5.2: Sortowanie komórek aktywowanych magnetycznie (MACS): izolacja limfocytów T grasicy

1. Przygotowanie

1. Przed rozpoczęciem należy założyć rękawice laboratoryjne i odpowiednią odzież ochronną.
2. Umyj wszystkie narzędzia do preparacji, najpierw detergentem, a następnie 70% etanolem, a następnie osusz je czystym ręcznikiem papierowym.
3. Przygotuj 200 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) zawierającego 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS).

2. Sekcja

1. Przypnij uśpioną mysz do płytki sekcyjnej w pozycji leżącej.
2. Za pomocą nożyczek i kleszczy wykonaj laparotomię podłużną, aby uzyskać dostęp do jamy klatki piersiowej.
3. Usuń serce, aby uzyskać dostęp do grasicy, która znajduje się nad sercem. Następnie zidentyfikuj grasicę, która składa się z dwóch białych płatów i znajduje się w jamie klatki piersiowej nad sercem.
4. Za pomocą kleszczy ostrożnie oderwij grasicę i umieść ją na szalce Petriego z 5 ml HBSS 2% FCS.

3. Izolacja komórek odpornościowych

1. Umieść grasicę na sitku o wielkości 40 μm na tej samej szalce Petriego. Zmiażdż grasicę tłokiem, aby oddzielić ją od tego samego naczynia.
2. Przenieść zdysocjowaną grasicę i płyn do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
3. Umyć szalkę Petriego 5 ml HBSS 2% FCS i przenieść umyte podłoże również do tej samej probówki wirówkowej.
4. Odwirować probówkę o wymiarach 370 x g przez 7 minut w temperaturze 20°C i odrzucić supernatant omijając osad.
5. Zawiesić osad w 2 ml octanu potasu w celu lizy erytrocytów. Odczekaj 2 minuty, a następnie uzupełnij objętość do 14 ml za pomocą HBSS 2% FCS.
6. Ponownie odwirować probówkę przy 370 x g przez 7 minut w temperaturze 20°C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml HBSS 2% FCS.
7. Oszacuj stężenie komórek za pomocą testu barwienia błękitem trypanowym i dostosuj końcowe stężenie komórek do 10⁷ komórek/ml przy użyciu odpowiedniej objętości HBSS 2% FCS.

4. Znakowanie magnetyczne komórek odpornościowych

1. Weź dwie probówki FACS. Oznacz jedną probówkę jako "niewzbogacone limfocyty T", a drugą jako "wzbogacone limfocyty T" - które zostaną oddzielone za pomocą znakowania magnetycznego.
2. Rozprowadzić roztwór komórkowy do każdej z dwóch probówek FACS.
3. Odwirować probówkę "wzbogacone limfocyty T" o temperaturze 370 x g przez 3 minuty w temperaturze 20°C i odrzucić supernatant omijając osad.
4. Zawiesić osad w 250 μl mieszaniny biotynylowanych przeciwciał anty-CD3 (Tabela 1, Mieszanka 1).

Tabela 1: Skład mieszanki przeciwciał. Mieszaniny 1 i 2 służą do separacji magnetycznej. Mix 3 służy do oceny wzbogacenia komórek po separacji magnetycznej.

5. Zawiesinę komórkową i mieszaninę przeciwciał inkubować przez 15 minut w temperaturze 4°C w ciemności.
6. Dodaj 3 ml HBSS 2% FCS do obu probówek i odwiruj je ponownie w temperaturze 370 x g przez 3 minuty w temperaturze 20°C.
7. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 250 μl kulkach sprzężonych ze streptawidyną (Tabela 1, Wymieszanie 2).
8. Inkubuj mieszaninę komórek i kulki przez 20 minut na lodzie.
9. Następnie dodać 3 ml HBSS 2% FCS, dobrze wymieszać i ponownie odwirować przy 370 x g przez 3 minuty w temperaturze 20°C.
10. Zawiesić osad w 2 ml HBSS 2% FCS.

5. Separacja magnetyczna komórek CD3-dodatnich

1. Umieść kolumnę na magnesie i dodaj 3 ml HBSS 2% FCS, aby nawilżyć system. Poczekaj 5 minut.
2. Następnie odpipetuj oznaczone komórki do kolumny.
3. Po przejściu zawiesiny komórek przez kolumnę, przemyć kolumnę X3 razy 3 ml HBSS 2% FCS.
4. Następnie wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją w probówce zbiorczej o pojemności 15 ml.
5. Aby wymyć komórki docelowe, dodaj 5 ml HBSS 2% FCS do kolumny i przepłucz kolumnę tłokiem.
6. Powtórzyć etap elucji z kolejnymi 5 ml HBSS 2% FCS.

