Metody pojedynczych cząsteczek do monitorowania zmian właściwości elastycznych dwuwarstwy

Witam, jestem dr Ola Anderson z Katedry Fizjologii i Biofizyki w Weill Cornell Medical College w Nowym Jorku. Nazywam się Olson. Jestem studentem biomedycyny obliczeniowej w laboratorium Olive Anderson.

A ja jestem Shail Collingwood, technik badawczy również z laboratorium Andersona. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak utworzyć płaszczyznę, czyli warstwę biologiczną, jak wyizolować niewielką membranę za pomocą elektrody dziurkującej do warstw biologicznych, jak rejestrować aktywność pojedynczego kanału oraz jak analizować wyniki, aby wykorzystać kanały gramicyny jako sondy właściwości lipidowej warstwy biologicznej. W poprzednim filmie pokazaliśmy, jak przygotować się do tych eksperymentów.

Pokazaliśmy, jak przygotować komorę, której używamy, oraz jak przygotować elektrodę dziurkującą do dwuwarstw lipidowych, służącą do izolowania niewielkiej warstwy błony, w której rejestrujemy aktywność kanałów. Przystąpmy zatem do dziurkowania dwuwarstw. Aby rozpocząć przygotowania do eksperymentów z dwuwarstwami, należy nalać 2,5 ml wyrównanego temperaturowo roztworu elektrolitu do każdej z komór uprzednio przygotowanej komory. Roztworem, którego zazwyczaj używamy, jest 1 M NaCl oraz 10 mM.

Buforuj roztwór do pH siedem, a następnie ustaw mikroskop i źródło światła tak, aby otwór w teflonie znajdował się w centrum pola widzenia i był jasno oświetlony. Włóż szklaną mikropipetę do uchwytu mikroelektrody. Połącz strzykawkę z uchwytem za pomocą odcinka rurki Tygon.

Napełnij pipetę w uchwycie elektrody poprzez zasysanie. Należy uważać, aby uniknąć pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one przerwać połączenie elektryczne między srebrnym granulatem w uchwycie elektrody a końcówką pipety. Nałóż niewielką ilość wazeliny na śrubę, a następnie umieść ją w uchwycie mikroelektrody.

Wazelina pomaga w stworzeniu szczelnego zamknięcia. Włóż uchwyt elektrody do głowicy patch-clamp w klatce Faradaya. Ustaw końcówkę mikropipety centralnie, bezpośrednio za otworem w teflonowej przegrodzie.

Umieść zwiniętą elektrodę srebrną w przedniej komorze. Przymocuj ją za pomocą plasteliny i podłącz do obwodu sterowania napięciem. Na koniec zrównoważ elektrody.

Jest to kluczowe, ponieważ dwie elektrody – ta z przodu oraz ta w uchwycie mikroelektrody – mogą mieć nieco różne potencjały półogniwa. Potencjał półogniwa jest różnicą między srebrem metalicznym a elektrodą i roztworem elektrolitu sąsiadującym z powłoką z chlorku srebra. Zrównoważ elektrody, regulując ręczny offset, tak aby prąd płynący między dwiema komorami w układzie patch clamp wahał się w zakresie od -200 do 200 pA.

Potencjał przesunięcia będzie zmieniać się w czasie, dlatego należy równoważyć elektrody w regularnych odstępach czasu podczas całego eksperymentu w celu sformowania lipidowej błony dwuwarstwowej. Oczyść wypaloną pipetę pastową roztworem fch, zgodnie z opisem w towarzyszącym filmie. Zanurz oczyszczoną pipetę w roztworze lipidowym i pozwól mu podnieść się o około jeden milimetr do wnętrza pipety.

Umieść końcówkę pipety tuż przed otworem w teflonowej przegrodzie i delikatnie nanieś pęcherzyk roztworu lipidowego na otwór. Po prawidłowym wykonaniu operacji w otworze utworzy się jaskrawo zabarwiony pęcherzyk lipidowy, a lipid w kształcie torusa lub pączka przytwierdzi go do teflonowej przegrody. Pozostaw membranę do stwardnienia i pocienienia, co można przyspieszyć poprzez przyłożenie potencjału od 100 do 200 mV przez membranę.

