Techniki oparte na immunoprecypitacji: oczyszczanie endogennych białek za pomocą kulek agarozy

1. Immunoprecypitacja za pomocą białka A/G PLUS kulki agarozy

Przygotowanie lizatu komórkowego

1. Odwirować 10⁸ tymocytów w mikrowirówce z prędkością 13 000 obr./min przez 3 minuty i usunąć supernatant.
   Uwaga: Liczba komórek będzie się różnić w zależności od poziomu ekspresji pożądanego białka i wybranego typu komórki.
2. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforze do lizy RIPA z PMSF.
3. Rozbić komórki za pomocą kilku szybkich impulsów wirem, a następnie kilkakrotnie odessać lizat za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki.
   Uwaga: Unikaj tworzenia bąbelków. Użyj większej igły, takiej jak igła 21G, w przypadku większych typów komórek.
4. Inkubuj lizat komórkowy na lodzie przez 10 minut.
5. Odwiruj lizat z prędkością 13 000 obr./min przez 15 minut w temperaturze 4°C.
6. Przenieść supernatant do świeżej, oznakowanej probówki do mikrowirówki.

Wstępne czyszczenie

7. Do lizatu dodać 20 μl kulek agarozy Protein A/G PLUS i 1 μg przeciwciała kontrolnego izotypu (w tym przypadku stosuje się mysie przeciwciało kontrolne izotypu IgG1).
   Uwaga: Wybór użytego przeciwciała izotypowego będzie zależał od przeciwciała specyficznego dla białka użytego w dalszej części etapu wycofywania.
8. Mieszaninę lizatu inkubować na rotatorze wirówki w chłodni (4°C) przez 30 minut.
9. Odwirować próbkę z prędkością 3200 obr./min przez 30 s w temperaturze 4°C.
10. Przenieść wstępnie oczyszczony supernatant do świeżej, oznakowanej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wyrzuć granulkę.

Oznaczanie stężenia białka

11. Określ stężenie białka w lizacie komórkowym, wykonując test Bradforda.
12. Podaniec 1000 μl odczynnika Bradford do 7 probówek do mikrowirówek.
13. Dodać następujące ilości wzorca białka BSA (2 mg/ml) do 6 probówek (Tabela 1).

Numer rury	Objętość BSA (μL) (2 mg/mL)	Stężenie białka (μg/μL)
1	0	0
2	1	2
3	2	4
4	3	6
5	4	8
6	5	10

Tabela 1: Standardowe ilości białka BSA

14. W probówce 7^th dodaj 1 μl wstępnie oczyszczonego lizatu.
    Uwaga: Aby upewnić się, że stężenie próbki mieści się w zakresie wykrywania testu, przygotuj i przeanalizuj również rozcieńczenie lizatu 1:2 lub 1:5.
15. Umieścić 200 μl z każdej z 7 probówek w osobnych dołkach płaskodennej, 96-dołkowej płytki, powtarzając każdą próbkę w trzech powtórzeniach.
16. Odczyt płytki na czytniku płytek przy długości fali 595 nm.
17. Wygeneruj krzywą wzorcową w programie Excel i oblicz stężenie białka we wstępnie oczyszczonym lizacie.

Pociągnij w dół

18. Oznacz dwie świeże probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml - jedną jako "kontrolną", a drugą jako "test", co w tym przykładzie oznacza c-myc.
19. Umieść 500 μg wstępnie oczyszczonego lizatu w każdej z tych probówek.
    Uwaga: Ilość użytego tutaj białka będzie zależeć od ilości białka, które ma zostać oczyszczone.
20. Zwiększyć całkowitą objętość każdej probówki do 500 μl za pomocą buforu do lizy.
21. Dodać 2 μg przeciwciała anty-c-myc do probówki grupy testowej i 2 μg mysiego przeciwciała kontrolnego izotypu IgG1 do grupy kontrolnej.
    Uwaga: Ilość przeciwciała będzie zależeć od skuteczności przeciwciała i ilości docelowego białka.
22. Inkubuj probówki na rotatorze w chłodni (4°C) przez 2 godziny.
23. Dodaj 20 μl kulek agarozy Protein A/G PLUS do każdej tubki.
    Uwaga: Zaleca się używanie końcówek do pipet z odciętym końcem, aby zapobiec uszkodzeniu koralików.
24. Inkubować na rotatorze w chłodni (4°C) przez noc.
    Uwaga: W zależności od docelowego białka i skuteczności przeciwciała, ten etap może trwać od 1 godziny do nocy.
25. Odwirować probówki z prędkością 3200 obr./min przez 30 s w temperaturze 4°C, aby ściągnąć kulki.
26. Odessać supernatant z każdej probówki.
    Uwaga: Docelowe białko jest teraz związane z kulkami.
27. Umyj koraliki dwa razy za pomocą 500 μL 1X PBS firmy Dulbecco.
28. Odwirować probówki z prędkością 3200 obr./min przez 30 s w temperaturze 4°C.
    Uwaga: Do bardziej rygorystycznego mycia, użyj bardziej rygorystycznych buforów, takich jak RIPA.
29. Odessać bufor z każdej probówki. Używając końcówek ładujących żel, usuń resztki buforu z kulek i trzymaj kulki na lodzie, aby wymyć białko.
    Uwaga: W tym przykładzie białko jest eluowane do bufora działającego SDS-PAGE poprzez gotowanie kulek, w celu analizy Western blot. Podejście to jest odpowiednie do weryfikacji wyników IP lub do badania interakcji białko-białko. Do innych dalszych zastosowań, takich jak oczyszczanie białek do analizy strukturalnej lub enzymatycznej, stosuje się bardziej wyrafinowane systemy, takie jak znaczniki epitopowe (flag-tag lub myc-tag), aby uniknąć elucji przeciwciała z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.

