Hodowla kryształów do analizy dyfrakcji rentgenowskiej
Źródło: Laboratorium dr Jimmy'ego Franco - Merrimack College
Krystalografia rentgenowska to metoda powszechnie stosowana do określania przestrzennego…
1. Przygotowanie rurki kryształowej i filtra
- Umieścić probówkę NMR w kolbie Erlenmeyera.
- Przygotuj filtr do pipet.
- Skonstruuj filtr, umieszczając kawałek niestrzępiącej się chusteczki (1 cal na 1 cal) w pipecie, a następnie użyj pręta, aby mocno zaklinować chusteczkę w części pipety z szyjką butelki (Rysunek 1).
- Wykonaj dwa filtry do pipet na każdą potrzebną rurkę kryształową.
2. Dodawanie próbki do probówki kryształowej
- Rozpuścić związek (tetrafenyloporfiryna, 10 mg) w 0,75 ml rozpuszczalnika (dichlorometanu).
- Za pomocą pipety delikatnie dodaj mieszaninę do górnej części probówki, przepuszczając ją przez filtr.
- Cząstki są odfiltrowywane, aby uniknąć tworzenia miejsc zarodkowania, co może prowadzić do powstania małych wielokrotnych kryształów zamiast pożądanych większych monokryształów.
- Po umieszczeniu próbki w kryształowej probówce, bardzo powoli i delikatnie, dodaj antyrozpuszczalnik (1,5 ml metanolu) do probówki za pomocą nowej pipety filtrującej. Pozwolić, aby antyrozpuszczalnik powoli nakładał się na poprzednio dodany roztwór (Rysunek 2). Nie używaj gruszki do przepychania rozpuszczalnika przez pipetę, zamiast tego pozwól, aby rozpuszczalnik sam przepłynął przez filtr.
- Upewnij się, że najpierw do rurki kryształowej dodano rozpuszczalnik o większej gęstości.
- Sprawdź, czy oba rozpuszczalniki mieszają się ze sobą. Odbywa się to przed dodaniem rozpuszczalnika.
- Uszczelnij probówkę nasadką NMR.
3. Wzrost kryształów
- Nie powodując wymieszania dwóch rozpuszczalników, umieść rurkę kryształową (probówki) kryształową w szafce, w której nie będą zakłócane.
- Czas krystalizacji będzie się różnił w zależności od związku - zazwyczaj rurki kryształowe należy pozostawić w spokoju przez tydzień.
- Po tygodniu sprawdź probówki pod kątem wzrostu kryształów.
- Wzrost kryształów zwykle zachodzi na granicy dwóch rozpuszczalników.
- Sprawdź wzrokowo probówki pod kątem śladów wzrostu kryształów. Należy uważać, aby nie ułatwiać mieszania rozpuszczalników, w przypadku, gdy związek wymaga dodatkowego czasu na utworzenie się kryształów.
- Jeśli okaże się, że nastąpił wzrost kryształów, należy dalej sprawdzić probówki za pomocą mikroskopu.
4. Wybór kryształów
- Kryształy dyfrakcyjne promieniowania rentgenowskiego powinny mieć dobrze zdefiniowane powierzchnie.
- Jeśli to możliwe, należy unikać kryształów, które zgrupowały się razem.
- Pozostaw kryształy w kryształowej tubie do czasu, aż będą gotowe do zebrania kryształu, bezpośrednio przed umieszczeniem kryształu na dyfraktometrze.
- Utrzymanie kryształów w probówce zapewni, że kryształy pozostaną rozpuszczone. Desolwatacja może powodować pękanie kryształów i utrudniać dyfrakcję kryształu.
Rysunek 1. Obraz filtra pipet. Mały kawałek niestrzępiącej się chusteczki został mocno zaklinowany w szyjce butelki pipety. Roztwory są przepuszczane przez te filtry pipet przed wprowadzeniem do rurki kryształowej.
Rysunek 2. Po umieszczeniu roztworu zawierającego docelowy związek w kryształowej probówce, antyrozpuszczalnik jest powoli nakładany na wierzch, przepuszczając go przez nowy filtr pipetowy.
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Do określenia jego struktury wymagany jest monokryształ. Jakość kryształu ma duży wpływ na jakość i dokładność określenia strukturalnego.
Pojedynczy kryształ to ciało stałe, w którym układ cząsteczek powtarza się we wszystkich trzech wymiarach. Przestrzenny układ atomów w krystalicznym ciele stałym można określić za pomocą krystalografii rentgenowskiej. W tej technice czysta krystaliczna próbka jest otoczona wiązką promieni rentgenowskich. Kryształ załamuje promienie rentgenowskie w charakterystyczny wzór związany ze strukturą kryształów i składem molekularnym. Jeśli kryształ zostanie utworzony zbyt szybko, cząsteczki mogą być nieuporządkowane, zanieczyszczenia mogą zostać włączone do kryształu lub mogą powstać dwa lub więcej stopionych kryształów zamiast pojedynczego kryształu. Dlatego potrzebne są specjalistyczne metody z naciskiem na powolny wzrost, aby wytworzyć kryształy o jakości wystarczającej do krystalografii rentgenowskiej.
