5.3: Testy ELISA: pośrednie, kanapkowe i konkurencyjne

1. Pośredni ELISA

Test ELISA pośredni to taki, w którym pierwszorzędowe przeciwciało specyficzne dla antygenu jest rozpoznawane przez drugorzędowe przeciwciało sprzężone. Poniższy protokół jest przykładem pośredniej metody ELISA, w której próbki surowicy myszy zakażonych wirusem grypy A (IAV) są badane pod kątem obecności przeciwciał IgG swoistych dla wirusa grypy A. Jedną z mocnych stron tego przykładu jest to, że można stosować różne przeciwciała drugorzędowe, które rozpoznają wszystkie izotypy przeciwciał lub określone izotypy (np. IgG).

Powlekanie antygenu mikropłytką

1. Pokryj studzienki 96-dołkowej płytki ELISA oczyszczonym antygenem, pipetując 50 μl oczyszczonego antygenu (2 mg/ml oczyszczonego wirusa grypy A A/PR/8 w 0,05 M buforze Tris-HCl (pH 9,5)) do każdej studzienki płytki.
2. Przykryć płytkę przykrytą osłonką samoprzylepną i inkubować ją przez noc w temperaturze 4°C, aby umożliwić związanie antygenu z płytką.
3. Po zakończeniu inkubacji usuń roztwór powlekający, przesuwając płytkę nad zlewem.

Blokowanie

4. Zablokuj pozostałe miejsca wiązania białek w powlekanych studzienkach, dodając 200 μl buforu blokującego, stosuje się tutaj 5% surowicy osła w 1X PBS na studzienkę. Alternatywne odczynniki blokujące obejmują 5% odtłuszczone mleko w proszku lub BSA w PBS lub normalną surowicę od zwierzęcia, w którym wytworzono przeciwciało drugorzędowe.
5. Inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.
6. Po inkubacji usunąć bufor blokujący, przesuwając płytkę, a następnie umyć płytkę PBS zawierającą 1% Tween-20.

Inkubacja z przeciwciałem pierwotnym

7. Przygotować seryjne rozcieńczenie próbki surowicy, która zawiera przeciwciało pierwszorzędowe, w celu uzyskania zakresu rozcieńczeń od 1 do 204 800, przy użyciu 1X PBS. Aby to zrobić, najpierw rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:12,5, a następnie wykonać 4-krotne rozcieńczenie (zakres rozcieńczenia - 1:12,5 do 1:204,800).
8. Dodać 100 μl seryjnie rozcieńczonych próbek surowicy do studzienek.
9. Przykryj płytkę samoprzylepną osłoną i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny.
10. Po inkubacji przesunąć płytkę nad zlew i umyć płytkę PBS zawierającą 1% Tween-20.

Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym

11. Dodaj 100 μl sprzężonego z enzymem przeciwciała wtórnego, peroksydazy chrzanowej, sprzężonej z HRP wtórnej przeciwciała przeciwko myszom osła w tym eksperymencie, do każdej studzienki.
12. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
13. Po inkubacji przesunąć płytkę nad zlewem, a następnie umyć płytkę PBS zawierającą 1% Tween-20.

Wykrywanie

14. Do każdej studzienki dodać 100 μl substratu wskaźnikowego (3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB)) o stężeniu 1 mg/ml.
15. Inkubować płytkę z podłożem przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
16. Po 10 minutach zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając 100 μl 2N kwasu siarkowego (H₂SO₄).
    W ciągu 30 minut od dodania roztworu zatrzymującego odczytać płytkę za pomocą czytnika mikropłytek przy długości fali 405 nm, aby określić absorbancję studzienek.

2. Kanapka ELISA

W tej wersji ELISA próbka eksperymentalna jest "umieszczona" między niesprzężonym przeciwciałem wychwytującym a sprzężonym przeciwciałem wykrywającym, z których oba są specyficzne dla tego samego białka, ale w różnych epitopach. W poniższym przykładzie testu ELISA typu sandwich stężenie ludzkiego TNFα określono w nieznanej próbce przy użyciu krzywej wzorcowej wygenerowanej z 2,5-krotnego seryjnego rozcieńczenia znanego wzorcowego, rekombinowanego ludzkiego TNFα (przy stężeniu 75 pg / ml).

Powłoka wychwytująca przeciwciało na mikropłytce

1. Pokryj dołki 96-dołkowej płytki ELISA oczyszczonym przeciwciałem wychwytującym, dodając 100 μl przeciwciała wychwytującego (zakres 1-10 μg/ml) do każdego dołka płytki.
2. Przykryj płytkę samoprzylepną pokrywą i inkubuj przez noc w temperaturze 4°C.
3. Po inkubacji usunąć roztwór powlekający z płytki, przesuwając płytkę nad zlewem.

