Testy ELISA: pośrednie, kanapkowe i konkurencyjne

1. Pośredni ELISA

Test ELISA pośredni to taki, w którym pierwszorzędowe przeciwciało specyficzne dla antygenu jest rozpoznawane przez drugorzędowe przeciwciało sprzężone. Poniższy protokół jest przykładem pośredniej metody ELISA, w której próbki surowicy myszy zakażonych wirusem grypy A (IAV) są badane pod kątem obecności przeciwciał IgG swoistych dla wirusa grypy A. Jedną z mocnych stron tego przykładu jest to, że można stosować różne przeciwciała drugorzędowe, które rozpoznają wszystkie izotypy przeciwciał lub określone izotypy (np. IgG).

Powlekanie antygenu mikropłytką

1. Pokryj studzienki 96-dołkowej płytki ELISA oczyszczonym antygenem, pipetując 50 μl oczyszczonego antygenu (2 mg/ml oczyszczonego wirusa grypy A A/PR/8 w 0,05 M buforze Tris-HCl (pH 9,5)) do każdej studzienki płytki.
2. Przykryć płytkę przykrytą osłonką samoprzylepną i inkubować ją przez noc w temperaturze 4°C, aby umożliwić związanie antygenu z płytką.
3. Po zakończeniu inkubacji usuń roztwór powlekający, przesuwając płytkę nad zlewem.

Blokowanie

4. Zablokuj pozostałe miejsca wiązania białek w powlekanych studzienkach, dodając 200 μl buforu blokującego, stosuje się tutaj 5% surowicy osła w 1X PBS na studzienkę. Alternatywne odczynniki blokujące obejmują 5% odtłuszczone mleko w proszku lub BSA w PBS lub normalną surowicę od zwierzęcia, w którym wytworzono przeciwciało drugorzędowe.
5. Inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.
6. Po inkubacji usunąć bufor blokujący, przesuwając płytkę, a następnie umyć płytkę PBS zawierającą 1% Tween-20.

Inkubacja z przeciwciałem pierwotnym

7. Przygotować seryjne rozcieńczenie próbki surowicy, która zawiera przeciwciało pierwszorzędowe, w celu uzyskania zakresu rozcieńczeń od 1 do 204 800, przy użyciu 1X PBS. Aby to zrobić, najpierw rozcieńczyć surowicę w stosunku 1:12,5, a następnie wykonać 4-krotne rozcieńczenie (zakres rozcieńczenia - 1:12,5 do 1:204,800).
8. Dodać 100 μl seryjnie rozcieńczonych próbek surowicy do studzienek.
9. Przykryj płytkę samoprzylepną osłoną i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 1-2 godziny.
10. Po inkubacji przesunąć płytkę nad zlew i umyć płytkę PBS zawierającą 1% Tween-20.

Inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym

11. Dodaj 100 μl sprzężonego z enzymem przeciwciała wtórnego, peroksydazy chrzanowej, sprzężonej z HRP wtórnej przeciwciała przeciwko myszom osła w tym eksperymencie, do każdej studzienki.
12. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
13. Po inkubacji przesunąć płytkę nad zlewem, a następnie umyć płytkę PBS zawierającą 1% Tween-20.

Wykrywanie

14. Do każdej studzienki dodać 100 μl substratu wskaźnikowego (3,3',5,5'-tetrametylobenzydyny (TMB)) o stężeniu 1 mg/ml.
15. Inkubować płytkę z podłożem przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
16. Po 10 minutach zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając 100 μl 2N kwasu siarkowego (H₂SO₄).
    W ciągu 30 minut od dodania roztworu zatrzymującego odczytać płytkę za pomocą czytnika mikropłytek przy długości fali 405 nm, aby określić absorbancję studzienek.

2. Kanapka ELISA

W tej wersji ELISA próbka eksperymentalna jest "umieszczona" między niesprzężonym przeciwciałem wychwytującym a sprzężonym przeciwciałem wykrywającym, z których oba są specyficzne dla tego samego białka, ale w różnych epitopach. W poniższym przykładzie testu ELISA typu sandwich stężenie ludzkiego TNFα określono w nieznanej próbce przy użyciu krzywej wzorcowej wygenerowanej z 2,5-krotnego seryjnego rozcieńczenia znanego wzorcowego, rekombinowanego ludzkiego TNFα (przy stężeniu 75 pg / ml).

Powłoka wychwytująca przeciwciało na mikropłytce

1. Pokryj dołki 96-dołkowej płytki ELISA oczyszczonym przeciwciałem wychwytującym, dodając 100 μl przeciwciała wychwytującego (zakres 1-10 μg/ml) do każdego dołka płytki.
2. Przykryj płytkę samoprzylepną pokrywą i inkubuj przez noc w temperaturze 4°C.
3. Po inkubacji usunąć roztwór powlekający z płytki, przesuwając płytkę nad zlewem.

Blokowanie

4. Zablokować pozostałe miejsca wiązania białek w studzienkach pokrytych przeciwciałami, dodając do studzienek 200 μl roztworu blokującego, 5% beztłuszczowego mleka w proszku zawierającego PBS.
5. Inkubować przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.
6. Po inkubacji usunąć bufor blokujący, przesuwając płytkę, a następnie umyć płytkę PBS zawierającą 1% Tween-20.