2. Weryfikacja IP za pomocą analizy Western Blot

Elektroforeza SDS-PAGE:

1. Ponownie zawiesić koraliki w barwniku ładującym 20 μL SDS-PAGE zawierającym β-merkapto-etonol.
2. Gotować próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
3. Odwiruj kulki z prędkością 13 000 obr./min przez 10 s w temperaturze pokojowej.
4. Za pomocą końcówek do ładowania żelu ostrożnie odpipetuj próbki uzyskane z kulek i załaduj je do studzienek z żelem SDS-PAGE o gradiencie 4-15%.
5. Oprócz próbek należy załadować tor z drabinką białkową, a także tor ze wstępnie oczyszczonym lizatem, który służy jako kontrola załadunku.
6. Uruchom pod napięciem 100 V, aż czoło barwnika dotrze do dna żelu (~1h).

Analiza Western Blot:

7. Zrób kanapkę Western blot, upewniając się, że membrana PVDF znajduje się między żelem a czerwoną katodą.
8. Transfer przez 1 h przy 100 V.
9. Umieść membranę w 5 ml buforze blokującym w temperaturze pokojowej na 1 godzinę na kołysce przy niskim ustawieniu, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania białek.
   Uwaga: Objętości buforu blokującego, przeciwciała pierwszorzędowego, przeciwciała drugorzędowego i płukania mogą wymagać zwiększenia dla większych plamek.
10. Inkubować blot z 5 ml przeciwciała anty-c-myc w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4°C na bujaczku w niskim ustawieniu.
    Uwaga: Użyte tutaj przeciwciało powinno być inne niż to użyte w kroku opuszczania.
11. Umyj blot 3-6 razy za pomocą 5 ml TBST, przy czym każde pranie trwa 5 minut w temperaturze pokojowej na bujaku na niskim ustawieniu.
12. Inkubować blot z przeciwciałem wtórnym przeciwko królikowi łańcuchowi lekkiemu znakowanemu HRP w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na kołysce przy niskim ustawieniu.
    Uwaga: Wybór przeciwciała drugorzędowego będzie zależał od przeciwciała pierwszorzędowego użytego do Western blot. Dodatkowo, w protokole stosuje się wtórny specyficzny dla łańcucha lekkiego, ponieważ białko docelowe ma masę cząsteczkową zbliżoną do ciężkiego łańcucha przeciwciała. Jeśli białko docelowe jest bliskie 50 kDa, należy użyć wtórnego specyficznego dla łańcucha lekkiego. Jeśli białko docelowe jest bliskie 25 kDa, użyj i specyficznego dla łańcucha ciężkiego wtórnego.
13. Umyj blot 3-6 razy za pomocą 5 ml TBST, przy czym każde pranie trwa 5 minut w temperaturze pokojowej na bujaku na niskim ustawieniu.
14. Usuń płyn z blot i przetrzyj krawędź blot na chusteczki laboratoryjne, aby usunąć nadmiar płynu.
15. Przykryj blot 1x chemiluminescencyjnym odczynnikiem detekcyjnym i inkubuj przez 1 min.
    Uwaga: Poniższe kroki powinny być wykonywane w krótkich odstępach czasu, ponieważ odczynnik do wykrywania jest wrażliwy na światło i czas.
16. Naniec krawędź blot na chusteczki laboratoryjne, aby usunąć nadmiar odczynnika wykrywającego.
17. Umieść plamę na powierzchni obrazowania tacy imagera.
    Uwaga: Plamy chemiluminescencyjne można również wizualizować za pomocą filmu.
18. Obraz za pomocą 'Chemiluminescencyjny program{' do uchwycenia wielu punktów czasowych od 10 s do 5 min.
    Uwaga: Optymalny czas może ulec zmianie w zależności od ilości białka i jakości przeciwciał.
19. Wybierz obraz z optymalną widocznością pasma, a następnie wyeksportuj ten obraz.
20. Przed przeniesieniem plamy zrób zdjęcie plamy za pomocą imagera, aby uchwycić położenie drabiny. Następnie wyeksportuj również ten obraz.
21. Korzystając z oprogramowania do przygotowywania slajdów (takiego jak PowerPoint), wyrównaj pasma i obrazy drabin, aby utworzyć jeden obraz.