6. Ocena wzbogacania komórek docelowych za pomocą cytometrii przepływowej

1. Przenieś 500 μl eluowanej zawiesiny komórek do probówki FACS oznaczonej jako "wzbogacone limfocyty T". Przenieść 200 μl zawiesiny "niewzbogaconych limfocytów T" do drugiego FACS.
2. Następnie odwirować obie probówki o sile 370 x g przez 7 minut w temperaturze 20°C.
3. Odrzucić supernatant, a następnie dodać 100 μl przeciwciała fluorescencyjnego Mix 3 (patrz tabela 1) do obu probówek.
4. Inkubować obie probówki przez 20 minut w temperaturze 4°C w ciemności.
5. Następnie dodaj 3 ml HBSS 2% FCS do probówek i odwiruj je w temperaturze 370 x g przez 3 minuty w temperaturze 20°C.
6. Odrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić każdą probówkę w 250 μl HBSS 2% FCS.
7. Teraz oceń szybkość wzbogacania komórek CD3-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej.

7. Analiza danych

1. Otwórz ikonę 'FlowJo' i przeciągnij pliki dla każdej rury w oknie "All Sample".
2. Kliknij dwukrotnie plik "wzbogacone komórki T", aby wyświetlić wykres punktowy przedstawiający rozproszenie do przodu (FSC-A) na osi X i rozproszenie boczne (SSC-A) na osi Y.
3. Kliknij "Polygon", aby zakreślić populacje limfocytów.
4. Następnie kliknij dwukrotnie zakreśloną populację, aby utworzyć nowe okno.
5. Wybierz "FSC-W" na osi Y i "FSC-A" na osi X i zakreśl ujemne komórki FSA-W. W oknie "Identyfikacja subpopulacji" nazwij populację komórek "pojedyncze komórki".
6. Kliknij dwukrotnie zakreśloną populację, aby utworzyć nowe okno. Wybierz "CD3" na osi Y i zakreśl komórki CD3-dodatnie. W oknie "Identyfikacja subpopulacji" nazwij swoją populację komórek "Limfocyty T".
7. Powtórz z "niewzbogaconymi limfocytami T".
8. Aby zobrazować populację komórek, kliknij na "Layout editor" i przeciągnij populację "T cells" z plików "wzbogacone limfocyty T" i "niewzbogacone limfocyty T" do zakładki.
9. Pojawią się wykresy kropkowe reprezentujące limfocyty CD3+. Komórki CD3 + powinny pojawić się tylko w populacji będącej przedmiotem zainteresowania w probówce wzbogaconej w CD3 +.
10. Aby ocenić wzbogacenie limfocytów CD3+ w posortowanych komórkach, kliknij na "Edytor tabel", a następnie przeciągnij do tabeli populację "limfocytów T" z plików "wzbogacone limfocyty T" i "niewzbogacone limfocyty T".
11. W menu "Statistic" wybierz "Częstość limfocytów" komórek, aby sprawdzić procentową zawartość komórek CD3+ we wszystkich limfocytach, a następnie kliknij "Utwórz tabelę".
12. Wartości parametrów pojawią się w nowej tabeli. W przypadku "wzbogaconych limfocytów T" częstość komórek CD3 + powinna wynosić około 80%.

Sortowanie komórek aktywowane magnetycznie (MACS) to technika, która pozwala naukowcom na oddzielenie komórek na podstawie określonych epitopów wyrażonych na ich powierzchni.

Proces ten zazwyczaj rozpoczyna się od ekstrakcji narządu lub tkanki, takiej jak grasica. Następnie komórki są mechanicznie rozdzielane, zwykle przez zgniatanie, aż do dysocjacji tkanki na pojedyncze komórki. Niechciane komórki można usunąć na tym etapie poprzez dodanie chemikaliów. Na przykład bufor amonowo-chlorkowo-potasowy lub ACK może być używany do lizy niechcianych erytrocytów.

Następnie do zawiesiny dodaje się przeciwciało sprzężone z cząsteczką zwaną biotyną, a kompleksy te wiążą się z epitopami powierzchni komórek docelowych. Biotyna ma wysokie powinowactwo do innej cząsteczki zwanej streptawidyną. W kolejnym kroku cząsteczki streptawidyny połączone z kulkami magnetycznymi są dodawane do komórek znakowanych przeciwciałami. Kiedy biotyna i streptawidyna wchodzą w kontakt, ściśle się wiążą. W rezultacie interesujące komórki są pokryte kulkami magnetycznymi. Ten kompleks jest czasami określany jako kanapka. W tym przypadku CD3 na błonie komórkowej na dole, następnie anty-CD3 sprzężony z biotyną, a na końcu streptawidyna sprzężona z kulkami magnetycznymi.

