieć kilka izotopów, z których każdy ma inną masę. Izotopy mogą mieć również właściwości chemiczne i molekularne, które różnią się od siebie, dlatego ważne może być określenie, które izotopy są obecne w danej próbce. W tym przykładzie zmierzono proporcje izotopów węgla i wodoru w woskach liściowych w celu zebrania informacji na temat szlaków metabolicznych rośliny. Do określenia proporcji izotopów potrzebne są bardzo duże ilości materiału, a związki, które mają podobne detekcje przy niskich stężeniach, mogą nakładać się na siebie, gdy analizowane są duże ilości.
W związku z tym zastosowano addukcję mocznika w celu oddzielenia n-alkanów będących przedmiotem zainteresowania od wszelkich związków zakłócających. Usunięcie tych niechcianych materiałów pozwoliło na określenie dokładnego stosunku izotopów.
Ropa naftowa to złożona mieszanina węglowodorów, z których każdy ma unikalne właściwości i zastosowania. Oddzielenie tych związków od ropy naftowej jest bardzo ważne w przemyśle chemicznym – alkany o rozgałęzionych łańcuchach są często stosowane jako lekkie smary, natomiast alkany o prostym łańcuchu są stosowane głównie w procesach alkilowania. W tym przykładzie addukcja mocznika została użyta do oddzielenia alkanów od nafty. Stosując kolejne serie addukcji mocznika, alkany te oddzielono od nafty o czystości 99%.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do oczyszczania złożonych mieszanin organicznych poprzez addukcję mocznika. Powinieneś teraz zrozumieć wykluczenie rozmiaru, znaczenie oczyszczania próbek w celu dokładnego pomiaru składników i addukcji mocznika.
Dzięki za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: How does urea adduction separate straight-chain compounds from branched and cyclic molecules?
Urea forms a porous crystalline structure with long, narrow spaces in its lattice. Straight-chain or rarely-branching compounds like n-alkanes and alkenones fit into these spaces, while highly-branched and cyclic compounds are too large to enter. After washing with an apolar solvent, the excluded molecules separate from the included linear ones, enabling selective purification based on molecular size and shape.
Q2: What is the primary purpose of urea adduction in paleothermometry sample preparation?
Urea adduction purifies complex lipid extracts by isolating compounds of interest from interfering substances. In paleothermometry, it separates alkenones and other biomarkers from unwanted branched and cyclic compounds, enabling accurate measurement of paleoclimate proxies. This size-exclusion purification ensures that only target compounds are analyzed, improving data reliability for reconstructing past sea surface temperatures.
Q3: Why must urea crystals be dissolved in water to recover adducted compounds?
Straight-chain compounds trapped within the urea crystal lattice cannot be extracted directly with apolar solvents because they are physically enclosed. Dissolving the crystals in water releases the included molecules back into solution. An apolar solvent is then used to extract the desired compounds from the aqueous phase, separating them from the dissolved urea.
Q4: What information can branched isoprenoids and cyclic compounds provide in paleoclimate research?
Highly branched isoprenoids produced by sea ice diatoms serve as proxies for seasonal sea ice presence at high latitudes. Cyclic compounds may reflect the occurrence of past fires in the sediment record. These excluded compounds, separated from linear biomarkers through urea adduction, offer complementary paleoenvironmental information alongside straight-chain proxies for ecosystem structure and temperature.
Q5: When is urea adduction necessary versus optional in lipid analysis?
Urea adduction is optional when compounds of interest can be analyzed directly from unaltered extracted organic samples without interference. However, it becomes necessary in extreme cases, such as sediments from highly polluted areas like industrial estuaries, where unknown compounds coelute during analysis. Removing these interfering substances ensures accurate measurement of target biomarkers.
Q6: How is urea adduction applied in petroleum refining to separate alkanes?
In the petroleum industry, urea adduction separates branched-chain alkanes from straight-chain alkanes based on their molecular shapes. Branched-chain alkanes are used as light lubricants, while straight-chain alkanes serve in alkylation processes. Successive urea adductions can achieve high purity separation, with studies demonstrating 99-percent purity separation of alkanes from kerosene.
Q7: What steps follow urea crystal formation during the adduction procedure?
After white precipitate forms, gently dry the urea crystals under nitrogen with gentle heat until all solvent evaporates. Rinse the crystals three times with hexane, transferring each rinse to a fresh vial as the non-adduct fraction. Dissolve the crystals in water, then extract with hexane three times, combining all hexane extracts as the adduct fraction ready for analysis.