Name: Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych ze śledziony myszy za pomocą dysocjatora gentleMACS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-11T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 18 s
Description: Poznaj automatyczną dysocjację tkanek śledziony myszy za pomocą gentleMACS Dissociator, aby uzyskać żywotne zawiesiny jednokomórkowe. Ta metoda zapewnia powtarzalne i kontrolowane warunki przygotowania próbek do analizy cytometrycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wprowadzenie do aparatury
<ol>
<li>Tkankę delikatnie dysocjuje się za pomocą probówek C Tubes (violet), aby uzyskać żywe zawiesiny pojedynczych komórek.</li>
<li>Do dysocjacji komórek stosuje się bufor PBS/BSA EDTA. Bufor przygotowuje się poprzez dodanie 1 części roztworu zapasowego BSA do 20 części roztworu płuczącego autoMACS zawierającego EDTA.</li>
<li>Stosuje się filtry MACS Pre-Separation Filters, aby próbki dysocjowanej tkanki były wolne od wszystkich skupisk komórek, co sprzyja skutecznej separacji MACS i późniejszej analizie.</li>
</ol>
Dysocjacja komórek śledziony
<ol>
<li>Całe śledziony są dysocjowane do zawiesin pojedynczych komórek splenocytów przy użyciu dysocjatora gentleMACS Dissociator.</li>
<li>Aby rozpocząć procedurę, należy napełnić probówkę C Tube objętością buforu odpowiednią do masy śledzion. Zdrowa śledziona młodej dorosłej samicy myszy BALB/c waży około 80-120 mg. Każde 1 do 2 śledzion o takiej masie wymaga 3 mL buforu. Śledziony starszych zwierząt lub zwierząt z infekcjami są często większe i muszą być ważone w buforze. Objętości buforu należy odpowiednio przeskalować. Nie należy przekraczać całkowitej objętości buforu 10 mL.</li>
<li>Do probówki C Tube zawierającej 3 mL buforu należy dodać wypreparowaną śledzionę.</li>
<li>Należy upewnić się, że nakrętka probówki C Tube jest szczelnie zamknięta, a następnie przymocować probówkę C Tube do dysocjatora nakrętką skierowaną w dół.</li>
<li>Włączyć dysocjator. Dla 1-2 śledzion należy wybrać program m_spleen_01. Program potrwa 56 sekund. Jeśli liczba śledzion jest większa, należy użyć programu m_spleen_04; program ten można stosować dla masy tkanki śledziony do 720 mg.</li>
<li>Po zakończeniu programu natywna tkanka śledziony zostaje zdysocjowana do zawiesiny splenocytów.</li>
<li>Całą zawiesinę komórkową należy odwirować przy 300×g w temperaturze pokojowej przez około 30 s. Zapewni to oczyszczenie rotora i stojana ze wszystkich komórek, które zostaną zebrane na dnie probówki C Tube.</li>
<li>Próbkę należy pobrać przez otwór z septem w nakrętce probówki C Tube za pomocą pipety o objętości 1000 µL.</li>
</ol>
Krok filtracji
<ol>
<li>Aby rozpocząć etap filtracji, nanieś dysocjowaną tkankę na filtr do wstępnej separacji lub sitko komórkowe o rozmiarze porów 30 µm. Sitko powinno być dopasowane do probówki 15 mL w przypadku 1-2 śledzion, lub do probówki 50 mL w przypadku więcej niż 2 śledzion.</li>
<li>Pozostaw zawiesinę komórkową do przelania. Następnie wypłucz filtr, dodając 5 mL buforu.</li>
<li>Następnie odwiruj probówkę z zawiesiną komórkową przy 300xg w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby zebrać wszystkie splenocyty w postaci osadu komórek śledziony.</li>
<li>Po uzyskaniu osadu dysocjowanych splenocytów należy odessać nadsącz i zawiesić osad komórkowy w odpowiedniej ilości buforu.</li>
</ol>
Dysocjacja śledziony z wykorzystaniem systemu gentleMACS Dissociator pozwala na uzyskanie wysokiego odsetka żywych splenocytów, co zostało wykazane za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem analizatora MACSQuant. Martwe komórki są barwione jodeczkiem propidyny. W przedstawionym przykładzie wykres kropkowy rozpraszania światła w przód i pod kątem (forward side scatter) przedstawia przygotowane splenocyty.