Te oznaczone komórki można teraz umieścić w kolumnie zawierającej matrycę, która, wspomagana przez grawitację, pozwala komórkom powoli przechodzić za pomocą magnesu. Gdy to zrobią, komórki oznaczone kulkami magnetycznymi przykleją się do krawędzi rurki znajdującej się najbliżej magnesu, podczas gdy nieoznakowane komórki będą kontynuowane w probówce zbiorczej poniżej. Następnie oznakowane komórki można usunąć z kolumny, po prostu usuwając magnes, dodając roztwór eluentu i delikatnie naciskając tłokiem, aby wypłukać je z kolumny do świeżej probówki zbiorczej. Ostatecznie proces ten pozwala na odzyskanie od 60 do 98% interesujących komórek.

W tej procedurze wyizolujemy leukocyty grasicy od myszy i użyjemy MACS do sortowania limfocytów T CD3-dodatnich przed potwierdzeniem skuteczności sortowania za pomocą FACS.

Na początek załóż odpowiedni sprzęt ochronny, w tym fartuch laboratoryjny i rękawice. Następnie umyj nożyczki i kleszcze preparacyjne 70% etanolem i osusz je czystym ręcznikiem papierowym. Następnie przygotuj 200 mililitrów HBSS 2% płodowej surowicy cielęcej lub FCS, mieszając cztery mililitry FCS ze 196 mililitrami HBSS.

Przypnij uśpioną mysz w pozycji leżącej na płycie sekcyjnej. Za pomocą nożyczek i kleszczy wykonaj laparotomię podłużną, aby uzyskać dostęp do jamy klatki piersiowej. Najpierw usuń serce, aby uzyskać dostęp do grasicy, która znajduje się nad sercem. Następnie zidentyfikuj grasicę, która składa się z dwóch białych płatów. Za pomocą kleszczy ostrożnie oderwij grasicę i umieść ją na szalce Petriego z pięcioma mililitrami HBSS 2% FCS.

Aby wyizolować komórki odpornościowe, najpierw umieść grasicę na sitku do komórek o średnicy 40 mikrometrów na szalce Petriego. Zmiażdż tkankę tłokiem, aby oddzielić ją od naczynia. Następnie przepłukać tłok i sitko HBSS 2% FCS, aby odzyskać wszelkie przylegające komórki. Następnie pipetować zdysocjowane komórki grasicy i płyn z szalki Petriego do 15-mililitrowej probówki wirówkowej. Umyj szalkę Petriego pięcioma mililitrami HBSS 2% FCS i przenieś ten roztwór myjący również do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Następnie odwiruj probówkę o ciśnieniu 370 razy g przez siedem minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach buforu lizującego ACK w celu lizy erytrocytów. Inkubować przez dwie minuty w temperaturze pokojowej na blacie stołu. Następnie zwiększ objętość do 14 mililitrów za pomocą HBSS 2% FCS. Odwirować probówkę o ciśnieniu 370 razy g przez siedem minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w pięciu mililitrach HBSS 2% FCS.

Oszacuj stężenie komórek za pomocą szkiełka Malasseza, jak pokazano w protokole izolacji limfocytów B FACS i dostosuj stężenie komórek do 10 do siódmych komórek na mililitr za pomocą HBSS 2% FCS.

Przenieś 500 mikrolitrów roztworu komórkowego do dwóch probówek FACS. Oznacz jedną probówkę niewzbogaconymi limfocytami T, a drugą wzbogaconymi w rurkę limfocytami T, które zostaną oddzielone za pomocą znakowania magnetycznego.

Odwirować rurkę ze wzbogaconymi limfocytami T o ciśnieniu 370 razy g przez trzy minuty w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 250 mikrolitrach sprzężonego z biotyną przeciwciała anty CD3 rozcieńczonego jeden na 400 w HBSS 2% FCS. Inkubuj komórki przez 20 minut na lodzie i w ciemności. Dodaj trzy mililitry HBSS 2% FCS do probówek i odwiruj je ponownie w temperaturze 370 razy g przez trzy minuty w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 250 mikrolitrach kulek sprzężonych ze streptawidyną, rozcieńczonych jeden na pięć w HBSS 2% FCS. Inkubuj mieszaninę komórek i kulek przez 20 minut na lodzie. Następnie dodaj trzy mililitry HBSS 2% FCS do probówki, pipetuj w górę iw dół, aby wymieszać, i ponownie odwiruj przy 370 razy g przez trzy minuty w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Zawiesić granulat w dwóch mililitrach HBSS 2% FCS.

