Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek ze śledziony myszy z użyciem dysocjatora gentleMACS
11 grudnia 2008
Niniejszy film opisuje prostą i oszczędzającą czas technikę automatycznej dysocjacji tkanek z użyciem dysocjatora gentleMACS w celu przygotowania zawiesin pojedynczych komórek splenocytów mysich.
W tym protokole wideo dowiesz się, jak dysocjować śledziony mysie za pomocą Gentle Max – zautomatyzowanego urządzenia laboratoryjnego, które mechanicznie rozdrabnia tkanki przy użyciu specjalnych probówek w celu uzyskania żywotnych zawiesin komórkowych. Po dysocjacji śledziony są filtrowane za pomocą filtrów separacyjnych Max Pres, wirowane i zawieszane do dalszych zastosowań. Cześć, nazywam się Melanie mlu.
Jestem naukowcem w Milton Biotech w BE Lab Park w Niemczech. Dzisiaj zaprezentuję przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek z rozpylenia myszy przy użyciu zestawu do dysocjacji GenX. Dysocjacja GenX umożliwia bardzo łatwe i szybkie przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek.
Zacznijmy zatem. Aby uniknąć żmudnej i często uciążliwej manualnej dysocjacji, urządzenie gentle max di associator umożliwia bardzo wydajną dysocjację tkanki w kontrolowanych i powtarzalnych warunkach. Tkanka jest delikatnie dysocjowana przy użyciu probówek violet C w celu uzyskania żywotnych zawiesin pojedynczych komórek.
Probówka typu C posiada otwór z uszczelką w centrum zakrętki, co umożliwia pipetowanie z probówki przy jednoczesnym zachowaniu sterylności. Do zawieszenia zdysocjowanych komórek należy użyć odpowiedniego buforu PBS-BSA-EDTA. Bufor przygotowuje się poprzez dodanie jednej części roztworu zapasowego BSA do 20 części roztworu AutoMax fencing zawierającego EDTA.
Dzięki zastosowaniu filtrów separacyjnych Max Pres, zdysocjowane próbki tkanek zostają oczyszczone ze wszystkich grudek komórkowych, co sprzyja maksymalnej separacji i późniejszej analizie. Aby rozpocząć procedurę, do probówki C wlewamy odpowiednią objętość buforu. W zależności od masy śledzion, zdrowa śledziona samicy myszy biopsyjnej w wieku od sześciu do siedmiu tygodni waży około 80 do 120 mg.
Na każde jedną do dwóch śledzion o tej masie wymagane są trzy mililitry buforu. Nie należy przekraczać całkowitej objętości 10 mililitrów. Teraz możemy dodać wyciętą śledzionę do probówki C zawierającej trzy mililitry buforu. Śledziony zwierząt starszych lub zainfekowanych są często większe i muszą zostać zważone w buforze.
Objętości buforów należy następnie odpowiednio przeskalować, jednak ponownie nie mogą one przekroczyć całkowitej objętości 10 milliliters. Teraz należy upewnić się, że zakrętka probówki C jest szczelna, a następnie podłączyć probówkę C do urządzenia do dysocjacji. Przy zakrętce skierowanej w dół, uruchomić dysocjację dla jednej do dwóch śledzion, wybierając Program M spleen oh one. Program potrwa 56 seconds; jeśli liczba śledzion jest większa, należy użyć programu M spleen oh four.
Program ten można stosować dla ilości tkanki śledziony do 720 mg. Po zakończeniu programu natywna tkanka śledziony zostaje rozdzielona do postaci zawiesiny komórek PLE, która wygląda w ten sposób; należy krótko odwirować zawiesinę, aby zebrać próbkę na dnie probówki. Zapewni to oczyszczenie rotora i stojana ze wszystkich komórek, które zostaną zebrane na dnie probówki C.
Próbkę pobieramy przez otwór zamknięty septem w nakrętce rurki C, używając pipety o objętości 1000 µL. Aby rozpocząć etap filtracji, zdysocjowaną tkankę przenosimy na filtr separacyjny lub sito o rozmiarze porów 30 µm. Sito powinno być dopasowane do probówki 15 ml w przypadku jednego lub dwóch śledzion, lub do probówki 50 ml w przypadku więcej niż dwóch śledzion.
Pozwól zawiesinie komórkowej przepłynąć, a następnie przemyj filtr, aplikując 5 mL buforu. Teraz odwirowuj probówkę z zawiesiną komórkową przy 300 Gs w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby zebrać wszystkie komórki w postaci osadu komórek śledziony. Po uzyskaniu osadu dysocjowanych komórek należy odessać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w odpowiedniej ilości buforu do dysocjacji śledziony.
Zastosowanie metody gentle max pozwoli na uzyskanie wysokiego odsetka żywotnych komórek PLE, co zostało wykazane za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem max quant. Martwe komórki są barwione jodkiem propidium, co przedstawiono w podanym przykładzie. Wykres kropkowy rozproszenia światła w przód (forward scatter) przedstawia przygotowane komórki SP. Dobrze.
Przedstawiłem sposób dysocjacji tkanki śledziony przy użyciu urządzenia Gentle X. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest dostosowanie ilości buforu do wielkości próbki oraz wybór odpowiedniego programu Gentle X. To wszystko.
Powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.