Ten film zilustruje pożądane cechy kryształów o jakości rentgenowskiej, zademonstruje procedurę ich hodowli oraz przedstawi kilka zastosowań tej techniki w chemii.
Elektrony rozpraszają promieniowanie rentgenowskie, emitując sferyczną falę promieniowania rentgenowskiego po uderzeniu. Jeśli atomy są w uporządkowanym układzie, konstruktywna interferencja między falami wytwarza charakterystyczny wzór dyfrakcyjny na detektorze promieniowania rentgenowskiego. Kryształ jest obracany w wiązce, aby zebrać wzory dyfrakcyjne pod różnymi kątami. Przy wystarczających wzorach dyfrakcyjnych można wyprowadzić strukturę molekularną.
Kryształy o jakości rentgenowskiej zazwyczaj tworzą symetryczne kształty i mają gładkie, odbijające światło powierzchnie. Oglądane pod mikroskopem polaryzacyjnym będą przezroczyste, ale większość z nich powinna stać się ciemna po obróceniu o 90°. Wskazuje to na wysoce uporządkowaną strukturę. Aby wyhodować te kryształy, często stosuje się dyfuzję ciecz-ciecz. Wykorzystuje się w tym celu dwa mieszające się rozpuszczalniki: rozpuszczalnik o niskiej gęstości lub środek strącający, w którym związek, który ma być rekrystalizowany, jest nierozpuszczalny; oraz rozpuszczalnik o dużej gęstości, w którym związek jest rozpuszczalny. Zazwyczaj stosunek objętościowy środka strącającego do rozpuszczalnika wynosi 2:1.
Środek strącający o małej gęstości jest nakładany warstwami na stężony roztwór związku w rozpuszczalniku o dużej gęstości. Z biegiem czasu związek staje się mniej rozpuszczalny, ponieważ środek strącający miesza się z roztworem. Mniejszy interfejs rozpuszczalnika powoduje wolniejsze tempo dyfuzji, co daje większe, czystsze kryształy. Teraz, gdy rozumiesz zasady hodowli kryształów o jakości rentgenowskiej, przejdźmy przez procedurę ich hodowli przez dyfuzję ciecz-ciecz.
Aby rozpocząć, zdobądź niezbędny sprzęt znajdujący się w protokole tekstowym. Zaopatrz się w rozpuszczalnik dla związku i mniej gęsty środek strącający.
Aby przygotować filtr do pipet, umieść mały kawałek Kimwipe w górnej części szklanej pipety i delikatnie dociśnij papier do dolnej części korpusu pipety za pomocą pręta lub trzpienia innej pipety, uważając, aby nie przebić papieru. Przygotuj dwa filtry do pipet. Umieść jeden w probówce NMR. W razie potrzeby zabezpiecz zespół za pomocą laboratoryjnego clamp i stojak pierścieniowy. Rozpuścić około 10 mg związku przeznaczonego do rekrystalizacji w 0,75 ml rozpuszczalnika.
Teraz ostrożnie dodaj roztwór próbki do filtra pipetowego. Przymocuj bańkę do góry i powoli ściskaj, aby przepuścić roztwór do probówki NMR w celu usunięcia zanieczyszczeń stałych. Nie pozwól, aby żarówka ponownie się rozszerzyła, gdy jest podłączona, ponieważ ssanie spowoduje przemieszczenie bibuły filtracyjnej.
Następnie wyjmij zużyty filtr pipetowy i umieść drugi filtr w probówce NMR. Odpipetować około 1,5 ml środka strącającego do probówki. Pozwolić, aby rozpuszczalnik przeszedł przez filtr grawitacyjnie. Od teraz uważaj, aby nie przeszkadzać filtrowi podczas jakichkolwiek manipulacji. Gdy cały środek strącający przefiltruje się do probówki, wyjmij filtr i zakryj rurkę. Umieść go w szafce lub innym łatwym do sprawdzenia miejscu, w którym nie będzie poruszany.
Po co najmniej jednym dniu sprawdź probówki pod kątem wzrostu kryształów.? Jeżeli nie ma żadnych kryształów lub kryształy są bardzo małe, należy pozostawić probówkę z próbką w spokoju. Jeśli kryształy są widoczne, sprawdź ich rozmiar i kształt, nie naruszając warstw rozpuszczalnika.
Jeśli kryształy są duże, dobrze zdefiniowane i nie są zgrupowane razem, sprawdź kryształy pod mikroskopem, aby zweryfikować ich potencjał jako jakość promieniowania rentgenowskiego. Nie wyjmuj kryształów z probówki, dopóki dyfraktometr nie będzie gotowy do rozpoczęcia skanowania. Jeśli cząsteczki rozpuszczalnika zostaną włączone do struktury kryształu, pozostawienie kryształu do wyschnięcia spowoduje degradację kryształu. Za pomocą krystalografii rentgenowskiej potwierdzono, że struktura molekularna tych ciemnoczerwono-fioletowych kryształów to tetrafenyloporfiryna.
