5.8: Podawanie związków III

1. Administracja śródskórna

1. Większość wstrzyknięć śródskórnych to związki na bazie wody. Roztwory muszą być fizjologicznie buforowane tak, aby miały neutralne pH, aby uniknąć martwicy tkanek w miejscu wstrzyknięcia.
2. Zakres rozmiarów igieł to 25-30 gauge, najmniejszy z możliwych.
3. Zakres dawek na miejsce wstrzyknięcia wynosi 50-100 μl. Wstrzykiwanie nadmiernych objętości może spowodować martwicę w miejscu wstrzyknięcia lub wyciek związku z miejsca wstrzyknięcia z powodu ciśnienia.
4. Aby dokładnie umieścić igłę w przestrzeni śródskórnej, konieczne jest znieczulenie zarówno myszy, jak i szczurów. Znieczulenie wziewne pozwala na szybką indukcję i powrót do zdrowia; Jednak znieczulenie iniekcyjne ma tę zaletę, że zapewnia wystarczająco dużo czasu na przygotowanie obszaru i wykonanie wstrzyknięcia. ¹
5. Usuń włosy w miejscu wstrzyknięcia za pomocą kremu do depilacji lub goląc obszar.
6. Dokładnie usuń wszelkie resztki kremu do depilacji lub resztki włosów.
7. Zastosuj miejscowy środek antyseptyczny, taki jak roztwór jodu, roztwór chlorheksydyny lub alkohol.
8. Procedury administracyjne
   1. Rozciągnij napiętą skórę między kciukiem a palcem wskazującym. Zapewnia to stabilność skóry podczas ustawiania igły.
   2. Umieść igłę pod skosem do góry na skórze.
   3. Delikatnie wbić igłę w skórę między naskórkiem a skórą właściwą. Przesuń igłę tuż poza skos.
   4. Substancję należy wstrzykiwać powoli. Wstrzyknięcie związku spowoduje powstanie pęcherzyka lub małego pęcherza na skórze.
   5. Po wstrzyknięciu należy zrobić przerwę, aby skóra mogła się rozciągnąć i dostosować przed wyjęciem igły.
9. Środki ostrożności
   1. Odciąganie tłoka nie jest konieczne.
   2. Jeśli igła zostanie wprowadzona do przestrzeni podskórnej, nie tworzy się pęcherzyk. Zbyt głębokie wstrzyknięcie powoduje wstrzyknięcie podskórne.
   3. Należy unikać osuszania lub wycierania tego obszaru, ponieważ może to spowodować wyciek związku z miejsca wstrzyknięcia.
   4. Podczas wykonywania wielokrotnych wstrzyknięć należy je rozmieścić tak, aby pęcherzyki nie zachodziły na siebie.

Rysunek 1. Wstrzyknięcie śródskórne u myszy.

2. Podanie donosowe

1. Sprzęt
   1. Używaj pipety do mikropipetowania, którą można skalibrować, aby uzyskać dokładną objętość.
   2. Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego, należy używać jednorazowych końcówek do pipet. Do dawkowania można również używać strzykawek gruźlicy, tępych igieł i elastycznych rurek.
   3. Całkowita objętość wstrzyknięć dla szczurów nie powinna przekraczać 40-100 μl i powinna być podawana w kroplach po 6-10 μl. W przypadku myszy maksymalna całkowita objętość wynosi 24 μL, podawana w kroplach 3-4 μL.
2. Podawanie u zwierząt przytomnych
   1. Ręczne unieruchomienie u przytomnych zwierząt wymaga, aby głowa była względnie nieruchoma, tak aby końcówka pipety lub tępa igła mogły być umieszczone wystarczająco blisko nozdrzy, aby dostarczyć związek, ale nie tak blisko, aby szturchnąć lub zranić tkankę nosa.
   2. Unieruchomić zwierzę i trzymać je w pozycji pionowej.
   3. Umieść małą kroplę płynnego związku w otworze nosowym. Zwierzę powinno wdychać kropelkę.
   4. Podawać dodatkową objętość, naprzemiennie naprzemiennie, aż zostanie podana cała objętość.
   5. Podczas podawania większych objętości ważne jest, aby nie uciskać klatki piersiowej podczas krępowania. Ucisk klatki piersiowej utrudnia zwierzęciu wykonywanie wystarczająco głębokich oddechów, aby wciągnąć płyn do oskrzeli i płuc.

