Chromatografia kolumnowa
Źródło: Laboratorium dr Jimmy'ego Franco - Merrimack College
Chromatografia kolumnowa jest jedną z najbardziej użytecznych technik oczyszczania związk…
1. Zawiesina z żelu krzemionkowego
- Wlać żel krzemionkowy do kolby Erlenmeyera. Masa materiału opakowaniowego powinna być około 50 razy większa niż masa oddzielanej próbki. Jeśli rozdzielane związki mają bardzo podobne wartości Rf, może to wymagać użycia większej ilości krzemionki na próbkę, co ma miejsce w tym przykładzie.
- Umieścić 10 g krzemionki w kolbie Erlenmeyera, ponieważ izoluje się 50 mg próbki (45 mg fluorenonu i 5 mg tetrafenyloporfiryny).
- Dodać roztwór rozpuszczalnikowy (heksan/dichlorometan, 70%: 30%) do kolby Erlenmeyera zawierającej żel krzemionkowy. Dodaj tyle rozpuszczalnika, aby upewnić się, że cały żel krzemionkowy jest dobrze rozwiązany. Krzemionka nie rozpuści się, ale mieszanina będzie wizualnie zauważalna po solwatacji. Po dodaniu rozpuszczalnika zakręcić kolbą Erlenmeyera, aby upewnić się, że cała krzemionka jest dobrze rozpuszczona.
2. Przygotowanie kolumny
- Wybierz kolumnę o odpowiednim rozmiarze. Zazwyczaj kolumna powinna być wypełniona mniej więcej do połowy zawiesiną żelu krzemionkowego. Im większa próbka jest oczyszczana, tym większa wymagana jest kolumna.
- Zatkaj spód kolumny kawałkiem waty szklanej. Za pomocą długiego pręta upewnij się, że wełna jest mocno osadzona w dolnej części kolumny tuż nad kurkiem.
- Gdy wełna jest już mocno osadzona, nałóż cienką warstwę piasku na wełnę szklaną.
Uwaga: Jeśli kolumna jest wyposażona w frytę szklaną nad kurkiem, ten krok należy pominąć. - Clamp kolumnę w pozycji pionowej do stojaka pierścieniowego.
- Za pomocą lejka delikatnie wlej przygotowaną zawiesinę żelu krzemionkowego do kolumny. Może być konieczne dodanie dodatkowego rozpuszczalnika w celu przeniesienia zawiesiny z kolby Erlenmeyera do kolumny. Za pomocą pipety zmyj żel krzemionkowy, który przykleja się do boków kolumny.
- Gdy żel krzemionkowy osiada w kolumnie, delikatnie postukaj w boki kolumny, aby upewnić się, że żel krzemionkowy jest szczelnie upakowany i wyklucza wszelkie pęcherzyki powietrza.
- Otworzyć zawór odcinający i pozwolić, aby rozpuszczalnik spłynął do czystej kolby Erlenmeyera, aż do momentu, gdy żel krzemionkowy spotka się z czołem rozpuszczalnika. Żel krzemionkowy nigdy nie powinien wyschnąć, dopóki procedura nie zostanie zakończona.
- Umieść cienką warstwę piasku na wierzchu żelu krzemionkowego (Rysunek 1). Za pomocą pipety zmyj piasek, który mógł przykleić się do boków kolumny.
- Spuść dodatkowy rozpuszczalnik, aż piasek wyschnie, ale nie do warstwy żelu krzemionkowego.
Rysunek 1. Właściwe ustawienie do eksperymentu z chromatografią kolumnową przed dodaniem próbki.
3. Dodawanie próbki do kolumny
- Rozpuścić próbkę w możliwie najmniejszej ilości rozpuszczalnika (przy użyciu tego samego rozpuszczalnika, który został użyty do wytworzenia zawiesiny żelu krzemionkowego).
- Za pomocą pipety delikatnie dodaj próbkę do górnej części kolumny.
- Po nałożeniu próbki na górną część kolumny należy otworzyć zawór odcinający i pozwolić rozpuszczalnikowi spłynąć przez warstwę piasku, ale nie przez warstwę żelu krzemionkowego. Użyj bardzo małej ilości rozpuszczalnika, aby zmyć próbkę, która mogła przylgnąć do ścianek kolumny. Spuść również ten dodatkowy rozpuszczalnik przez warstwę piasku.