Blokowanie

4. Zablokować pozostałe miejsca wiązania białek w studzienkach pokrytych przeciwciałami, dodając do studzienek 200 μl roztworu blokującego, 5% beztłuszczowego mleka w proszku zawierającego PBS.
5. Inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.
6. Po inkubacji usunąć bufor blokujący, przesuwając płytkę, a następnie umyć płytkę PBS zawierającą 1% Tween-20.

Dodaj antygen zawierający próbki testowe

7. Dodać 100 μl badanej próbki do studzienek. Uszczelnij płytkę samoprzylepną osłoną.
8. Inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.
9. Po inkubacji usuń próbki, przesuwając płytkę nad zlewem, a następnie umyj studzienki 200 μl 1X PBS zawierającym 1% Tween-20.

Dodaj przeciwciało wykrywające sprzężone z enzymem

10. Dodać 100 μl sprzężonego z enzymem przeciwciała detekcyjnego do studzienek w zoptymalizowanym stężeniu.
11. Uszczelnij płytkę samoprzylepną osłoną i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
12. Usunąć niezwiązane przeciwciało wykrywające, przesuwając płytkę nad zlewem i umyć studzienki 200 μl 1X PBS zawierającym 1% Tween-20.

Wykrywanie

13. Dodać 100 μl substratu wskaźnikowego o stężeniu 1 mg/ml. Każde związane przeciwciało detekcyjne sprzężone z enzymem przekształci substrat w wykrywalny sygnał.
14. Inkubować płytkę przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
15. Po 5-10 minutach zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając do studzienek 100 μL 2N H₂SO₄. W ciągu 30 minut od dodania roztworu zatrzymującego odczytać płytkę za pomocą czytnika mikropłytek w celu określenia absorbancji studzienek.

3. Konkurencyjny ELISA

Etapy kompetycyjnego testu ELISA różnią się od tych stosowanych w pośrednim i kanapkowym ELISA, przy czym główną różnicą jest etap wiązania konkurencyjnego między antygenem próbki a antygenem "dodatkowym". Próbkę antygenu inkubuje się z nieznakowanym przeciwciałem pierwszorzędowym. Te kompleksy przeciwciało-antygen są następnie dodawane do płytki ELISA, która została wstępnie pokryta tym samym antygenem. Po okresie inkubacji wszelkie niezwiązane przeciwciała są wypłukiwane. Istnieje odwrotna korelacja między ilością wolnego przeciwciała dostępnego do związania antygenu w studzience a ilością antygenu w oryginalnej próbce. Na przykład próbka z dużą ilością antygenu miałaby więcej kompleksów przeciwciał pierwotnych antygenu, pozostawiając niewiele niezwiązanego przeciwciała, które wiązałoby się z płytką ELISA. Następnie do studzienek dodaje się sprzężone z enzymem przeciwciało drugorzędowe specyficzne dla przeciwciała pierwszorzędowego, a następnie substrat.

Powlekanie antygenu na mikropłytce

1. Pokryj studzienki 96-dołkowej płytki ELISA 100 μl oczyszczonego antygenu o stężeniu 1-10 μg/ml.
2. Przykryj płytkę samoprzylepną pokrywą i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 4°C.
3. Po inkubacji usunąć niezwiązany roztwór antygenu ze studzienek, przesuwając płytkę nad zlewem.

Blokowanie

4. Zablokuj pozostałe miejsca wiązania białek w powlekanych studzienkach, dodając 200 μl buforu blokującego do każdej studzienki, który może być albo 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku, albo BSA w PBS.
5. Inkubować płytkę przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.

Próbka inkubacyjna (antygen) z przeciwciałem pierwszorzędowym

6. Blokując studzienki, należy przygotować mieszaninę antygen-przeciwciało, mieszając 150 μl antygenu próbki i 150 μl przeciwciała pierwszorzędowego dla każdej studzienki w teście.
7. Inkubować tę mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.

Dodaj mieszaninę antygenu i przeciwciała do studzienki

8. Teraz usuń bufor blokujący ze studzienek, przesuwając talerz nad zlewem.
9. Następnie umyj studzienki 1X PBS zawierającym Tween-20.
10. Dodać 100 μl próbki mieszaniny antygenu i przeciwciała pierwszorzędowego.
11. Inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez 1 h.
12. Usuń mieszaninę próbek, przesuwając talerz nad zlewem.
13. Następnie przemyj studzienki 1X PBS zawierającym 1% Tween-20, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała.