Rysunek 2. Podanie donosowe u przytomnych myszy.

3. Podawanie zwierzętom nieprzytomnym
   1. Stosowanie wziewnych środków znieczulających pozwala na unieruchomienie zwierzęcia podczas zbliżania się i podawania związku. Eliminuje to możliwość ugryzienia przez zwierzę sprzętu dozującego, utraty związku z powodu szarpania głowy oraz uszkodzenia tkanki nosowej, oczu lub skóry twarzy zwierzęcia. Zwierzę jest również mniej skłonne do wciągania i rozpylania związku z nozdrzy po podaniu.
   2. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej. Pozycja głowy wpływa na umieszczenie roztworu w nozdrzach. Wykazano, że idealną pozycją do porodu w OUN jest zwierzę leżące na wznak; Pozwala to na lepsze wchłanianie. ²
   3. Podawać połowę związku bezpośrednio po jednej stronie otworu nosowego, zsynchronizując to z inhalacją. Następnie odwróć zwierzę na drugą stronę.
   4. Jak wyżej, drugą połowę objętości podać do drugiego otworu nosowego.

Rysunek 3. Podanie donosowe u nieprzytomnych myszy.

3. Podawanie wewnątrzczaszkowe u nowonarodzonych myszy i szczurów

1. Myszy lub szczury muszą być znieczulone do wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych.

Tabela 1. Rozstaw igieł, długość igły i maksymalna objętość podawania wewnątrzczaszkowego w zależności od wieku myszy i szczurów. ⁴

2. Sprzęt
   1. Określić prawidłową grubość igły i maksymalną objętość podawania zgodnie z Tabela 1.
   2. Przygotuj osłonę igły przed znieczuleniem zwierzęcia.
      UWAGA: Głębokość wstrzykiwania igły jest kontrolowana za pomocą osłony, która jest tworzona wraz z nasadką igły.
      1. Aby utworzyć osłonę, igła jest mierzona względem nasadki igły, a na nasadce umieszcza się znak wskazujący, gdzie należy ciąć. Nacięcie należy wykonać w taki sposób, aby 2 do 5 mm igły było odsłonięte podczas zakładania nasadki na igłę.
      2. Długość odsłoniętej igły musi być wystarczająco długa, aby przeniknąć przez skórę i czaszkę oraz osiągnąć pożądaną głębokość w mózgu.
      3. Długości igieł potrzebne dla myszy i szczurów są wymienione w Tabela 1.
   3. Wymagane jest źródło ciepła, aby zapobiec hipotermii u szczeniąt. Istnieje kilka rodzajów: elektryczna poduszka grzewcza ustawiona na niskim poziomie, krążący koc wodny lub woreczek wielokrotnego użytku na ciepło do reakcji chemicznej.
3. Powściągliwość
   1. Szczenięta myszy i szczurów w wieku 10 dni lub młodsze nie wymagają znieczulenia do tej procedury. Unieruchamiaj je ręcznie, trzymając je tuż za głową i doogonowo ciągnąc skórę, aby lekko wywrzeć nacisk na ramiona.
   2. Znieczulenie szczeniąt powyżej 10 dnia życia za pomocą inhalacji izofluranu. Przymocuj komorę indukcyjną do waporyzatora precyzyjnego lub słoika z wacikiem nasączonym izofluranem. Gdy szczenię jest unieruchomione, znieczulenie jest skuteczne przez około 40 sekund, co zapewnia wystarczająco dużo czasu na wstrzyknięcie.
4. Technika iniekcji
   1. Pobrać substancję do strzykawki i nałożyć nasadkę/prowadnik igły na igłę.
   2. Objętość wstrzyknięcia zalecana jako maksymalna objętość na nowonarodzoną mysz lub szczura wynosi 100 μl, a dla myszy odsadzonych od piersi lub starszych wynosi do 300 μl.
   3. Aby wstrzyknąć do kory mózgowej noworodków, należy wprowadzić igłę 5 mm za okiem, około 3 mm od linii środkowej czaszki.
   4. Miejsce wstrzyknięcia u myszy odsadzonej od piersi znajduje się mniej więcej w połowie drogi między okiem a uchem i tuż przy linii środkowej.