Wszystkie protokoły i arkusze danych są dostępne pod adresem <a href="http://www.miltenyibiotec.com">http://www.miltenyibiotec.com.</a>

Aby uniknąć żmudnej i często bolesnej manualnej dysocjacji, dysocjator gentleMACS umożliwia bardzo efektywne rozdzielanie tkanek w kontrolowanych i powtarzalnych warunkach. Procedura dysocjacji tkanek jest łagodna dla komórek i pozwala na uzyskanie zawiesin komórkowych o wysokim stopniu żywotności. Dysocjator gentleMACS w połączeniu z probówkami C Tubes został zaprojektowany do przygotowywania zawiesin pojedynczych komórek z różnych tkanek. Instrument jest wyposażony w szereg predefiniowanych programów do dysocjacji śledziony, wątroby, płuc lub tkanki nerwowej myszy. Gama programów i protokołów będzie stale rozszerzana o kolejne rodzaje tkanek.

<table><tbody><tr><td>Zestaw startowy gentleMACS&amp;#8482;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Probówki C (C Tubes)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Probówki 13 mL</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-596</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_751_13_mL_Tubes_for_LS_Columns.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Roztwór płuczący autoMACS&amp;#8482;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Roztwór zapasowy BSA MACS&amp;#174;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-376</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Filtry do wstępnej separacji</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Analizator MACSQuant</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-197</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór jodku propidyny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek ze śledziony myszy z użyciem dysocjatora gentlemacs

Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Spleen with the gentleMACS Dissociator

Suspensje jednokomórkowe są niezbędne w eksperymentach z zakresu separacji, analizy i hodowli komórek. Aby uniknąć żmudnej i często uciążliwej manualnej dysocjacji, dysocjator gentleMACS umożliwia bardzo efektywne rozdzielanie tkanek w kontrolowanych i powtarzalnych warunkach. Dysocjator gentleMACS pozwala na optymalną dysocjację śledziony myszy, łącząc oszczędność czasu i standaryzację z bezpieczeństwem użytkownika.

Niniejszy film opisuje sposób dysocjacji śledzion myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS – zautomatyzowanego urządzenia laboratoryjnego, które mechanicznie rozdrabnia tkanki przy użyciu specjalnych probówek w celu uzyskania żywotnych suspensji komórkowych. Po dysocjacji śledziony są filtrowane, wirowane i resuspendowane do dalszych zastosowań.

Niniejszy film opisuje prostą i oszczędzającą czas technikę automatycznej dysocjacji tkanek z użyciem dysocjatora gentleMACS w celu przygotowania zawiesin pojedynczych komórek splenocytów mysich.

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek ze śledziony myszy z użyciem dysocjatora gentleMACS

Suspensje pojedynczych komórek są niezbędne do przeprowadzania eksperymentów z zakresu separacji, analizy i hodowli komórek. Aby uniknąć żmudnego i często bolesnego manualnego...