Umieść szklaną końcówkę mikropipety w Taurus i pozostaw ją na kilka minut, aby zapewnić lepsze uszczelnienie pomiędzy pipetą a dwuwarstwą. W tym momencie można przystąpić do izolacji fragmentu błony za pomocą szklanej mikropipety. Następnie należy wprowadzić graminę do błony.

Ten roztwór graminy przygotowano z zapasu o stężeniu 1 µM, który rozcieńczono do stężenia od 1 do 10 nM. W dimetylosulfoksydzie zazwyczaj od 1 do 10 µL rozcieńczenia dodaje się po każdej stronie błony, tak aby stężenie końcowe znajdowało się w zakresie pM. Należy użyć magnetycznego mieszadła w celu wymieszania roztworu przez około dwie minuty, a następnie odczekać kolejne 10 minut przed utworzeniem nowej małej błony w celu rejestracji aktywności pojedynczego kanału.

Taki czas oczekiwania pozwala na wbudowanie gramicyny w błonę. Aktywność kanałów należy sprawdzić poprzez przyłożenie napięcia. Zazwyczaj dąży się do uzyskania około jednego zdarzenia kanałowego na sekundę.

Kanały są widoczne jako dyskretne zmiany prądu błonowego w górę i w dół. Teraz można rozpocząć właściwy eksperyment. W pierwszej kolejności należy zarejestrować kontrolne ślady prądowe.

Zrównoważ elektrodę zgodnie z wcześniejszą demonstracją, a następnie utwórz małą błonę lub łatkę (patch), jak opisano w towarzyszącym filmie. Przyłóż dodatnie napięcie 200 millivolts i zarejestruj aktywność pojedynczego kanału. Należy zebrać od 100 do 200 przejść prądowych pojedynczego kanału.

Powtórz ten krok przy wartości -200 mV. Przerwij uszczelnienie (patch), wypychając elektrolit przez końcówkę pipety. Używając nylonowej śruby, ponownie zrównoważ elektrody, wycofaj pipetę do tylnej komory, wydmuchaj nadmiar lipidów i utwórz nowy patch.

Można również powtórzyć te kroki, aby zarejestrować sygnały przy innych potencjałach. Teraz można przystąpić do rejestracji eksperymentalnych przebiegów prądowych przy zastosowaniu modyfikatora dwuwarstwy. W tym przypadku po obu stronach błony zastosowano lek przeciwdepresyjny fluoksetynę.

Roztwór zapasowy fluoksetyny należy rozcieńczyć do stężenia 25 millimolar w DMSO. Należy dodać pięć µL tego roztworu, aby uzyskać stężenie 50 micromolar w komorze. DMSO może wpływać na właściwości dwuwarstwy. Dlatego ważne jest, aby ograniczyć ilość DMSO w roztworze do 25 µL, 1% lub 150 millimolar.

Mieszaj przez pięć minut, a następnie odczekaj 10 minut, aby modyfikator osiągnął stan równowagi między roztworem wodnym a membraną. Następnie zarejestruj aktywność kanałów w obecności modyfikatora, zgodnie z wcześniejszym opisem. Powtórz te kroki, aby zarejestrować aktywność kanałów przy zwiększających się stężeniach modyfikatora.

Wiele informacji na temat zmian w dwuwarstwie uzyskujemy poprzez ilościowe określanie czasu życia kanałów oraz szybkości ich powstawania. Aby przeprowadzić taką analizę, musimy wykryć momenty tworzenia się i zanikania kanałów. W tym celu stosujemy algorytm oparty na przejściach, w którym komputer oblicza pierwszą pochodną, aby zidentyfikować gwałtowne zmiany natężenia prądu i oznaczyć je jako zdarzenia kanałowe.

Zdarzenia są zapisywane jako szeregi czasowe, co pozwala na określenie czasu życia kanałów przed i po przejściu. Rejestrowane są również poziomy prądu, co umożliwia wyznaczenie amplitud kanałów w trakcie trwania eksperymentu. Komputer generuje histogram amplitud przejść prądowych, co pozwala na monitorowanie procesu rejestracji tych przejść.