Rysunek 4. Podanie wewnątrzczaszkowe u szczeniaka myszy.

Czasami różne podejścia eksperymentalne wymagają stosowania rzadziej stosowanych dróg podawania związków u gryzoni. Śródskórna, donosowa i wewnątrzczaszkowa to trzy z takich alternatywnych dróg, których naukowcy biomedyczni używają obecnie w laboratoriach.

Jak sama nazwa wskazuje, śródskórny dostarcza związki do zewnętrznych warstw skóry właściwej. Donosowo polega na umieszczeniu roztworu w nozdrzach zwierzęcia. A wewnątrzczaszkowe polega na wbiciu igły bezpośrednio do mózgu gryzonia.

Specjalistyczne szkolenie jest niezbędne do skutecznego wykonania tych procedur. Tutaj najpierw zilustrujemy rozważania dotyczące każdej z tych metod, a następnie zademonstrujemy techniki, które pomogą Ci nauczyć się procedur, zapewniając jednocześnie bezpieczeństwo zwierzęcia i sukces eksperymentu.

Zacznijmy od omówienia tego, kiedy te drogi są zwykle stosowane i o czym należy pamiętać przed rozpoczęciem stosowania tych specjalistycznych technik administracyjnych.

Iniekcje śródskórne służą do dostarczenia artykułu do przestrzeni między naskórkiem a skórą właściwą Ta droga jest zwykle zarezerwowana do oceny stanu zapalnego, diagnostyki przepływu krwi w skórze lub reakcji alergicznych na antygen. Podobnie jak w przypadku innych dróg, również roztwór śródskórny powinien być przygotowywany techniką sterylną. I musi być fizjologicznie buforowany, aby miał neutralne pH, aby uniknąć martwicy tkanek w miejscu wstrzyknięcia. Do tego wstrzykiwania często stosuje się system bez piasty z igłą o rozmiarze 25-30. System ten pomaga w zachowaniu objętości podawania, która mieści się w zakresie 50-100 mikrolitrów na miejsce wstrzyknięcia. Wstrzyknięcie nadmiaru może spowodować martwicę lub niepożądany wyciek związku z powodu ciśnienia.

Droga donosowa jest często wybierana do miejscowego dostarczania szczepionek lub sprayu obkurczającego naczynia krwionośne, a także do podawania ogólnoustrojowego i OUN. Błona śluzowa wyściełająca jamę nosową ma bogate zaopatrzenie w naczynia krwionośne i nerwy, które pozwalają na szybkie wchłanianie ogólnoustrojowe i bezpośrednie kierowanie do OUN. Jest to nieinwazyjna metoda, która wymaga minimalnego przeszkolenia i umiejętności oraz prostego sprzętu - skalibrowanej mikropipety i kilku jednorazowych końcówek. Objętości podawane szczurom nie powinny przekraczać 40-100 mikrolitrów podanych w kroplach po 6-10 mikrolitrów. A dla myszy maksymalna całkowita objętość to 24 mikrolitry podane w kroplach 3-4 mikrolitrów.

Chociaż znieczulenie nie jest wymagane do tej procedury, ma pewne zalety w porównaniu z podawaniem donosowym u zwierząt przytomnych 1) ułatwia prawidłowe umieszczenie związku w nozdrzach, zapewniając dokładne dawkowanie 2) eliminuje możliwość ugryzienia przez zwierzę sprzętu dozującego 3) zapewnia, że nie dojdzie do uszkodzenia tkanki nosowej zwierzęcia, oczu, lub skóra twarzy z powodu szarpania głową, oraz 4) zwierzę jest mniej skłonne do parskania i rozpylania związku z nozdrzy po podaniu.

Wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowe u dorosłych myszy i szczurów wykorzystują sprzęt stereotaktyczny, co opisano w filmie z kolekcji "Essentials of Neuroscience". Sprzęt zapewnia prawidłowe ustawienie i prawidłową głębokość wtrysku. Tutaj skupimy się na porodzie wewnątrzczaszkowym u noworodków myszy i szczurów, u których czaszka jest wystarczająco cienka, aby wstrzyknąć ją bezpośrednio przez nią i może być zbyt delikatna, aby utrzymać urządzenie stereotaktyczne. Głównym celem tej techniki jest dostarczanie środków farmakologicznych OUN bezpośrednio do OUN i unikanie skutków występujących jakąkolwiek drogą ogólnoustrojową. Rozstaw igieł, długość i objętość podawania określa się na podstawie gatunku i wieku młodych. Należy pamiętać, że wraz ze wzrostem wieku zwierzęcia zmniejsza się liczba wskaźnika, zwiększa się wymagana długość igły, a także zwiększa się maksymalna zalecana objętość podawania.