W tym protokole wideo dowiesz się, jak dysocjować śledziony mysie za pomocą Gentle Max – zautomatyzowanego urządzenia laboratoryjnego, które mechanicznie rozdrabnia tkanki przy użyciu specjalnych probówek w celu uzyskania żywotnych zawiesin komórkowych. Po dysocjacji śledziony są filtrowane za pomocą filtrów separacyjnych Max Pres, wirowane i zawieszane do dalszych zastosowań. Cześć, nazywam się Melanie mlu.Jestem naukowcem w Milton Biotech w BE Lab Park w Niemczech. Dzisiaj zaprezentuję przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek z rozpylenia myszy przy użyciu zestawu do dysocjacji GenX. Dysocjacja GenX umożliwia bardzo łatwe i szybkie przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek.Zacznijmy zatem. Aby uniknąć żmudnej i często uciążliwej manualnej dysocjacji, urządzenie gentle max di associator umożliwia bardzo wydajną dysocjację tkanki w kontrolowanych i powtarzalnych warunkach. Tkanka jest delikatnie dysocjowana przy użyciu probówek violet C w celu uzyskania żywotnych zawiesin pojedynczych komórek.Probówka typu C posiada otwór z uszczelką w centrum zakrętki, co umożliwia pipetowanie z probówki przy jednoczesnym zachowaniu sterylności. Do zawieszenia zdysocjowanych komórek należy użyć odpowiedniego buforu PBS-BSA-EDTA. Bufor przygotowuje się poprzez dodanie jednej części roztworu zapasowego BSA do 20 części roztworu AutoMax fencing zawierającego EDTA.Dzięki zastosowaniu filtrów separacyjnych Max Pres, zdysocjowane próbki tkanek zostają oczyszczone ze wszystkich grudek komórkowych, co sprzyja maksymalnej separacji i późniejszej analizie. Aby rozpocząć procedurę, do probówki C wlewamy odpowiednią objętość buforu. W zależności od masy śledzion, zdrowa śledziona samicy myszy biopsyjnej w wieku od sześciu do siedmiu tygodni waży około 80 do 120 mg.Na każde jedną do dwóch śledzion o tej masie wymagane są trzy mililitry buforu. Nie należy przekraczać całkowitej objętości 10 mililitrów. Teraz możemy dodać wyciętą śledzionę do probówki C zawierającej trzy mililitry buforu. Śledziony zwierząt starszych lub zainfekowanych są często większe i muszą zostać zważone w buforze.Objętości buforów należy następnie odpowiednio przeskalować, jednak ponownie nie mogą one przekroczyć całkowitej objętości 10 milliliters. Teraz należy upewnić się, że zakrętka probówki C jest szczelna, a następnie podłączyć probówkę C do urządzenia do dysocjacji. Przy zakrętce skierowanej w dół, uruchomić dysocjację dla jednej do dwóch śledzion, wybierając Program M spleen oh one. Program potrwa 56 seconds; jeśli liczba śledzion jest większa, należy użyć programu M spleen oh four.Program ten można stosować dla ilości tkanki śledziony do 720 mg. Po zakończeniu programu natywna tkanka śledziony zostaje rozdzielona do postaci zawiesiny komórek PLE, która wygląda w ten sposób; należy krótko odwirować zawiesinę, aby zebrać próbkę na dnie probówki. Zapewni to oczyszczenie rotora i stojana ze wszystkich komórek, które zostaną zebrane na dnie probówki C.Próbkę pobieramy przez otwór zamknięty septem w nakrętce rurki C, używając pipety o objętości 1000 µL. Aby rozpocząć etap filtracji, zdysocjowaną tkankę przenosimy na filtr separacyjny lub sito o rozmiarze porów 30 µm. Sito powinno być dopasowane do probówki 15 ml w przypadku jednego lub dwóch śledzion, lub do probówki 50 ml w przypadku więcej niż dwóch śledzion.Pozwól zawiesinie komórkowej przepłynąć, a następnie przemyj filtr, aplikując 5 mL buforu. Teraz odwirowuj probówkę z zawiesiną komórkową przy 300 Gs w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby zebrać wszystkie komórki w postaci osadu komórek śledziony. Po uzyskaniu osadu dysocjowanych komórek należy odessać nadsącz i resuspendować osad komórkowy w odpowiedniej ilości buforu do dysocjacji śledziony.Zastosowanie metody gentle max pozwoli na uzyskanie wysokiego odsetka żywotnych komórek PLE, co zostało wykazane za pomocą cytometrii przepływowej z użyciem max quant. Martwe komórki są barwione jodkiem propidium, co przedstawiono w podanym przykładzie. Wykres kropkowy rozproszenia światła w przód (forward scatter) przedstawia przygotowane komórki SP. Dobrze.Przedstawiłem sposób dysocjacji tkanki śledziony przy użyciu urządzenia Gentle X. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest dostosowanie ilości buforu do wielkości próbki oraz wybór odpowiedniego programu Gentle X. To wszystko.Powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

preparation-single-cell-suspensions-from-mouse-spleen-with-gentlemacs

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie zawiesin jednokomórkowych ze śledziony myszy za pomocą dysocjatora gentleMACS

Opisujemy przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów T, stosowanego do ekspansji in vitro linii limfocytów T szczura specyficznych dla antygenu.

Przygotowanie czynnika wzrostu limfocytów T ze splenocytów szczura

Dysocjacja komórek z określonych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać dużą liczbę żywotnych komórek zdolnych do hodowli. Dysocjator Miltenyi gentleMACS optymalizuje to zadanie dzięki prostemu i praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono sposób wykorzystania tego urządzenia w odniesieniu do tkanki płucnej.

