Sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie (MACS): izolacja limfocytów T grasicy

1. Przygotowanie

1. Przed rozpoczęciem należy założyć rękawice laboratoryjne i odpowiednią odzież ochronną.
2. Umyj wszystkie narzędzia do preparacji, najpierw detergentem, a następnie 70% etanolem, a następnie osusz je czystym ręcznikiem papierowym.
3. Przygotuj 200 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) zawierającego 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS).

2. Sekcja

1. Przypnij uśpioną mysz do płytki sekcyjnej w pozycji leżącej.
2. Za pomocą nożyczek i kleszczy wykonaj laparotomię podłużną, aby uzyskać dostęp do jamy klatki piersiowej.
3. Usuń serce, aby uzyskać dostęp do grasicy, która znajduje się nad sercem. Następnie zidentyfikuj grasicę, która składa się z dwóch białych płatów i znajduje się w jamie klatki piersiowej nad sercem.
4. Za pomocą kleszczy ostrożnie oderwij grasicę i umieść ją na szalce Petriego z 5 ml HBSS 2% FCS.

3. Izolacja komórek odpornościowych

1. Umieść grasicę na sitku o wielkości 40 μm na tej samej szalce Petriego. Zmiażdż grasicę tłokiem, aby oddzielić ją od tego samego naczynia.
2. Przenieść zdysocjowaną grasicę i płyn do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
3. Umyć szalkę Petriego 5 ml HBSS 2% FCS i przenieść umyte podłoże również do tej samej probówki wirówkowej.
4. Odwirować probówkę o wymiarach 370 x g przez 7 minut w temperaturze 20°C i odrzucić supernatant omijając osad.
5. Zawiesić osad w 2 ml octanu potasu w celu lizy erytrocytów. Odczekaj 2 minuty, a następnie uzupełnij objętość do 14 ml za pomocą HBSS 2% FCS.
6. Ponownie odwirować probówkę przy 370 x g przez 7 minut w temperaturze 20°C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml HBSS 2% FCS.
7. Oszacuj stężenie komórek za pomocą testu barwienia błękitem trypanowym i dostosuj końcowe stężenie komórek do 10⁷ komórek/ml przy użyciu odpowiedniej objętości HBSS 2% FCS.

4. Znakowanie magnetyczne komórek odpornościowych

1. Weź dwie probówki FACS. Oznacz jedną probówkę jako "niewzbogacone limfocyty T", a drugą jako "wzbogacone limfocyty T" - które zostaną oddzielone za pomocą znakowania magnetycznego.
2. Rozprowadzić roztwór komórkowy do każdej z dwóch probówek FACS.
3. Odwirować probówkę "wzbogacone limfocyty T" o temperaturze 370 x g przez 3 minuty w temperaturze 20°C i odrzucić supernatant omijając osad.
4. Zawiesić osad w 250 μl mieszaniny biotynylowanych przeciwciał anty-CD3 (Tabela 1, Mieszanka 1).

Mix	Etykietowanie odczynników	Rozcieńczenie
1	Biotynylowane przeciwciało anty-CD3	1/400 (w HBSS 2% FCS)
2	Koraliki sprzężone ze streptawidyną	1/5 (w HBSS 2% FCS)
3	Anty-CD3 BV421	1/200 (w HBSS 2% FCS)

Tabela 1: Skład mieszanki przeciwciał. Mieszaniny 1 i 2 służą do separacji magnetycznej. Mix 3 służy do oceny wzbogacenia komórek po separacji magnetycznej.

5. Zawiesinę komórkową i mieszaninę przeciwciał inkubować przez 15 minut w temperaturze 4°C w ciemności.
6. Dodaj 3 ml HBSS 2% FCS do obu probówek i odwiruj je ponownie w temperaturze 370 x g przez 3 minuty w temperaturze 20°C.
7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 250 μl kulkach sprzężonych ze streptawidyną (Tabela 1, Wymieszanie 2).
8. Inkubuj mieszaninę komórek i kulki przez 20 minut na lodzie.
9. Następnie dodać 3 ml HBSS 2% FCS, dobrze wymieszać i ponownie odwirować przy 370 x g przez 3 minuty w temperaturze 20°C.
10. Zawiesić osad w 2 ml HBSS 2% FCS.

