Mikroskopia immunofluorescencyjna: barwienie immunofluorescencyjne skrawków tkanek zatopionych w parafinie

1. Ustawienie

1. Typowy protokół barwienia obejmuje następujące kroki:
   1. Ponowne nawodnienie skrawków tkanek na szkiełkach za pomocą serii stopniowanych etanoli.
   2. Inkubacja skrawków tkanki z buforem blokującym, który pomoże zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciała z tkanką i zmniejszyć fluorescencję tła.
   3. Usunięcie buforu blokującego i inkubacja sekcji w przeciwciałie pierwszorzędowym, w którym to czasie przeciwciało zwiąże swój cel peptydowy.
   4. Usunięcie przeciwciała pierwszorzędowego i dokładne umycie skrawków w buforze do mycia.
   5. Inkubacja skrawków z przeciwciałem drugorzędowym w celu umożliwienia wiązania się z przeciwciałem pierwszorzędowym, jeśli przeciwciało pierwszorzędowe nie jest bezpośrednio znakowane fluoroforem i wymagane jest przeciwciało drugorzędowe.
   6. Wymywanie przeciwciał wtórnych ze szkiełek.
   7. Montaż szkiełek w mediach montażowych i pozostawienie ich do wyschnięcia przed wizualizacją pod mikroskopem fluorescencyjnym.
2. Potrzebne są następujące elementy: uchwyty na szkiełka (szklane lub plastikowe), słoiki, pipety, długopis, wilgotna komora, szkiełka nakrywkowe i nośniki montażowe z DAPI.
3. Ksylen służy do nawadniania szkiełek. Ksylen jest niebezpieczny i powinien być stosowany w dygestorium wraz z odpowiednimi środkami ochrony osobistej, w tym rękawicami i fartuchem laboratoryjnym.
4. Receptury buforów, roztworów i odczynników
   1. Klasyfikowane etanole
      Etanol - 160 ml 200 proof EtOH i 40 mL ddH₂O
      Etanol - 140 ml 200 proof EtOH i 60 mL ddH₂O
   2. Roztwór do odzyskiwania antygenu
      10 mM cytrynian sodu, pH 6,0
   3. Bufor blokujący
      100 μL Surowicy od zwierzęcia gospodarza, z której wytworzono przeciwciało drugorzędowe
      900 μL 1X PBS
      Uwaga: To jest wolumin na 10 sekcji; W razie potrzeby dostosuj objętość dla około 100 μl buforu na sekcję.
   4. Bufor do płukania (1X PBS)