Krystalografia rentgenowska jest podstawowym narzędziem analitycznym w chemii i biochemii.
Metody rekrystalizacji obejmują ogrzewanie i chłodzenie, dyfuzję ciecz-ciecz, dyfuzję pary i powolne parowanie. Podczas powolnego odparowywania pojedynczego układu rozpuszczalnikowego związek rozpuszcza się w niewielkiej ilości rozpuszczalnika i umieszcza w pojemniku z małym otworem w nakrętki. Gdy rozpuszczalnik odparowuje, stężenie wzrasta, aż związek zacznie krystalizować.
Funkcjonalność białek jest często związana z ich budową. Jednak białka mogą być bardzo trudne do krystalizacji. Konieczne jest opracowanie specjalistycznych technik hodowli kryształów białek o jakości rentgenowskiej. Tutaj kroplę roztworu białkowego miesza się z kroplą środka strącającego i mieszaninę tę zamyka się w komorze z czystym środkiem strącającym. Gdy para rozpuszczalnika dyfunduje z kropli, rozpuszczalność białka w kropli zmniejsza się, a białko powoli krystalizuje. Inna technika polega na mieszaniu roztworu białka i środka strącającego pod olejem mineralnym. Za pomocą tych technik można skrystalizować różne białka do analizy.
W dyfrakcji proszkowej każda możliwa orientacja przestrzenna jest reprezentowana w próbce jednocześnie. Dyfrakcja proszkowa nie jest tak pouczająca o strukturze, jak dyfrakcja promieniowania rentgenowskiego monokryształu ze względu na utratę trójwymiarowych danych o strukturze. Zamiast tego dyfrakcja proszkowa doskonale sprawdza się w analizie mieszanin krystalicznych ciał stałych i ocenie krystaliczności struktur amorficznych.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do hodowli kryształów do krystalografii rentgenowskiej. Powinieneś teraz zapoznać się z właściwościami kryształów o jakości rentgenowskiej, procedurą ich hodowli oraz kilkoma zastosowaniami tej techniki w chemii.
Dzięki za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What makes a crystal suitable for X-ray diffraction analysis?
X-ray-quality crystals form symmetric shapes with smooth, light-reflecting faces. Under a polarizing microscope, they appear transparent but turn dark when rotated 90 degrees, indicating highly ordered molecular arrangement. This ordered structure is essential because crystal quality directly influences the accuracy of structural determination in X-ray crystallography.
Q2: Why does slow crystal growth produce better results for X-ray analysis?
Rapid crystal formation causes molecular disorder, incorporates impurities, or creates fused crystals instead of single crystals. Slow growth allows molecules to arrange orderly and prevents contamination. A smaller solvent interface during liquid-liquid diffusion reduces the diffusion rate, yielding larger, purer crystals suitable for X-ray crystallography.
Q3: How does liquid-liquid diffusion work in crystal growth?
Liquid-liquid diffusion uses two miscible solvents: a low-density precipitant where the compound is insoluble, and a high-density solvent where it dissolves. The precipitant is layered onto the concentrated compound solution. As the precipitant gradually mixes with the solution, the compound becomes less soluble, causing slow, controlled crystallization that produces high-quality crystals.
Q4: What is the role of the pipette filter in the crystal growth procedure?
The pipette filter removes solid impurities from the compound solution before crystallization begins. A small piece of Kimwipe is placed in the glass pipette and pressed to the bottom. The sample solution passes through the filter by gentle bulb pressure, ensuring only pure dissolved compound enters the NMR tube for clean crystal formation.
Q5: How does X-ray crystallography determine molecular structure?
When X-rays hit a crystal with ordered atoms, electrons scatter the rays, producing constructive interference and a characteristic diffraction pattern. The crystal is rotated to collect patterns from multiple angles. With sufficient diffraction data, the three-dimensional spatial arrangement of atoms can be derived, revealing the molecule's complete structure and composition.
Q6: What alternative methods can be used to grow X-ray-quality crystals?
Besides liquid-liquid diffusion, recrystallization methods include vapor diffusion, slow evaporation, and heating-cooling cycles. In slow evaporation, the compound dissolves in solvent in a container with a small hole; as solvent evaporates, concentration increases until crystallization occurs. Protein crystallization often requires specialized techniques like purifying compounds by recrystallization under mineral oil.
Q7: Why is single-crystal X-ray diffraction preferred over powder diffraction?
Single-crystal X-ray diffraction preserves three-dimensional structural information because each crystal orientation is distinct. Powder diffraction loses this spatial data since all possible orientations exist simultaneously in the sample. While powder diffraction excels at analyzing crystalline mixtures and assessing amorphous structure crystallinity, single-crystal methods provide superior structural detail for determining molecular shape.