Standaryzowane przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki płuc myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS

Dysocjacja komórek z konkretnych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać wysoką liczbę żywych komórek zdolnych do hodowli. Urządzenie Miltenyi gentleMACS Dissociator optymalizuje to zadanie dzięki prostemu, praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono zastosowanie tego urządzenia w odniesieniu do tkanki nerwowej.

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki nerwowej myszy

Ten film demonstruje procedurę adoptywnego transferu komórek dendrytycznych (DC) o wysokiej zawartości soli do myszy. Mysie komórki dendrytyczne CD11c+ (DC) są wystawione na działanie pożywki zawierającej duże ilości sodu, tworząc w komórkach addukty białka izolewuglandyny (IsoLG). Te addukty służą jako neoantygeny i są prezentowane na powierzchni DC. Komórki potraktowane wysoką solą są wstrzykiwane myszom poprzez adoptywny transfer komórek.

Metoda leczenia komórek dendrytycznych o wysokiej zawartości soli i ich adoptywnego transferu do myszy

Film demonstruje przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny komórek odpornościowych z mysiej tkanki mózgowej. Obejmuje trawienie enzymatyczne w celu uwolnienia komórek z tkanki mózgowej, a następnie wirowanie w gradiencie gęstości w celu wyizolowania komórek odpornościowych na podstawie ich gęstości w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.

Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny komórek odpornościowych z mysiej tkanki mózgowej

Cytometria przepływowa może być wykorzystana do oceny stanu chromatyny w limfocytach T. Protokół ten pozwala naukowcom interpretować dowody na dekondensację chromatyny podczas aktywacji limfocytów T, co przejawia się wzrostem średniej intensywności kwitnienia (MFI) fluorescencyjnych przeciwciał histonu...

Zastosowanie cytometrii przepływowej do oceny stanu chromatyny w limfocytach T

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek dendrytycznych z mysich śledzion, poprzez magnetyczne sortowanie komórek, a następnie transfer adoptywny do naiwnych myszy. Model komórek dendrytycznych aktywowanych solą został wybrany, aby wyjaśnić krok po kroku procedury adoptywnej cytometrii transferowej i przepływowej.

Izolacja i transfer adoptywny komórek dendrytycznych prezentujących antygen traktowany wysoką solą

Opisujemy tutaj prostą analizę heterogeniczności przedziału mysich komórek odpornościowych B w tkankach otrzewnej, śledziony i szpiku kostnego za pomocą cytometrii przepływowej. Protokół można dostosować i rozszerzyć na inne tkanki myszy.

Charakterystyka cytometrii przepływowej rozwoju mysich komórek B

Tutaj prezentujemy prostą i skuteczną metodę izolowania żywych mejotycznych i postmejotycznych komórek rozrodczych od jąder dorosłych myszy. Korzystając z barwnika wiążącego DNA o niskiej cytotoksyczności, wzbudzonego fioletem i sortowania komórek aktywowanego fluorescencją, można wyizolować wysoce wzbogacone populacje komórek spermatogennych do wielu dalszych zastosowań.

Izolacja mysich komórek spermatogennych za pomocą fioletowo-wzbudzonego, przepuszczalnego dla komórek barwnika wiążącego DNA

Ten artykuł opisuje protokół agregacji i hermetyzacji komórek śledziony w półstałej macierzy błony podstawnej. Konstrukty macierzy błony podstawnej mogą być wykorzystywane w hodowli trójwymiarowej do badania rozwoju organoidów lub do badań nad przeszczepami in vivo i regeneracją tkanek.

Agregacja komórek w kapsułkach macierzy błony podstawnej do badania tworzenia mysiej tkanki śledziony

Tutaj prezentujemy protokół izolowania egzosomów pochodzących z śledziony myszy za pomocą kombinacji trawienia z kolagenazą typu I i ultrawirowania.

Izolacja i charakterystyka egzosomów pochodzących z tkanek śledziony myszy

Poznaj automatyczną dysocjację tkanek śledziony myszy za pomocą gentleMACS Dissociator, aby uzyskać żywotne zawiesiny jednokomórkowe. Ta metoda zapewnia powtarzalne i kontrolowane warunki przygotowania próbek do analizy cytometrycznej.

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek ze śledziony myszy z użyciem dysocjatora gentleMACS

Przeglądaj więcej filmów