4. Płukanie próbki przez kolumnę
- Za pomocą pipety bardzo delikatnie dodaj 4–5 ml rozpuszczalnika w taki sposób, aby nie naruszyć warstwy piasku.
- Umieść lejek w górnej części kolumny i bardzo powoli i delikatnie napełnij pozostałą część kolumny rozpuszczalnikiem.
- Otwórz zawór odcinający i pozwól, aby rozpuszczalnik spłynął przez kolumnę.
- Rozpocznij zbieranie fazy ruchomej, gdy spływa ona z kolumny do probówek.
- Probówki należy umieszczać w stojaku na probówki w sposób sekwencyjny.
- W razie potrzeby dodaj dodatkowy rozpuszczalnik do górnej części kolumny, aż wszystkie pożądane związki zostaną wyeluowane z kolumny.
5. Odzyskiwanie składników
- Jeśli związki są kolorowe, można je zidentyfikować wizualnie. Jeśli jednak związki są bezbarwne, będą musiały zostać zidentyfikowane za pomocą światła widzialnego (UV) (jeśli związki zawierają koniugację) lub za pomocą odpowiedniego barwnika. Czystość związków można zweryfikować za pomocą chromatografii cienkowarstwowej.
- Zidentyfikuj probówki, które zawierają pożądany związek (związki).
- Połączyć wszystkie frakcje, które zawierają pożądany wyizolowany związek(-i), do wstępnie zważonej kolby okrągłodennej (RB). Zrób to dla każdego izolowanego związku.
- Odparować rozpuszczalnik, umieszczając kolbę RB na wyparce obrotowej.
- Po usunięciu całego rozpuszczalnika zważyć RB z wysuszonym produktem i odjąć początkową masę RB w celu uzyskania wydajności.
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Chromatografia kolumnowa to wszechstronna metoda oczyszczania stosowana do rozdzielania związków w roztworze. Mieszanina roztworu jest przenoszona przez rozpuszczalnik przez kolumnę zawierającą adsorbcję ciała stałego, zwaną fazą stacjonarną. Połączona mieszanina rozpuszczalnika i próbki nazywana jest fazą ruchomą.
Cząsteczki w fazie ruchomej przemieszczają się przez kolumnę z różną szybkością w zależności od ich właściwości chemicznych i powinowactwa do fazy stacjonarnej. W ten sposób każdy związek opuszcza kolumnę w innym czasie. Po oddzieleniu i oczyszczeniu związki mogą być dalej przetwarzane lub są gotowe do dystrybucji. W tym filmie przedstawimy podstawy chromatografii kolumnowej, a następnie zademonstrujemy technikę oczyszczania związków organicznych.
W chromatografii kolumnowej cząsteczki odwracalnie adsorbują się do fazy stacjonarnej podczas przepływu przez kolumnę, spowalniając w ten sposób swój postęp. Związki, które słabo oddziałują z fazą stacjonarną, szybciej opuszczają kolumnę lub eluują. Związki, które silnie oddziałują z fazą stacjonarną, wolniej się eluują. Faza stacjonarna to adsorbujący proszek lub żel, taki jak żel krzemionkowy lub tlenek glinu. Żel krzemionkowy i tlenek glinu są wysoce polarne, więc silnie oddziałują ze związkami polarnymi i rozpuszczalnikami, a słabo z cząsteczkami niepolarnymi. Faza stacjonarna jest ładowana do kolumny jako zawiesina z rozpuszczalnikiem, a następnie jest pakowana przez przepływający rozpuszczalnik przez fazę stacjonarną. Faza stacjonarna po prawidłowym upakowaniu jest jednorodna od góry do dołu i nie zawiera pęcherzyków powietrza ani suchych plam, ponieważ nierównomierny przepływ spowodowany tymi nierównościami zakłóca rozdzielanie związków. Rozpuszczalnik lub eluent jest zazwyczaj rozpuszczalnikiem organicznym dostarczanym ze zbiornika. Ogólnie rzecz biorąc, rozpuszczalniki niepolarne eluują tylko związki niepolarne, podczas gdy rozpuszczalniki polarne eluują zarówno związki polarne, jak i niepolarne. Jeśli mieszanina zawiera związki o znacznie różniącej się polarności, do wymycia wszystkich interesujących nas związków można użyć szeregu coraz bardziej polarnych rozpuszczalników. Natężenie przepływu fazy ruchomej jest zwykle kontrolowane przez kran znajdujący się w dolnej części kolumny. Przerwy w przepływie są ograniczone do minimum, aby uniknąć dyfuzji związków. Faza ruchoma opuszczająca kolumnę, zwana eluatem, jest zbierana we frakcje, aby zachować separację związków. Teraz, gdy rozumiesz zasady chromatografii kolumnowej, przejdźmy przez procedurę oczyszczania mieszaniny związków organicznych.
