How does confocal microscopy achieve better resolution than wide-field fluorescence microscopy?

Confocal microscopy uses two strategically placed pinholes at the focal planes of the objective lens to block out-of-focus light. While wide-field microscopy detects fluorescence from above and below the focal plane, creating hazy background, confocal pinholes allow only light from the focal point to reach the detector. This eliminates background fluorescence and dramatically improves both spatial resolution and image contrast.

What role do pinholes play in confocal microscope imaging?

Pinholes are small holes positioned on both the excitation and emission light paths at the focal plane of the objective lens. The excitation pinhole makes the light beam appear to originate from a focal point, enabling precise focusing. The emission pinhole blocks divergent light from out-of-focus regions, allowing only in-focus fluorescence to pass through to the detector, resulting in reduced background and improved image clarity.

How can confocal microscopy distinguish between surface and intracellular protein localization?

Confocal microscopy achieves subcellular resolution by collecting images from narrow Z planes using pinholes that eliminate out-of-focus light. This enables visualization at the subcellular level, allowing researchers to differentiate between surface membrane staining and intracellular staining. The technique can reveal whether proteins are located on the cell surface or within specific organelles like lysosomes.

What is a Z-stack and how is it used in confocal microscopy?

A Z-stack is a series of consecutive images collected from adjacent focal planes throughout the depth of a sample. Because confocal pinholes restrict detection to narrow Z planes, images can be acquired sequentially from top to bottom of the specimen. Specialized software then processes these Z-stack images to generate a three-dimensional depiction of the fluorescence signal pattern, enabling visualization of protein localization in all spatial dimensions.

Why is sample fixation preferred over live cell imaging for confocal microscopy?

Fixed cells are preferred for confocal Z-stack imaging because acquiring multiple images from numerous Z planes is time-consuming and challenging with live cells. Live cells are difficult to maintain healthy during extended imaging, and their organelles constantly move, compromising image quality and 3D reconstruction accuracy. Fixed cells preserve cellular morphology and remain stationary, allowing reliable collection of high-quality image series.

How do secondary antibodies with distinct fluorescent tags enable multi-protein visualization?

When imaging multiple cellular targets, primary antibodies from different species are used to label each antigen. Fluorophore-conjugated secondary antibodies, each with unique excitation and emission spectra, then bind to their respective primary antibodies. This allows the confocal microscope to distinguish signals from different proteins using separate laser channels, enabling simultaneous visualization and co-localization analysis of multiple antigens within the same cell.

What does co-localization indicate when visualizing multiple stained proteins in confocal images?

Co-localization occurs when two or more proteins occupy the same cellular region, appearing as color overlap in merged confocal images. For example, when red and green fluorescent signals overlap, they produce yellow, indicating that both proteins are present in the same subcellular compartment. This technique reveals functional relationships between proteins, such as whether CD1d traffics through lysosomal compartments marked by LAMP-1.

Konfokalna mikroskopia fluorescencyjna: technika określania lokalizacji białek w fibroblastach myszy

0 wyświetleń13:13 min

1. Materiały

Bufory

Bufor do przemywania : 1 X sterylny roztwór soli fizjologicznej buforowany fosforanami (PBS) bez wapnia i magnezu
Bufor utrwalający: 1% paraformaldehyd w PBS
Bufor przepuszczalny: 0,1% Triton X-100 w PBS
Bufor blokujący: 1% albuminy surowicy bydlęcej w PBS
Pożywka do wzrostu komórek: DMEM uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), penicyliną/streptomycyną i L-glutaminą

Sprzęt

Okap z przepływem laminarnym
Inkubator nawilżany (37°C, 5% CO₂)
Konfokalny laserowy mikroskop skaningowy; tutaj, Nikon Eclipse Ti laser

Materiały i odczynniki

Szkiełka do hodowli komórkowych w komorze
Antyblakowy nośnik montażowy z DAPI (do barwienia jąder)
Szklana osłona mikroskopu
Delikatne chusteczki zadaniowe
Pipety i końcówki

Odczynniki specyficzne dla testów

Komórki przylegające (pierwotne komórki lub linie komórkowe); tutaj użyto mysich fibroblastów transfekowanych CD1d (LCD1).
Przeciwciała pierwszorzędowe do wykrywania celów komórkowych; tutaj użyto szczurzego anty-mysiego CD107a (LAMP-1) i mysiego anty-mysiego CD1d.
Przeciwciała drugorzędowe sprzężone z fluoroforem specyficzne dla pierwszorzędowych izotypów przeciwciał; tutaj zastosowano antyszczurzą IgG skoniugowaną z Alexafluorem 488 i anty-mysią IgG skoniugowaną z Alexafluorem 647.