2. Protokół

1. Rehydratacja ksylenami i etanolami
   1. Umieść szkiełka w uchwycie szkiełka, a następnie zanurz je w roztworze 100% izomerów ksylenu, upewniając się, że szkiełka są całkowicie pokryte roztworem.
   2. Inkubować szkiełka w 100% izomerach ksylenu przez 3 minuty. Powtórz dwa razy, w sumie 3 oddzielne inkubacje. Pamiętaj, aby wytrzeć stojak na szkiełka ręcznikiem papierowym przed przeniesieniem do nowego roztworu, aby zminimalizować zanieczyszczenie.
      Uwaga: Zaleca się, aby te inkubacje były wykonywane w trzech oddzielnych pojemnikach.
   3. Inkubować szkiełka w 100% EtOH przez 2 minuty. Powtórz dwa razy, w sumie 3 oddzielne inkubacje.
      Uwaga: Zaleca się, aby te inkubacje były wykonywane w trzech oddzielnych pojemnikach.
   4. Inkubuj szkiełka w 95% EtOH przez 2 minut.
   5. Inkubuj szkiełka w 80% EtOH przez 2 minuty.
   6. Inkubuj szkiełka w 70% EtOH przez 2 minuty.
   7. Inkubuj szkiełka w 1X PBS przez 5 minut.
2. (Opcjonalnie) Pobieranie antygenu w celu zdemaskowania epitopów rozpoznanych przez przeciwciało główowe
   Uwaga 1: Ta procedura jest wysoce zależna od użytego przeciwciała i zaleca się przeprowadzenie wstępnych procedur optymalizacyjnych w celu określenia wymagań dotyczących pobrania antygenu.
   Uwaga 2: Ta procedura nie została wykonana z barwieniem F4/80 pokazanym poniżej. Zapotrzebowanie na pobranie antygenu powinno być optymalizowane z każdym nowym przeciwciałem.
   1. Umieść szkiełka w żaroodpornym plastikowym lub szklanym uchwycie na prowadnice i upewnij się, że stojak jest wypełniony szkiełkami, aby zapewnić równomierne rozprowadzanie ciepła. Puste szkiełka mogą być używane, jeśli próbek jest mniej niż szczelin w stojaku.
   2. Umieść stojak w 1000 ml roztworu do demaskowania antygenu w 2 l zlewce - 10 ml bulionu demaskującego antygen na 990 ml wody.
   3. Kuchenka mikrofalowa na wysokich obrotach przez łącznie 20 minut, upewnij się, że szkiełka pozostają pokryte wodą.
   4. Schłodzić zjeżdżalnie przez 20 minut w zlewce.
   5. Myj stojak na szkiełka w uchwytach na szkiełka zawierających ddH₂O przez 5 minut każdy. Powtórz dwa razy, w sumie 3 oddzielne inkubacje, używając za każdym razem świeżego ddH₂O. Szkiełka można prać w tym samym uchwycie na szkiełka podczas każdego prania.
   6. Inkubuj szkiełka w 1X PBS przez 5 minut.
3. Zakreśl sekcje za pomocą długopisu pap. Pozwoli to na zastosowanie minimalnej objętości buforów potrzebnych do pokrycia skrawków tkanki. Nie dopuścić do wyschnięcia skrawków tkanki.
4. Dodaj bufor blokujący do każdej sekcji. Ilość bufora potrzebna do pokrycia sekcji będzie się różnić w zależności od wielkości sekcji, ale może wynosić od 25 do 500 μl. Należy użyć wystarczającej ilości bufora, aby utworzyć ścieg pokrywający całą powierzchnię sekcji, w tym krawędzie.
   Uwaga: Wybór buforu blokującego może się różnić w zależności od użytego przeciwciała. Na przykład 10% surowica od zwierzęcia gospodarza, w którym wyhodowano przeciwciało drugorzędowe, może być użyta do zmniejszenia nieswoistego wiązania przeciwciała drugorzędowego (na przykład można użyć normalnej surowicy kozie, jeśli przeciwciało drugorzędowe zostało wyhodowane u kozy). Optymalizacja buforu blokującego powinna być przeprowadzona dla każdego przeciwciała pierwszorzędowego. Do barwienia skrawków guza sutka za pomocą F4/80 użyto 0,1 ml 10% normalnej surowicy koziej w PBS.
5. Inkubować sekcje w buforze blokującym w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub 4°C do 24 godzin. Nawilżana komora zapewnia, że sekcje nie wysychają.
6. Usuń bufor blokujący, opróżniając go ze szkiełka. Alternatywnie bufor blokujący można usunąć za pomocą pipety, należy jednak uważać, aby nie dotknąć sekcji z końcówką pipety.
7. Rozcieńczyć przeciwciało pierwszorzędowe w buforze blokującym.
   Uwaga: Prawidłowe rozcieńczenie będzie musiało zostać określone dla każdego typu przeciwciała i próbki. Optymalizacja obejmowałaby wykonanie serii rozcieńczeń w celu zidentyfikowania optymalnego barwienia. Aby zabarwić skrawki guza sutka za pomocą F4/80, skrawki tkanek inkubowano przez noc w temperaturze 4°C w 0,1 ml szczurzego przeciwciała anty-F4/80 rozcieńczonego w stosunku 1:100 w 1% normalnej surowicy koziej w PBS.
8. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe do każdej sekcji i inkubować w wilgotnej komorze do 16 godzin (przez noc) w temperaturze 4°C. Pozostawić co najmniej jedną sekcję w buforze blokującym bez przeciwciała pierwszorzędowego, które posłuży jako kontrola, co pomoże zidentyfikować niespecyficzne wiązanie przez przeciwciało drugorzędowe.
9. Odcedź pierwotne przeciwciało lub bufor blokujący z sekcji i umyj skrawki PBS, umieszczając szkiełka w stojaku na szkiełka i umieszczając w uchwycie na szkiełka z 1x PBS. Pierz 3 razy przez 10 minut za każdym razem.
10. Rozcieńczyć przeciwciało drugorzędowe w stosunku 1:200 w buforze blokującym. Rozcieńczenie można zoptymalizować w zależności od przeciwciała drugorzędowego.
11. Dodać przeciwciało drugorzędowe do wszystkich sekcji, w tym do kontroli, i inkubować przez 1 godzinę w wilgotnej komorze chronionej przed światłem.
12. Odcedź przeciwciało drugorzędowe z sekcji i przemyj 3 razy w PBS przez 10 minut za każdym razem.
13. Dodać 2-3 krople podłoża montażowego zawierającego DAPI do szkiełek i umieścić szkiełko nakrywkowe na próbkach. Jeśli nośnik montażowy nie jest szybkoschnącym, może być konieczne uszczelnienie krawędzi szkiełka stopionym woskiem parafinowym lub lakierem do paznokci, aby zapobiec wyciekom i zachować próbki przez długi czas.
14. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia przez noc w ciemności i zobrazuj skrawki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

3. Analiza danych i wyniki

1. Wybarwione skrawki analizuje się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Szczegółowe informacje na temat przechwytywania i analizy obrazu będą zależeć od specyfikacji mikroskopu i oprogramowania użytego do przeprowadzenia analizy. Zazwyczaj obrazy mogą być traktowane jako obrazy jednokolorowe i nakładane na siebie w celu wygenerowania obrazów wielokolorowych. Procent komórek dodatnich można określić ilościowo, licząc liczbę dodatnio wybarwionych komórek i dzieląc przez całkowitą liczbę komórek wybarwionych DAPI w sekcji. Do barwienia wycinków guza sutka metodą F4/80 przy użyciu oprogramowania Leica Application Suite w wersji 3.8, w zakładce Acquire i w trybie akwizycji Image Overlay, włączono DAPI i RFP. Ekspozycja, wzmocnienie i gamma zostały dostosowane (odpowiednio 20,0 ms, 1,0x i 1,53 dla DAPI oraz 944,2 ms, 1,0x i 1,08 odpowiednio dla RFP), chociaż różni się to w zależności od eksperymentu. Przycisk Pobierz nakładkę służył do tworzenia obrazów nakładek ekspozycji DAPI i RFP.
2. Poniższy obraz (Rysunek 1) przedstawia przykładowy obraz immunofluorescencyjny wycinka guza wybarwionego F4/80, który wykrywa antygen na makrofagach i innych komórkach szpikowych. Przekrój został zamontowany za pomocą nośnika montażowego zawierającego DAPI, a jądra są pokazane na niebiesko.