Przegląd
Niniejszy protokół wideo prezentuje wydajną technikę zautomatyzowanej dysocjacji tkanek śledziony myszy przy użyciu urządzenia gentleMACS Dissociator. Metoda ta pozwala na uzyskanie żywotnych zawiesin pojedynczych komórek odpowiednich do dalszych zastosowań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- neuronauka
- biologia komórki
- immunologia
Wstęp
- Dysocjacja tkanki jest kluczowa dla uzyskania zawiesin pojedynczych komórek.
- Ręczna dysocjacja może być żmudna i nieefektywna.
- Urządzenie gentleMACS Dissociator zapewnia powtarzalną i kontrolowaną metodę.
- Zawiesiny żywych komórek są niezbędne do dalszych zastosowań.
Cel badania
- Zaprezentowanie techniki dysocjacji tkanek pozwalającej na oszczędność czasu.
- Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z śledziony myszy.
- Zwiększenie wydajności przygotowania komórek do badań.
Zastosowane metody
- Użycie dysocjatora gentleMACS ze specjalistycznymi probówkami.
- Przygotowanie roztworu buforowego do zawiesiny tkankowej.
- Filtracja zdysocjowanej tkanki przy użyciu filtrów separacyjnych Max Pres.
- Wirowanie w celu zebrania osadów żywych komórek.
Główne wyniki
- Efektywna dysocjacja śledzion śry przedniej do postaci zawiesin pojedynczych komórek.
- Wysoki odsetek żywych komórek wykazany w cytometrii przepływowej.
- Skuteczne usunięcie aglutynacji komórkowych w celu zapewnienia dokładnej analizy.
- Powtarzalność wyników dla różnych wielkości próbek.
Wnioski
- Urządzenie gentleMACS Dissociator znacznie upraszcza proces dysocjacji tkanek.
- Prawidłowe przygotowanie buforu jest kluczowe dla uzyskania pomyślnych rezultatów.
- Metodę tę można zastosować do różnych typów tkanek w celu analizy komórkowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Zautomatyzowane przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek zmielonej śledziony myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS rozwiązuje krytyczny problem wąskiego gardła w procesach wczesnego odkrywania leków oraz badaniach immunologicznych. Standaryzowana, powtarzalna dysocjacja umożliwia niezawodną późniejszą separację, analizę i hodowlę komórek, co zwiększa pewność predykcyjną w walidacji celów i przesiewach. Możliwość ta ogranicza zmienność wynikającą z manualnego przygotowania próbek i przyspiesza przejście od tkanki do użytecznych danych z pojedynczych komórek w ramach portfeli badawczych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia szybkie otrzymywanie żywotnych zawiesin pojedynczych komórek do immunofenotypowania i analiz funkcjonalnych.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez zapewnienie spójnego materiału wejściowego do badania szlaków i celów terapeutycznych.
- Ułatwia odtwarzalne przygotowanie próbek, co redukuje zmienne zakłócające w badaniach walidacji celów.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia ustandaryzowane zawiesiny komórek do opracowywania testów i platform przesiewowych o wysokiej przepustowości.
- Poprawia powtarzalność testów poprzez minimalizację zmienności związanej z manualną dysocjacją.
- Przygotowuje próbki kompatybilne z cytometrią przepływową i sortowaniem komórek, co umożliwia uzyskanie wiarygodnych wyników ilościowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Zapewnia zawiesiny komórek o wysokiej żywotności do translacyjnych badań biomarkerów oraz przedklinicznego profilowania immunologicznego.
- Gwarantuje ciągłość od momentu pobrania tkanki do późniejszych analiz funkcjonalnych i fenotypowych.
- Zmniejsza ryzyko utraty lub degradacji próbek, wspierając wiarygodne podejmowanie decyzji na etapie przedklinicznym.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje etap pobierania tkanek z późniejszymi analizami opartymi na komórkach, łącząc procesy wczesnego odkrywania, przesiewania oraz badania translacyjne.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez i badania mechanistyczne poprzez dostarczanie wysokiej jakości materiału wejściowego w postaci pojedynczych komórek.
- Screening: Zapewnia powtarzalne, skalowalne zawiesiny komórkowe gotowe do analiz i oceny związków chemicznych.
- Analityka: Umożliwia ilościową ocenę żywotności i fenotypu za pomocą cytometrii przepływowej i pokrewnych metod odczytu.
- Badania translacyjne: Odpowiada potrzebom w zakresie profilowania biomarkerów i komórek odpornościowych w modelach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje zestandaryzowaną, możliwą do zautomatyzowania platformę dysocjacji, którą można dostosować do różnych typów tkanek i badań.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach opartych na komórkach.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność, standaryzację i przepustowość w przygotowywaniu próbek.
- Wartość strategiczna: Przyspiesza podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) i ogranicza marnowanie zasobów wynikające z nieudanych lub niespójnych preparacji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację z uwzględnieniem ryzyka poprzez zapewnienie niezawodnego materiału wejściowego dla wielu programów.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest znajomość protokołów automatycznej dysocjacji tkanek oraz przygotowywania buforów.
- Wymagany jest dostęp do urządzenia gentleMACS Dissociator, probówek C oraz kompatybilnego sprzętu do filtracji i wirowania.
- W celu zapewnienia powtarzalności konieczna jest standaryzacja ilości materiału wejściowego i objętości buforów pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowana do różnych rozmiarów śledziony i potencjalnie do innych typów tkanek po wprowadzeniu odpowiednich korekt w protokole.
- Objętość buforu oraz wybór programu muszą być dopasowane do masy próbki, aby zapewnić optymalną dysocjację.