Mając na uwadze te podstawowe informacje, zagłębmy się w procedury tych metod iniekcji. Pierwszą z nich jest technika podawania śródskórnego. Zabieg ten musi być wykonywany u zwierząt znieczulonych. Obejrzyj inny film z tej kolekcji, aby zrozumieć procedury indukcji i konserwacji znieczulenia.

Po znieczuleniu zwierzęcia należy ogolić miejsce wstrzyknięcia za pomocą elektrycznej maszynki do golenia lub kremu do depilacji. Za pomocą gazy zwilżonej wodą dokładnie usuń zalegające włosy z tego miejsca. Następnie za pomocą innego gazika nałóż miejscowy roztwór antyseptyczny na ogolony obszar. Przed podaniem należy najpierw ustabilizować skórę w miejscu wstrzyknięcia, rozciągając ją między kciukiem a palcem wskazującym.

Teraz umieść igłę skośną do góry na skórze i delikatnie włóż ją tuż za skos, tak aby otwór znajdował się między warstwami naskórka a skórą właściwą. Następnie wstrzykuj powoli i zwróć uwagę, że tworzy się pęcherzyk na skórze. Jeśli igła zostanie włożona zbyt głęboko, nie powstanie pęcherzyk. Po wstrzyknięciu należy zrobić przerwę, aby skóra mogła się rozciągnąć i dostosować, a następnie powoli wyjąć igłę. W żadnym momencie nie należy odciągać tłoka, ponieważ mogłoby to spowodować wciągnięcie tkanki i spowodowanie urazu w miejscu wstrzyknięcia. Nie należy również wycierać ani osuszać miejsca wstrzyknięcia, ponieważ może to spowodować wyciek wstrzykniętej substancji. W przypadku wykonywania wielokrotnych wstrzyknięć należy pamiętać o rozstawieniu ich na tyle szeroko, aby pęcherzyki nie zachodziły na siebie.

Następnie dowiedzmy się, jak wygląda procedura podawania donosowego u zwierząt przytomnych i znieczulonych.

W przypadku obudzonych zwierząt należy je powstrzymać, potrząsając skórą na karku, a następnie przytrzymać zwierzę w pozycji pionowej z unieruchomioną głową. Należy uważać, aby nie uciskać klatki piersiowej, ponieważ może to utrudnić zwierzęciu wykonywanie wystarczająco głębokich oddechów, aby wciągnąć płyn do płuc. Za pomocą mikropipety podać część roztworu, umieszczając małą kroplę płynu w otworze nosowym. Zwierzę będzie wdychać kropelkę. Powtórz ten proces, naprzemiennie między dwoma otworami nosowymi, aż zostanie podana cała objętość, która ma być podana. Przypomnienie - całkowita objętość podania nie powinna przekraczać 24 μl i 100 μl odpowiednio u myszy i szczurów.

W przypadku znieczulonych myszy i szczurów należy umieścić zwierzę w pozycji leżącej grzbietowej. Ta pozycja jest idealna do dostarczania do OUN, ponieważ pozwala na lepsze wchłanianie związku. Obróć głowę zwierzęcia i podaj połowę związku bezpośrednio po jednej stronie otworu nosowego, zsynchronizowując to z inhalacją. Następnie obróć głowę zwierzęcia do pozycji do następnego podania. Po około 2 oddechach podaj pozostałą objętość do drugiego otworu nosowego. Po całkowitym podaniu zwierzę należy umieścić z powrotem w klatce.