2. Protokół

Przygotowanie do barwienia przeciwciał

Wysiewanie komórek

Ponownie zawieś interesujące komórki w pożywce wzrostowej.
Następnie wysiewać 500 μl zawiesiny komórkowej / na studzienkę do dołków 4-dołkowego szkiełka komorowego. (W tym przypadku komórki LCD1 wysiewano w 2,5x10⁵ komórek/komorę w 500 μl pożywki wzrostowej. Gęstość wysiewu może się różnić w zależności od linii komórkowych).
Inkubować szkiełko komorowe przez noc w inkubatorze o stężeniu 5% CO₂ w temperaturze 37°C, aby komórki mogły przylegać do szkła.
Następnego dnia odessać pożywkę z każdej studzienki, a następnie przemyć komórki 1X 500 μl PBS.

Fiksacja

Aby utrwalić komórki, dodaj 500 μl 1% roztworu paraformaldehydu do każdej studzienki i inkubuj przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Po inkubacji należy zebrać paraformaldehyd do odpowiedniego pojemnika na niebezpieczne odpady płynne.
Następnie przemyj komórki 3 razy 500 μl PBS, aby usunąć wszelkie pozostałości utrwalacza.

Przenikanie

Przepuszczalność komórek przez inkubację z 500 μl buforu/studzienki przepuszczalnej przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie przemyj komórki krótko 3 razy 500 μl PBS.

Blokowanie

Inkubować komórki w każdym dołku z 500 μl buforu blokującego przez 1 godzinę w temperaturze 4°C, aby zablokować niespecyficzne wiązanie przeciwciał.

Inkubacja przeciwciał pierwotnych

Zassać bufor blokujący z komór suwakowych.
Następnie dodaj 500 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciała pierwszorzędowego do komórek. (W tym przypadku anty-CD107a (LAMP-1) rozcieńczono w stosunku 1:500, a anty-CD1d użyto w postaci nierozcieńczonej (przeciwciało monoklonalne 1H6 zostało uprzejmie dostarczone przez dr Randy'ego Brutkiewicza)).
Inkubować szkiełka przez noc w temperaturze 4°C.

Uwaga: W przypadku sondowania więcej niż jednego celu upewnij się, że przeciwciała pierwszorzędowe są różnymi izotypami. Zalecane stężenia przeciwciał różnią się w zależności od producenta i należy je miareczkować przed użyciem.

Inkubacja przeciwciał wtórnych

Odessać pierwotny roztwór przeciwciała ze studzienek.
Umyj komory studzienne 4 razy 500 μl PBS.
Następnie dodaj 500 μl rozcieńczonego roztworu przeciwciał drugorzędowych do każdej studzienki. (W tym przypadku oba przeciwciała drugorzędowe - anty-mysie IgG Alexafluor 647 i anty-szczurze IgG Alexafluor 488 zostały rozcieńczone w stosunku 1:2000 w buforze blokującym).
Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę w ciemności.
Po inkubacji odessać wtórny roztwór przeciwciała.
Przemyć komory 4 razy 500 μl PBS w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych przeciwciał drugorzędowych.

Uwaga: Zalecane stężenia przeciwciał różnią się w zależności od producenta i należy je miareczkować przed użyciem. W przypadku sondowania więcej niż jednego celu, przeciwciała drugorzędowe muszą być sprzężone z różnymi fluoroforami o unikalnych widmach wzbudzenia/emisji. Należy również pamiętać o wzbudzeniu/emisji przeciwbarwienia jądrowego (tj. DAPI) podczas wyboru fluoroforów. Na wybór fluoroforu może mieć wpływ konfiguracja laserowa zastosowanego mikroskopu konfokalnego. Konfiguracja lasera maszyny będzie dyktować, które fluorofory są odpowiednie do eksperymentu.

3. Montaż szkiełek nakrywkowych

Najpierw ostrożnie wyjmij komory ze szkiełka.
Następnie przytrzymaj szkiełko pod kątem nad delikatną chusteczką zadaniową i usuń płyn z krawędzi, nie dotykając komórek.
Dodaj 1 kroplę pożywki montażowej zapobiegającej blaknięciu, zawierającej barwnik jądrowy DAPI, na każdą sekcję komórek.
Następnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 20 mm x 60 mm na szkiełku, przytrzymując je nad krawędziami opuszkami palców. (Unikaj tworzenia się pęcherzyków na komórkach, ponieważ zakłócają one obrazowanie).
Zetrzyj wszelkie dodatkowe podłoże montażowe po bokach delikatną ściereczką zadaniową i przechowuj szkiełka w ciemności w temperaturze pokojowej do tygodnia.