5. Separacja magnetyczna komórek CD3-dodatnich

1. Umieść kolumnę na magnesie i dodaj 3 ml HBSS 2% FCS, aby nawilżyć system. Poczekaj 5 minut.
2. Następnie odpipetuj oznaczone komórki do kolumny.
3. Po przejściu zawiesiny komórek przez kolumnę, przemyć kolumnę X3 razy 3 ml HBSS 2% FCS.
4. Następnie wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją w probówce zbiorczej o pojemności 15 ml.
5. Aby wymyć komórki docelowe, dodaj 5 ml HBSS 2% FCS do kolumny i przepłucz kolumnę tłokiem.
6. Powtórzyć etap elucji z kolejnymi 5 ml HBSS 2% FCS.

6. Ocena wzbogacania komórek docelowych za pomocą cytometrii przepływowej

1. Przenieś 500 μl eluowanej zawiesiny komórek do probówki FACS oznaczonej jako "wzbogacone limfocyty T". Przenieść 200 μl zawiesiny "niewzbogaconych limfocytów T" do drugiego FACS.
2. Następnie odwirować obie probówki o sile 370 x g przez 7 minut w temperaturze 20°C.
3. Odrzucić supernatant, a następnie dodać 100 μl przeciwciała fluorescencyjnego Mix 3 (patrz tabela 1) do obu probówek.
4. Inkubować obie probówki przez 20 minut w temperaturze 4°C w ciemności.
5. Następnie dodaj 3 ml HBSS 2% FCS do probówek i odwiruj je w temperaturze 370 x g przez 3 minuty w temperaturze 20°C.
6. Odrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić każdą probówkę w 250 μl HBSS 2% FCS.
7. Teraz oceń szybkość wzbogacania komórek CD3-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej.

7. Analiza danych

1. Otwórz ikonę 'FlowJo' i przeciągnij pliki dla każdej rury w oknie "All Sample".
2. Kliknij dwukrotnie plik "wzbogacone komórki T", aby wyświetlić wykres punktowy przedstawiający rozproszenie do przodu (FSC-A) na osi X i rozproszenie boczne (SSC-A) na osi Y.
3. Kliknij "Polygon", aby zakreślić populacje limfocytów.
4. Następnie kliknij dwukrotnie zakreśloną populację, aby utworzyć nowe okno.
5. Wybierz "FSC-W" na osi Y i "FSC-A" na osi X i zakreśl ujemne komórki FSA-W. W oknie "Identyfikacja subpopulacji" nazwij populację komórek "pojedyncze komórki".
6. Kliknij dwukrotnie zakreśloną populację, aby utworzyć nowe okno. Wybierz "CD3" na osi Y i zakreśl komórki CD3-dodatnie. W oknie "Identyfikacja subpopulacji" nazwij swoją populację komórek "Limfocyty T".
7. Powtórz z "niewzbogaconymi limfocytami T".
8. Aby zobrazować populację komórek, kliknij na "Layout editor" i przeciągnij populację "T cells" z plików "wzbogacone limfocyty T" i "niewzbogacone limfocyty T" do zakładki.
9. Pojawią się wykresy kropkowe reprezentujące limfocyty CD3+. Komórki CD3 + powinny pojawić się tylko w populacji będącej przedmiotem zainteresowania w probówce wzbogaconej w CD3 +.
10. Aby ocenić wzbogacenie limfocytów CD3+ w posortowanych komórkach, kliknij na "Edytor tabel", a następnie przeciągnij do tabeli populację "limfocytów T" z plików "wzbogacone limfocyty T" i "niewzbogacone limfocyty T".
11. W menu "Statistic" wybierz "Częstość limfocytów" komórek, aby sprawdzić procentową zawartość komórek CD3+ we wszystkich limfocytach, a następnie kliknij "Utwórz tabelę".
12. Wartości parametrów pojawią się w nowej tabeli. W przypadku "wzbogaconych limfocytów T" częstość komórek CD3 + powinna wynosić około 80%.