Następnie przyjrzyjmy się procedurze podawania wewnątrzczaszkowego noworodkom myszy i szczurów. Przed rozpoczęciem zabiegu umieść klatkę ze szczeniętami i zaporą na elektrycznej poduszce grzewczej ustawionej na niski poziom. Upewnij się, że część klatki znajduje się poza poduszką grzewczą. Ma to na celu zapobieżenie hipotermii, a jednocześnie umożliwienie zaporze odsunięcia się od ciepła, jeśli sobie tego życzy. Następnie wybierz rozstaw igieł odpowiedni do wieku zwierzęcia. Przypomnij sobie, miernik igieł; długość igły, która służy do kontrolowania głębokości igły podczas wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego; i objętość administracji... Wszystkie różnią się w zależności od wieku i gatunku zwierzęcia.

Długość regulowana jest za pomocą osłony. Aby przygotować tę osłonę, przyłóż właściwą igłę do jej nasadki i zaznacz ją. Następnie umieść drugi znak na nasadce, aby wskazać, gdzie zostanie wycięta. Odległość między dwoma znakami to pożądana długość igły. Następnie odetnij nakrętkę żyletką. Nie używaj nożyczek, ponieważ zmiażdżą one nasadkę i nie zapewnią czystego, równego cięcia. To jest "osłona przed igłami". Wyrzuć igłę użytą do stworzenia osłony, ponieważ nie jest ona już sterylna, a zamiast tego włóż nową igłę do osłony i upewnij się, że odsłonięta jest odpowiednia długość. Następnie, za pomocą innej igły przymocowanej do odpowiedniej strzykawki, pobrać substancję do wstrzykiwań. Do tego celu używa się innej igły, ponieważ umieszczenie w korku znacznie stępi te drobne igły, co nie jest idealne do podawania wewnątrzczaszkowego. Następnie umieścić napełnioną strzykawkę na igle z osłoną. Teraz system jest gotowy do wstrzyknięcia.

W przypadku szczeniąt powyżej 10 dnia życia należy podawać znieczulenie wziewne. Szczenięta w wieku poniżej 10 dni nie muszą być znieczulane. Aby wykonać wstrzyknięcie, należy najpierw zlokalizować miejsce, które znajduje się 5 mm za okiem i około 3 mm od linii środkowej czaszki. Następnie wprowadzić igłę na głębokość dozwoloną przez osłonę igły. Następnie należy wstrzykiwać powoli, równomiernie, aby uniknąć urazu mózgu. Natychmiast i z dużą ostrożnością należy usunąć igłę, aby zapobiec uszkodzeniu tkanki mózgowej. Na koniec umieść zwierzę z powrotem w tamie, aby umożliwić mu prawidłową regenerację.

Przyjrzyjmy się teraz niektórym eksperymentom przeprowadzanym obecnie w laboratoriach, które wykorzystują te rzadkie drogi podawania.

Wstrzyknięcie śródskórne jest często stosowane do badania reakcji zapalnej skóry. W tym eksperymencie naukowcy wykorzystali tę metodę do wstrzyknięcia alergenu do jednego ucha i neutralnej substancji do drugiego ucha wstępnie uczulonej myszy. Następnie dostarczyli niebieski barwnik do układu krążenia zwierzęcia, aby zbadać zmiany w przepuszczalności naczyń krwionośnych spowodowane wstrzyknięciem alergenu.

Jak wspomniano wcześniej, jednym z zastosowań podawania donosowego jest podawanie szczepionek. W tym przypadku naukowcy wykorzystali tę drogę do dostarczenia genetycznie zmodyfikowanej, żywej atenuowanej szczepionki przeciw grypie myszom typu dzikiego i transgenicznego oraz zbadali odporność błony śluzowej poprzez produkcję określonego typu limfocytów T.

Wreszcie, w tych badaniach biomedycznych wykorzystano podawanie wewnątrzczaszkowe do wszczepienia komórek rakowych myszom z obniżoną odpornością, w celu stworzenia modelu guza ludzkiego mózgu. Skuteczność wstrzyknięcia została następnie przeanalizowana za pomocą systemu obrazowania in vivo.

Obejrzałeś już film JoVE na temat niektórych specjalnych metod podawania związków u myszy laboratoryjnych i szczurów. Powinien Pan/Pani teraz zrozumieć, kiedy te procedury są pomocne, o czym należy pamiętać przed i w trakcie wykonywania tych technik, a także niezbędne kroki proceduralne w celu zapewnienia, że podanie ma minimalny wpływ na zdrowie zwierzęcia i na dane doświadczalne, które mają być zebrane. Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!