Aby rozpocząć procedurę, zaopatrz się w sprzęt zgodnie z opisem w tekście. Zważyć kolbę okrągłodenną dla każdego związku, który ma być wyizolowany, i zapisać masę. Następnie zważyć próbkę i rozpuścić ją w minimalnej wymaganej objętości rozpuszczalnika. Odpowiedni rozpuszczalnik powinien być wstępnie określony za pomocą chromatografii cienkowarstwowej. Wartość Rf powinna mieścić się w przedziale 0,2?0,3. Następnie należy określić ilość żelu krzemionkowego wymaganą do fazy stacjonarnej w oparciu o suchą masę próbki i różnicę w odległości migracji związków będących przedmiotem zainteresowania na podstawie wstępnego badania przesiewowego TLC. Wlać odpowiednią ilość żelu krzemionkowego do kolby Erlenmeyera. Dodać rozpuszczalnik do żelu krzemionkowego, aż zawiesina stanie się przezroczysta i będzie się swobodnie poruszać, gdy kolba jest wirowana. Następnie wybierz kolumnę na tyle dużą, aby żel krzemionkowy wypełnił ją do połowy. Jeśli kolumna nie ma fryty szklanej, umieść w niej watę szklaną i mocno dociśnij ją do dna długim prętem. Przykryj watę szklaną około 2 cm piasku, aby zapobiec przedostawaniu się krzemionki przez wełnę szklaną. W okapie wyciągowym ?clamp kolumnę do stojaka pierścieniowego, pozostawiając wystarczająco dużo miejsca poniżej, aby pomieścić probówki.
Umieść lejek w kolumnie i upewnij się, że kran jest zamknięty. Wlej gnojowicę do kolumny, delikatnie stukając w boki, gdy gnojowica osiada, aby wykluczyć pęcherzyki powietrza. Przepłukać lejek, kolbę i ścianki kolumny rozpuszczalnikiem, aby przenieść cały żel do kolumny.
Umieścić kolbę Erlenmeyera pod kolumną. Otwórz zawór odcinający i pozwól, aby rozpuszczalnik spłynął do kolby, aż poziom rozpuszczalnika znajdzie się tuż powyżej żelu krzemionkowego, a następnie zamknij kran. Na żel wsypać około 2 cm piasku. Delikatnie spłucz piasek przyklejony do boków kolumny rozpuszczalnikiem. W razie potrzeby odcedź rozpuszczalnik, aby piasek był w większości suchy, ale krzemionka pozostała całkowicie pokryta.
Aby rozpocząć rozdzielanie, dodaj próbkę do kolumny, nie naruszając piasku. Za pomocą małych porcji rozpuszczalnika należy spłukać próbkę przylegającą do ścianek kolumny i wypłukać pojemnik na próbkę. Ostrożnie spuść rozpuszczalnik, aż poziom znajdzie się tuż powyżej krzemionki. Następnie za pomocą pipety delikatnie dodaj 4?5 ml rozpuszczalnika, nie naruszając warstwy piasku. Umieść lejek w kolumnie i powoli napełniaj rozpuszczalnikiem. Wyjąć kolbę i zastąpić ją opisaną probówką. Po umieszczeniu pierwszej probówki otwórz kran i zbieraj eluat, aż probówka będzie prawie pełna.
Kontynuuj zbieranie frakcji, aż wszystkie pożądane związki zostaną wymyte, przechodząc kolejno przez znakowane probówki. Po zakończeniu zamknij kurek.
Dla każdego wyizolowanego związku połączyć czyste frakcje w wstępnie zważonej kolbie okrągłodennej. Usunąć rozpuszczalnik z kolby na wyparce obrotowej, a następnie zważyć kolbę okrągłodenną zawierającą suchy związek. Aby uzyskać więcej informacji, zobacz film z tej kolekcji na temat parowania obrotowego.
Próbka ta zawierała mieszaninę tetrafenyloporfiryny lub TPP i fluorenonu. Najpierw wymywano ciemnoczerwono-fioletowy TPP, a następnie żółty fluorenon. Czystość każdego wyizolowanego związku potwierdzono za pomocą spektroskopii NMR.