Dodaj przeciwciało drugorzędowe

14. Do każdej studzienki dodać 100 μl przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z enzymem, które w tym przypadku jest przeciwciałem sprzężonym z AP.
15. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.
16. Po inkubacji przemyć płytkę 1X PBS zawierającym 1% Tween-20.

Wykrywanie

17. Do każdej studzienki dodać 100 μl roztworu substratu.
18. Poczekaj 5-10 minut.
19. Po 10 minutach zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając do studzienek 100 μl 2N kwasu siarkowego. Następnie zmierz absorbancję w czytniku mikropłytek w ciągu 30 minut od dodania roztworu zatrzymującego

Test immunoenzymatyczny lub ELISA to bardzo czuły test ilościowy powszechnie stosowany do pomiaru stężenia analitu, takiego jak cytokiny i przeciwciała, w próbce biologicznej. Ogólna zasada tego testu obejmuje trzy etapy: rozpoczęcie od wychwycenia lub unieruchomienia docelowego analitu na mikropłytce, następnie wykrycie analitu przez białka detekcyjne specyficzne dla celu, a na końcu reakcję enzymatyczną, w której sprzężony enzym przekształca swój substrat w kolorowy produkt. W oparciu o różne metody wychwytywania i wykrywania, test ELISA może być czterech typów: bezpośredni, pośredni, kanapkowy i konkurencyjny.

W przypadku bezpośredniego testu ELISA antygen docelowy jest najpierw wiązany z płytką, a następnie wykrywany przez specyficzne przeciwciało wykrywające. Ta metoda jest powszechnie stosowana do badań przesiewowych przeciwciał na obecność określonego antygenu. Pośredni ELISA służy do wykrywania przeciwciał w próbce w celu ilościowego określenia odpowiedzi immunologicznej. Płytka jest najpierw powlekana specyficznym antygenem wychwytującym, który unieruchamia docelowe przeciwciało, a następnie ten kompleks antygen-przeciwciało jest wykrywany za pomocą drugiego przeciwciała.

W przypadku testu ELISA typu sandwich analit docelowy jest antygenem, który jest wychwytywany na płytce za pomocą przeciwciała wychwytującego, a następnie wykrywany przez przeciwciało wykrywające, tworząc w ten sposób kanapkę przeciwciało-antygen-przeciwciało. Ta metoda jest przydatna do pomiaru stężenia antygenu w mieszanej próbce.

Kompetycyjny test ELISA stosuje się, gdy dostępne jest tylko jedno przeciwciało dla docelowego antygenu będącego przedmiotem zainteresowania. Płytka jest najpierw powlekana oczyszczonym antygenem. W międzyczasie próbka zawierająca antygen jest wstępnie inkubowana z przeciwciałem, a następnie dodawana do płytki, aby umożliwić wszelkie wolne cząsteczki przeciwciała związanie się z unieruchomionym antygenem. Im wyższy sygnał z płytki, tym niższe stężenie antygenu w próbce. We wszystkich czterech typach testu ELISA, bezpośrednim, pośrednim, kanapkowym i konkurencyjnym, przeciwciało detekcyjne jest albo bezpośrednio sprzężone z enzymem, albo może być pośrednio z nim połączone za pomocą innego przeciwciała lub białka.

Enzymami powszechnie stosowanymi w reakcji są peroksydaza chrzanowa lub fosfataza alkaliczna wraz z odpowiednimi substratami, które wytwarzają rozpuszczalny, kolorowy produkt, który można zmierzyć i określić ilościowo za pomocą czytnika płytek. W tym filmie zobaczysz, jak przeprowadzić pośredni test ELISA, test ELISA typu sandwich i test ELISA kompetycyjny, a następnie przedstawisz przykłady kwantyfikacji docelowego analitu metodą pośrednią i metodą ELISA typu sandwich.

Pierwszy eksperyment pokaże, jak wykorzystać pośredni test ELISA do określenia obecności przeciwciał przeciwko wirusowi grypy w surowicy uzyskanej od myszy zakażonych grypą.

Na początek dodaj 50 mikrolitrów oczyszczonego antygenu - w tym przypadku 2 miligramy na mililitr oczyszczonego wirusa grypy A / PR / 8 - do każdej studzienki 96-dołkowej płytki ELISA. Następnie przykryj płytkę samoprzylepną osłoną i inkubuj ją przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza, aby antygen mógł związać się z płytką. Następnego dnia usuń roztwór powlekający, przesuwając talerz nad zlewem. Następnie zablokuj pozostałe miejsca wiązania białek w powlekanych studzienkach, dodając 200 mikrolitrów buforu blokującego - w tym przypadku 5% surowicy osła w 1X PBS - do każdej studzienki. Pozostaw płytkę do inkubacji przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji usunąć bufor blokujący, a następnie umyć płytkę, dodając 200 mikrolitrów 1X PBS zawierającego 1% Tween-20. Przesuń talerz jeszcze raz po zlewie, aby wyjąć pranie.