Dodaj antygen zawierający próbki testowe

7. Dodać 100 μl badanej próbki do studzienek. Uszczelnij płytkę samoprzylepną osłoną.
8. Inkubować przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.
9. Po inkubacji usuń próbki, przesuwając płytkę nad zlewem, a następnie umyj studzienki 200 μl 1X PBS zawierającym 1% Tween-20.

Dodaj przeciwciało wykrywające sprzężone z enzymem

10. Dodać 100 μl sprzężonego z enzymem przeciwciała detekcyjnego do studzienek w zoptymalizowanym stężeniu.
11. Uszczelnij płytkę samoprzylepną osłoną i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
12. Usunąć niezwiązane przeciwciało wykrywające, przesuwając płytkę nad zlewem i umyć studzienki 200 μl 1X PBS zawierającym 1% Tween-20.

Wykrywanie

13. Dodać 100 μl substratu wskaźnikowego o stężeniu 1 mg/ml. Każde związane przeciwciało detekcyjne sprzężone z enzymem przekształci substrat w wykrywalny sygnał.
14. Inkubować płytkę przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej.
15. Po 5-10 minutach zatrzymaj reakcję enzymatyczną, dodając do studzienek 100 μL 2N H₂SO₄. W ciągu 30 minut od dodania roztworu zatrzymującego odczytać płytkę za pomocą czytnika mikropłytek w celu określenia absorbancji studzienek.

3. Konkurencyjny ELISA

Etapy kompetycyjnego testu ELISA różnią się od tych stosowanych w pośrednim i kanapkowym ELISA, przy czym główną różnicą jest etap wiązania konkurencyjnego między antygenem próbki a antygenem "dodatkowym". Próbkę antygenu inkubuje się z nieznakowanym przeciwciałem pierwszorzędowym. Te kompleksy przeciwciało-antygen są następnie dodawane do płytki ELISA, która została wstępnie pokryta tym samym antygenem. Po okresie inkubacji wszelkie niezwiązane przeciwciała są wypłukiwane. Istnieje odwrotna korelacja między ilością wolnego przeciwciała dostępnego do związania antygenu w studzience a ilością antygenu w oryginalnej próbce. Na przykład próbka z dużą ilością antygenu miałaby więcej kompleksów przeciwciał pierwotnych antygenu, pozostawiając niewiele niezwiązanego przeciwciała, które wiązałoby się z płytką ELISA. Następnie do studzienek dodaje się sprzężone z enzymem przeciwciało drugorzędowe specyficzne dla przeciwciała pierwszorzędowego, a następnie substrat.

Powlekanie antygenu na mikropłytce

1. Pokryj studzienki 96-dołkowej płytki ELISA 100 μl oczyszczonego antygenu o stężeniu 1-10 μg/ml.
2. Przykryj płytkę samoprzylepną pokrywą i inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 4°C.
3. Po inkubacji usunąć niezwiązany roztwór antygenu ze studzienek, przesuwając płytkę nad zlewem.

Blokowanie

4. Zablokuj pozostałe miejsca wiązania białek w powlekanych studzienkach, dodając 200 μl buforu blokującego do każdej studzienki, który może być albo 5% beztłuszczowym mlekiem w proszku, albo BSA w PBS.
5. Inkubować płytkę przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.

Próbka inkubacyjna (antygen) z przeciwciałem pierwszorzędowym

6. Blokując studzienki, należy przygotować mieszaninę antygen-przeciwciało, mieszając 150 μl antygenu próbki i 150 μl przeciwciała pierwszorzędowego dla każdej studzienki w teście.
7. Inkubować tę mieszaninę przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.

Dodaj mieszaninę antygenu i przeciwciała do studzienki

8. Teraz usuń bufor blokujący ze studzienek, przesuwając talerz nad zlewem.
9. Następnie umyj studzienki 1X PBS zawierającym Tween-20.
10. Dodać 100 μl próbki mieszaniny antygenu i przeciwciała pierwszorzędowego.
11. Inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez 1 h.
12. Usuń mieszaninę próbek, przesuwając talerz nad zlewem.
13. Następnie przemyj studzienki 1X PBS zawierającym 1% Tween-20, aby usunąć wszelkie niezwiązane przeciwciała.

Dodaj przeciwciało drugorzędowe

14. Do każdej studzienki dodać 100 μl przeciwciała drugorzędowego sprzężonego z enzymem, które w tym przypadku jest przeciwciałem sprzężonym z AP.
15. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37°C.
16. Po inkubacji przemyć płytkę 1X PBS zawierającym 1% Tween-20.

Wykrywanie

17. Do każdej studzienki dodać 100 μl roztworu substratu.
18. Poczekaj 5-10 minut.
19. Po 10 minutach zatrzymać reakcję enzymatyczną, dodając do studzienek 100 μl 2N kwasu siarkowego. Następnie zmierz absorbancję w czytniku mikropłytek w ciągu 30 minut od dodania roztworu zatrzymującego