Umieść kolumnę na magnesie i dodaj trzy mililitry HBSS 2% FCS, aby nawilżyć system. Następnie pipetuj wybarwione komórki do kolumny. Po przejściu zawiesiny komórek przez kolumnę, przemyć kolumnę trzykrotnie trzema mililitrami HBSS 2% FCS. Następnie wyjmij kolumnę z magnesu i umieść ją w 15-mililitrowej tubie. Aby wymyć komórki docelowe, dodaj pięć mililitrów HBSS 2% FCS do kolumny i przepłucz kolumnę tłokiem. Powtórz ten krok z kolejnymi pięcioma mililitrami HBSS 2% FCS.

Aby ocenić skuteczność izolacji komórek docelowych, najpierw przenieś 500 mikrolitrów eluowanej zawiesiny komórek do probówki FACS i oznacz ją wzbogaconymi limfocytami T. Następnie odwirować zarówno wzbogacone, jak i niewzbogacone probówki o ciśnieniu 370 razy g przez siedem minut w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant, a następnie dodać 100 mikrolitrów przeciwciała fluorescencyjnego rozcieńczonego jeden na 200 w HBSS 2% FCS do obu probówek. Inkubuj komórki przez 20 minut na lodzie i w ciemności. Następnie dodaj trzy mililitry HBSS 2% FCS do probówek i odwiruj je w temperaturze 370 razy g przez trzy minuty w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Wyrzucić supernatant, a następnie ponownie zawiesić granulki w 250 mikrolitrach HBSS 2% FCS. Teraz oceń szybkość wzbogacania komórek CD3-dodatnich za pomocą cytometrii przepływowej, jak pokazano w protokole FACS.

Teraz określimy częstość limfocytów CD3-dodatnich wśród wszystkich tymocytów, które zostały wyizolowane z grasicy myszy. Aby rozpocząć, kliknij dwukrotnie ikonę FlowJo i przeciągnij pliki dla każdej probówki w oknie wszystkich próbek. Następnie kliknij dwukrotnie plik wzbogaconych limfocytów T, aby wyświetlić komórki zarejestrowane z tej próbki na wykresie kropkowym, który wyświetla rozproszenie do przodu, FSCA, na osi x i rozproszenie boczne, SSCA, na osi y.

Kliknij wielokąt, aby zakreślić populacje limfocytów. Następnie kliknij dwukrotnie zakreśloną populację, aby utworzyć nowe okno. Wybierz FSC-W na osi y, a FSC-A na osi x i zakreśl ujemne komórki FSA-W. W oknie identyfikacji subpopulacji nazwij populację komórek Pojedyncze komórki. Następnie kliknij OK w oknie identyfikacji subpopulacji, a następnie kliknij dwukrotnie zakreśloną populację, aby utworzyć nowe okno. Wybierz CD3 na osi y i zakreśl komórki CD3-dodatnie. W oknie identyfikacji subpopulacji nazwij swoje komórki T-limfocyty T. Powtórz z niewzbogaconym plikiem limfocytów T. Aby wyświetlić populację komórek, kliknij Edytor układu i przeciągnij populację komórek T z plików wzbogaconych limfocytów T i niewzbogaconych limfocytów T na kartę.

Pojawią się wykresy kropkowe reprezentujące limfocyty CD3-dodatnie. Komórki CD3-dodatnie powinny pojawić się tylko w populacji będącej przedmiotem zainteresowania w probówce wzbogaconej o CD3-dodatni. Aby ocenić wzbogacenie limfocytów CD3-dodatnich w posortowanych komórkach, kliknij Edytor tabel, a następnie przeciągnij populację limfocytów T ze wzbogaconych limfocytów T i niewzbogaconych limfocytów T do tabeli. W menu statystyk wybierz opcję Częstość komórek limfocytów, aby sprawdzić procent komórek CD3-dodatnich we wszystkich limfocytach. Następnie kliknij Utwórz tabelę. Wartości parametrów pojawią się w nowej tabeli. W przypadku wzbogaconych limfocytów T częstość komórek CD3-dodatnich powinna wynosić około 80% lub więcej.