Następnie przygotuj próbki testowe, dodając 460 mikrolitrów PBS do świeżej probówki, a następnie dodając 40 mikrolitrów surowicy, aby uzyskać rozcieńczenie od 1 do 12,5. Następnie dodaj 300 mikrolitrów PBS do drugiej probówki, a następnie dodaj 100 mikrolitrów pierwszego rozcieńczenia. Kontynuować ten zakres seryjnego rozcieńczania aż do uzyskania próbki końcowej o rozcieńczeniu od 1 do 204,800. Dodać seryjnie rozcieńczone próbki surowicy w trzech egzemplarzach do studzienek. Przykryj płytkę samoprzylepną osłoną i inkubuj w temperaturze pokojowej przez godzinę. Następnie usuń próbki, wrzucając talerz do zlewu, a następnie umyj talerz, dodając 200 mikrolitrów 1X PBS zawierającego 1% Tween-20. Jeszcze raz przesuń talerz, aby usunąć pranie.

Teraz dodaj 100 mikrolitrów sprzężonego z enzymem przeciwciała drugorzędowego, które w tym eksperymencie jest peroksydazą chrzanową lub HRP, sprzężoną wtórną przeciwciałem anty-mysim osła, do każdej studzienki. Inkubować płytkę przez godzinę w temperaturze pokojowej i trzepać płytką, aby usunąć nadmiar płynu. Umyj płytkę 1X PBS zawierającym 1% Tween-20, a następnie nałóż 100 mikrolitrów substratu wskaźnikowego w stężeniu jednego miligrama na mililitr do każdej studzienki. Inkubować płytkę z podłożem przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej. W tym przykładzie bezbarwny substrat 3,3', 5,5' - tetrametylobenzydyny lub TMB zmienia kolor na niebieski, gdy obecny jest HRP. Po 10 minutach zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając 100 mikrolitrów 2N kwasu siarkowego. Próbki zmienią kolor na żółty.

W ciągu 30 minut od dodania roztworu zatrzymującego włóż płytkę do czytnika mikropłytek i odczytaj płytkę na odpowiedniej długości fali dla podłoża, aby określić absorbancję studzienek.

Aby rozpocząć test ELISA kanapkowego, płytka musi być pokryta oczyszczonym przeciwciałem wychwytującym. Aby to zrobić, dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała wychwytującego w stężeniu w zakresie 1-10 mikrogramów na mililitr do każdej studzienki 96-dołkowej płytki ELISA. Następnie przykryj płytkę samoprzylepną osłoną płytki, a następnie inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Po inkubacji usuń roztwór powlekający, przesuwając płytkę nad zlewem.

Teraz zablokuj pozostałe miejsca wiązania białek w powlekanych studzienkach, dodając do nich 200 mikrolitrów 5% beztłuszczowego mleka w proszku. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez co najmniej 2 godziny. Następnie usuń bufor blokujący, a następnie umyj studzienki 1X PBS zawierającym 1% Tween-20. Wyjmij pranie, przesuwając talerz nad zlewem. Teraz dodaj 100 mikrolitrów badanej próbki do studzienek, uszczelnij płytkę samoprzylepną osłoną, a następnie inkubuj ją w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Po inkubacji usuń próbki, przesuwając płytkę nad zlewem, a następnie umyj studzienki 200 mikrolitrami 1X PBS zawierającego 1% Tween-20. Przesuń talerz nad zlewem, aby usunąć płyn, a następnie dodaj 100 mikrolitrów przeciwciała wykrywającego sprzężonego z enzymami do studzienek.

Uszczelnij płytkę samoprzylepną osłoną. Pozostaw płytkę do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Po inkubacji usunąć niezwiązane przeciwciało wykrywające, przesuwając płytkę nad zlewem i umyć studzienki 200 mikrolitrami 1X PBS zawierającego 1% Tween-20. Następnie dodaj 100 mikrolitrów substratu wskaźnikowego w stężeniu 1 miligram na mililitr i inkubuj płytkę przez 5 do 10 minut w temperaturze pokojowej. Po 10 minutach zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając 100 mikrolitrów 2N kwasu siarkowego do studzienek, a następnie odczytać płytkę w ciągu 30 minut od dodania roztworu zatrzymującego w czytniku mikropłytek.