Chromatografia kolumnowa jest stosowana w oczyszczaniu i analizie w różnych dziedzinach nauki.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) jest formą chromatografii kolumnowej, która zapewnia doskonałą separację między związkami i może zawierać specjalistyczne detektory, takie jak detektor promieniowania dla cząsteczek znakowanych radioaktywnie. Za pomocą HPLC znakowany radioaktywnie fosfolipid można łatwo wyizolować z mieszaniny wielu innych, nawet jeśli stanowi niewielki procent mieszaniny. Informacje te mogą pomóc w wyjaśnieniu produkcji, regulacji i funkcji wielu ważnych biomolekuł.
Chromatografia flash jest odmianą chromatografii kolumnowej, w której faza ruchoma przepływa przez kolumnę pod ciśnieniem powietrza lub gazu, a nie przez sam przepływ grawitacyjny.
Zapewnia to szybsze natężenie przepływu, minimalizując dyfuzję i lepszą separację. Pożądany związek jest zbierany w kilku czystych, skoncentrowanych frakcjach, jak pokazano za pomocą chromatografii cienkowarstwowej, co skutkuje doskonałą wydajnością i czystością po oczyszczeniu.
Zwykły aparat kolumnowy nie nadaje się do rozdzielania małych objętości, ale niektóre mieszaniny nie są kompatybilne ze specjalistycznymi technikami, takimi jak HPLC. Oczyszczanie na małą skalę odbywa się za pomocą szklanych kolumn pipetowych, z bańką pipetową używaną do chromatografii flash na małą skalę. Jest to szczególnie przydatne podczas przygotowywania próbki do specjalistycznych technik oczyszczania lub jako ostatni etap po oczyszczaniu na dużą skalę.
Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do chromatografii kolumnowej. Powinieneś teraz zapoznać się z zasadami chromatografii kolumnowej, procedurą chromatografii kolumnowej z żelem krzemionkowym oraz niektórymi zastosowaniami tej techniki.
Dzięki za oglądanie!
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What is the mobile phase in column chromatography?
The mobile phase is the combined solvent and sample mixture that flows through the column. It carries the dissolved compounds through the stationary phase, allowing separation based on how strongly each molecule interacts with the adsorbent. The solvent used is typically an organic solvent selected based on the polarity of compounds being purified.
Q2: Why do different compounds elute at different times in column chromatography?
Compounds elute at different rates because they interact differently with the stationary phase. Molecules that bind weakly to the adsorbent exit the column quickly, while those with strong interactions elute more slowly. This differential adsorption, based on chemical properties and polarity, enables separation of the mixture into pure fractions.
Q3: What are the most common stationary phases used in column chromatography?
Silica gel and alumina are the two most commonly used stationary phases. Both are highly polar adsorbents that interact strongly with polar compounds and solvents, but weakly with nonpolar molecules. These materials are packed into the column as a slurry and must be properly compacted to ensure homogeneous packing without air bubbles or dry patches.
Q4: How do you prepare the stationary phase before starting column chromatography?
The stationary phase is prepared by mixing the adsorbent powder with solvent to create a slurry that is translucent and moves freely. This slurry is poured into the column and packed by flowing solvent through it. Proper packing ensures the stationary phase is homogeneous from top to bottom with no air bubbles, which is critical for effective separation.
Q5: What role does solvent polarity play in selecting the mobile phase?
Solvent polarity determines which compounds will elute from the column. Nonpolar solvents only elute nonpolar compounds, while polar solvents elute both polar and nonpolar compounds. For mixtures with significantly different polarities, a series of increasingly polar solvents may be used sequentially to elute all compounds of interest.
Q6: How is thin layer chromatography used to prepare for column chromatography?
Thin layer chromatography is used as pre-screening to determine the appropriate solvent and predict separation success. The Rf value should be between 0.2 and 0.3 to ensure good separation. This information helps determine the amount of silica gel needed and guides the selection of the mobile phase solvent for the column.
Q7: What happens after fractions are collected in column chromatography?
Pure fractions are combined in a pre-weighed flask, and the solvent is removed using rotary evaporation to yield the isolated dry compound. The flask is then weighed to determine the mass of purified product. The purity of isolated compounds can be confirmed using analytical techniques such as nuclear magnetic resonance spectroscopy.