Umożliwia to również ocenę jakości eksperymentu. Jeśli aktualne amplitudy przejść wykazują szeroki rozrzut, oznacza to występowanie problemów. Jeśli histogram jest wąski, wyniki są zadowalające.

Po zgromadzeniu ponad 200 zdarzeń przejścia, oblicz średni prąd oraz odchylenie standardowe dla przejść w głównym piku. Częstotliwość pojawiania się kanałów można oszacować, dzieląc liczbę przejść w aktualnym histogramie amplitud przejścia przez czas obserwacji. Pamiętaj, aby wynik podzielić również przez dwa, ponieważ kanał jest liczony w histogramie dwukrotnie: raz w momencie pojawienia się, a raz w momencie zaniknięcia.

Przeanalizuj szeregi czasowe zdarzeń przejścia, aby uzyskać rozkłady czasu życia kanałów. Wyznaczanie czasu życia jest proste w przypadku aktualnych zapisów, w których w dowolnym momencie nie występuje więcej niż jeden kanał przewodzący. W takim przypadku komputer wykrywa, czy każde przejście jest pojawieniem się, czy zanikiem kanału, a zdarzenie zaniku może należeć wyłącznie do poprzedzającego go zdarzenia pojawienia się.

Czas między dwoma przejściami stanowi czas życia kanału. W przypadkach, gdy przejścia kanałów występują zbyt blisko siebie, aby można je było rozróżnić, należy ręcznie przypisać momenty pojawienia się i zaniku. Przypisanie to jest bardziej złożone w przypadku występowania dwóch lub więcej jednocześnie przewodzących kanałów, ponieważ nie wiadomo wówczas, który zanik kanału odpowiada któremu pojawieniu się kanału.

Z tego powodu preferowana jest niska aktywność kanałów. Problem przypisania można rozwiązać, wykorzystując generator liczb losowych do przyporządkowania pojawień się do zniknięć. W ten sposób otrzymuje się serię czasów życia kanałów.

Dane te przekształca się w histogram czasu życia, który z kolei jest zamieniany na wykres przeżywalności; średni czas życia określa się poprzez dopasowanie pojedynczego rozkładu wykładniczego do wykresu przeżywalności przy użyciu nieliniowej metody najmniejszych kwadratów w eksperymentach, w których duża membrana nie ulega pęknięciu. Po dodaniu modyfikatora dwuwarstwy można porównać wpływ na tempo pojawiania się kanałów. Takie porównanie nie jest zasadne, jeśli duża membrana ulega pęknięciu; funkcja białka błonowego jest regulowana przez skład lipidowy błony komórkowej.

Regulacja ta wynika z połączenia specyficznych oddziaływań białko-lipid oraz bardziej ogólnych oddziaływań między lipidową dwuwarstwą a białkami błonowymi. Oddziaływania te są szczególnie istotne w badaniach farmakologicznych, ponieważ wiele obecnie dostępnych na rynku leków to substancje amfifilowe, które mogą zmieniać właściwości lipidowej dwuwarstwy, co z kolei może prowadzić do zmiany funkcji białek błonowych.

Kanały graminowe mogą służyć jako molekularne przetworniki siły do badania, czy amfifile są w stanie zmieniać właściwości dwuwarstwy lipidowej. Wykreślenie zmian czasu życia oraz szybkości pojawiania się w funkcji stężenia modyfikatora pozwala uzyskać wgląd w zmiany właściwości dwuwarstwy.

Zwiększona częstotliwość oznacza, że dwuwarstwa ulega łatwiejszej deformacji w celu pomieszczenia miejsca Grama i dimeryzacji. Zwiększony czas życia oznacza, że deformacja dwuwarstwy związana z tworzeniem kanału nie jest tak kosztowna energetycznie. Modyfikator może zwiększyć częstotliwość i czas życia poprzez zwiększenie elastyczności błony lub wpływ na jej krzywiznę.

Przedstawiliśmy sposób wykorzystania kanałów chromoforowych do sprawdzenia, czy małe cząsteczki zmieniają elastyczne właściwości dwuwarstwy. Na tym wszystko. Dziękujemy za oglądanie.

Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.