Aby przeprowadzić konkurencyjny test ELISA, najpierw pokryj dołki 96-dołkowej płytki ELISA 100 mikrolitrami oczyszczonego antygenu o stężeniu 1-10 mikrogramów na mililitr. Przykryj płytkę samoprzylepną osłoną na płytkę, a następnie inkubuj przez noc w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Następnie usuń niezwiązany roztwór antygenu z dołków, przesuwając talerz nad zlewem.

Następnie zablokuj pozostałe miejsca wiązania białek w powlekanych studzienkach, dodając 200 mikrolitrów buforu blokującego do każdej studzienki - w tym przypadku 5% beztłuszczowego mleka w proszku w PBS. Inkubować płytkę przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej. Blokując studzienki, przygotuj mieszaninę antygenu i przeciwciała w 1. 5-mililitrową probówkę, dodając 150 mikrolitrów próbki antygenu do 150 mikrolitrów przeciwciała pierwszorzędowego dla każdej studzienki w teście. Inkubuj tę mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Teraz usuń bufor blokujący ze studzienek, przesuwając talerz nad zlewem. Następnie umyj studzienki 1X PBS zawierającym Tween 20, a następnie dodaj 100 mikrolitrów próbki mieszaniny antygenu i przeciwciała pierwotnego.

Pozostaw płytkę do inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę. Następnie usuń mieszaninę próbek, przesuwając płytkę nad zlewem, a następnie umyj studzienki 1X PBS zawierającym 1% Tween-20, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała. Dodać 100 mikrolitrów sprzężonego z enzymem przeciwciała drugorzędowego do każdej studzienki i inkubować płytkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie umyj płytkę 1X PBS zawierającym 1% Tween-20, a następnie dodaj 100 mikrolitrów roztworu podłoża do każdej studzienki. Poczekaj 5-10 minut. Po 10 minutach zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając 100 mikrolitrów 2N kwasu siarkowego, a następnie zmierz absorbancję w czytniku mikropłytek w ciągu 30 minut od dodania roztworu zatrzymującego.

W przypadku półilościowego pośredniego testu ELISA obecność przeciwciał wirusa grypy A w seryjnie rozcieńczonych próbkach surowicy myszy zakażonych grypą A określono poprzez odczyt absorbancji każdej studzienki przy 405 nanometrach w czytniku płytek. Te nieprzetworzone dane są eksportowane do arkusza kalkulacyjnego w celach obliczeniowych. W tym eksperymencie seryjnie rozcieńczone próbki surowicy, które wahają się od 1 do 12,5 do 1 - 204 800, powtórzono w trzech egzemplarzach.

Aby przeanalizować dane, średnią wartość absorbancji oblicza się dla każdego zestawu potrójnych porcji, dodając wszystkie wartości dla każdego rozcieńczenia i dzieląc sumę przez 3. Po ustaleniu średniej dla każdego zestawu potrójnych prób, średnie odczyty OD450 są wykreślane w stosunku do seryjnych rozcieńczeń. Odczyty OD zmniejszają się wraz z rozcieńczaniem surowicy, co wskazuje, że w bardziej rozcieńczonych próbkach znajduje się mniej przeciwciał. W ilościowym teście ELISA typu sandwich rozcieńczenia znanego wzorca, w tym przypadku rekombinacji ludzkiego TNFalpha, dodano do 96-dołkowej płytki i odczytano wraz z nieznanymi próbkami.

Aby utworzyć krzywą wzorcową, obliczono średnią wartość absorbancji dla każdego zestawu odczytów znanych stężeń. Następnie wykreślono średnią wartość absorbancji na osi y, w porównaniu ze znanymi stężeniami białka na osi x. Krzywa najlepszego dopasowania jest dodawana przez punkty na wykresie.

Po wygenerowaniu krzywej wzorcowej ilość białka TNFalfa w badanej próbce można określić, obliczając najpierw średnią wartość absorbancji dla badanej próbki. W tym przykładzie próbki testowe dały odczyty OD450 0,636 i 0. 681. Dodanie tych wartości i podzielenie sumy przez 2 daje średnią 0,659. Od osi y na wykresie krzywej standardowej przedłuż linię poziomą od tej wartości absorbancji do krzywej standardowej. W punkcie przecięcia przedłużyć linię pionową do osi x i odczytać odpowiednie stężenie, które w tej badanej próbce odpowiada stężeniu TNFalpha wynoszącemu 38,72 pikogramów na mililitr.