4. Obrazowanie konfokalne

Próbki obrazu w konfokalnym laserowym mikroskopie skaningowym. W przypadku danych pokazanych na rysunku 2 użyto aparatu Nikon Eclipse Ti A1R z oprogramowaniem NIS Elements Advanced Research. Poniższa sekcja zawiera szczegółowe informacje na temat procedury przechwytywania obrazów za pomocą wyżej wymienionego oprogramowania.

Aby rozpocząć obrazowanie komórek, otwórz oprogramowanie ' NIS Elements Advanced Research', klikając na ' ikonę oprogramowania NIS.'
Następnie w oknie sterowania kliknij zakładkę "TiPad" i wybierz żądany cel obrazowania. (W tym przypadku użyto pierwszego obiektywu 40x).
Załaduj slajd z komórkami na stół montażowy i wyśrodkuj go pod obiektywem.
Teraz w zakładce 'A1plus Compact GUI' ustaw lasery odpowiednie dla używanych fluoroforów. Kliknij symbol koła zębatego, aby otworzyć menu ustawień barwnika i spektralnego, a następnie wybierz potrzebne kanały i ustaw laser dla każdego kanału.
Następnie wybierz odpowiednie emisje z menu rozwijanego pod pierwszym lustrem dichroicznym.
Następnie, w oknie 'A1plus Compact GUI', kliknij na 'Ch. Series', aby skonfigurować serię kanałów liniowych, która określa, czy używane lasery będą działać na próbce jednocześnie, czy sekwencyjnie. (W tym przypadku wybrano sekwencyjne przejścia, zaczynając od kanału 1, następnie kanału 2, a następnie 4).
Następnie rozpocznij skanowanie, klikając ikonę "Strzałka" u góry. W tym momencie, gdy obrazowanie jest na żywo, w oknie "A1plus Compact GUI" kliknij przesuwaną skalę i zmodyfikuj rozmiar otworka, aby zapewnić ograniczenie nieostrego światła. (W tym przypadku użyto najniższego dostępnego ustawienia (0,5).
Następnie dostosuj ustawienia 'high voltage' i 'offset' pod każdym laserem do odpowiednich poziomów, używając przesuwanych skal, aby umożliwić wykrycie określonego zabarwienia, jednocześnie ograniczając potencjalne przebarwienia tła. Jeśli dostępna jest próbka do barwienia dodatniego, zacznij od zobrazowania tej próbki dla każdego kanału, aby upewnić się, że ustawienia lasera zapewniają optymalny stosunek sygnału do szumu.
Uwaga: wysoka intensywność lasera przez dłuższy czas może powodować fotowybielanie.
Po ustawieniu optymalnych wartości HV i offsetu dla każdego lasera, kliknij zakładkę 'ND Acquisition', a następnie wybierz ikonę 'Z', aby ustawić parametry dla serii z. Następnie, podczas pobierania obrazu na żywo próbki, najpierw ustaw dół, znajdując dolną część obrazu i klikając przycisk 'bottom', a następnie znajdź górną pozycję próbki i kliknij przycisk 'top'. Ustaw rozmiar kroku, wpisując preferowany rozmiar kroku w μm dla każdego kroku lub określając, ile kroków jest potrzebnych.
Po ustawieniu parametrów serii Z wybierz żądany rozmiar/rozdzielczość obrazu w pikselach. Aby to zrobić, kliknij okno 'A1plus Compact GUI' i pod ikoną 'size' wybierz żądaną rozdzielczość. Aby zmniejszyć szum obrazu, można wybrać menu rozwijane obok symbolu "ø", aby uśrednić wybraną liczbę obrazów.
Teraz kliknij zakładkę 'Uruchom teraz' w menu 'ND Acquisition', aby rozpocząć obrazowanie próbki.
Po zakończeniu obrazowania zapisz obraz, klikając 'File', a następnie 'Zapisz jako', co spowoduje wyeksportowanie pliku obrazu z rozszerzeniem '.nd2'. Na koniec powtórz proces dla każdej z pozostałych próbek.

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Dominique R. Bollino¹, Eric A. Legenzov², Tonya J. Webb¹
¹ Wydział Mikrobiologii i Immunologii, Szkoła Medyczna Uniwersytetu Maryland oraz Kom…

Browse More Videos

Mikroskopia konfokalna

lokalizacja bia ek

obrazowanie Z stack

lustro dichroiczne

detekcja z otworem pinhole

skanowanie laserowe

barwienie przeciwcia ami

lokalizacja subkom rkowa