5.9: Techniki oparte na immunoprecypitacji: oczyszczanie endogennych białek za pomocą kulek agarozy

1. Immunoprecypitacja za pomocą białka A/G PLUS kulki agarozy

Przygotowanie lizatu komórkowego

1. Odwirować 10⁸ tymocytów w mikrowirówce z prędkością 13 000 obr./min przez 3 minuty i usunąć supernatant.
   Uwaga: Liczba komórek będzie się różnić w zależności od poziomu ekspresji pożądanego białka i wybranego typu komórki.
2. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl buforze do lizy RIPA z PMSF.
3. Rozbić komórki za pomocą kilku szybkich impulsów wirem, a następnie kilkakrotnie odessać lizat za pomocą igły 25 G dołączonej do strzykawki.
   Uwaga: Unikaj tworzenia bąbelków. Użyj większej igły, takiej jak igła 21G, w przypadku większych typów komórek.
4. Inkubuj lizat komórkowy na lodzie przez 10 minut.
5. Odwiruj lizat z prędkością 13 000 obr./min przez 15 minut w temperaturze 4°C.
6. Przenieść supernatant do świeżej, oznakowanej probówki do mikrowirówki.

Wstępne czyszczenie

7. Do lizatu dodać 20 μl kulek agarozy Protein A/G PLUS i 1 μg przeciwciała kontrolnego izotypu (w tym przypadku stosuje się mysie przeciwciało kontrolne izotypu IgG1).
   Uwaga: Wybór użytego przeciwciała izotypowego będzie zależał od przeciwciała specyficznego dla białka użytego w dalszej części etapu wycofywania.
8. Mieszaninę lizatu inkubować na rotatorze wirówki w chłodni (4°C) przez 30 minut.
9. Odwirować próbkę z prędkością 3200 obr./min przez 30 s w temperaturze 4°C.
10. Przenieść wstępnie oczyszczony supernatant do świeżej, oznakowanej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Wyrzuć granulkę.

Oznaczanie stężenia białka

11. Określ stężenie białka w lizacie komórkowym, wykonując test Bradforda.
12. Podaniec 1000 μl odczynnika Bradford do 7 probówek do mikrowirówek.
13. Dodać następujące ilości wzorca białka BSA (2 mg/ml) do 6 probówek (Tabela 1).

Tabela 1: Standardowe ilości białka BSA

14. W probówce 7^th dodaj 1 μl wstępnie oczyszczonego lizatu.
    Uwaga: Aby upewnić się, że stężenie próbki mieści się w zakresie wykrywania testu, przygotuj i przeanalizuj również rozcieńczenie lizatu 1:2 lub 1:5.
15. Umieścić 200 μl z każdej z 7 probówek w osobnych dołkach płaskodennej, 96-dołkowej płytki, powtarzając każdą próbkę w trzech powtórzeniach.
16. Odczyt płytki na czytniku płytek przy długości fali 595 nm.
17. Wygeneruj krzywą wzorcową w programie Excel i oblicz stężenie białka we wstępnie oczyszczonym lizacie.

Pociągnij w dół

18. Oznacz dwie świeże probówki do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml - jedną jako "kontrolną", a drugą jako "test", co w tym przykładzie oznacza c-myc.
19. Umieść 500 μg wstępnie oczyszczonego lizatu w każdej z tych probówek.
    Uwaga: Ilość użytego tutaj białka będzie zależeć od ilości białka, które ma zostać oczyszczone.
20. Zwiększyć całkowitą objętość każdej probówki do 500 μl za pomocą buforu do lizy.
21. Dodać 2 μg przeciwciała anty-c-myc do probówki grupy testowej i 2 μg mysiego przeciwciała kontrolnego izotypu IgG1 do grupy kontrolnej.
    Uwaga: Ilość przeciwciała będzie zależeć od skuteczności przeciwciała i ilości docelowego białka.
22. Inkubuj probówki na rotatorze w chłodni (4°C) przez 2 godziny.
23. Dodaj 20 μl kulek agarozy Protein A/G PLUS do każdej tubki.
    Uwaga: Zaleca się używanie końcówek do pipet z odciętym końcem, aby zapobiec uszkodzeniu koralików.
24. Inkubować na rotatorze w chłodni (4°C) przez noc.
    Uwaga: W zależności od docelowego białka i skuteczności przeciwciała, ten etap może trwać od 1 godziny do nocy.
25. Odwirować probówki z prędkością 3200 obr./min przez 30 s w temperaturze 4°C, aby ściągnąć kulki.
26. Odessać supernatant z każdej probówki.
    Uwaga: Docelowe białko jest teraz związane z kulkami.
27. Umyj koraliki dwa razy za pomocą 500 μL 1X PBS firmy Dulbecco.
28. Odwirować probówki z prędkością 3200 obr./min przez 30 s w temperaturze 4°C.
    Uwaga: Do bardziej rygorystycznego mycia, użyj bardziej rygorystycznych buforów, takich jak RIPA.
29. Odessać bufor z każdej probówki. Używając końcówek ładujących żel, usuń resztki buforu z kulek i trzymaj kulki na lodzie, aby wymyć białko.
    Uwaga: W tym przykładzie białko jest eluowane do bufora działającego SDS-PAGE poprzez gotowanie kulek, w celu analizy Western blot. Podejście to jest odpowiednie do weryfikacji wyników IP lub do badania interakcji białko-białko. Do innych dalszych zastosowań, takich jak oczyszczanie białek do analizy strukturalnej lub enzymatycznej, stosuje się bardziej wyrafinowane systemy, takie jak znaczniki epitopowe (flag-tag lub myc-tag), aby uniknąć elucji przeciwciała z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania.

2. Weryfikacja IP za pomocą analizy Western Blot

Elektroforeza SDS-PAGE:

1. Ponownie zawiesić koraliki w barwniku ładującym 20 μL SDS-PAGE zawierającym β-merkapto-etonol.
2. Gotować próbki w temperaturze 95 °C przez 5 minut.
3. Odwiruj kulki z prędkością 13 000 obr./min przez 10 s w temperaturze pokojowej.
4. Za pomocą końcówek do ładowania żelu ostrożnie odpipetuj próbki uzyskane z kulek i załaduj je do studzienek z żelem SDS-PAGE o gradiencie 4-15%.
5. Oprócz próbek należy załadować tor z drabinką białkową, a także tor ze wstępnie oczyszczonym lizatem, który służy jako kontrola załadunku.
6. Uruchom pod napięciem 100 V, aż czoło barwnika dotrze do dna żelu (~1h).

Analiza Western Blot:

7. Zrób kanapkę Western blot, upewniając się, że membrana PVDF znajduje się między żelem a czerwoną katodą.
8. Transfer przez 1 h przy 100 V.
9. Umieść membranę w 5 ml buforze blokującym w temperaturze pokojowej na 1 godzinę na kołysce przy niskim ustawieniu, aby zablokować niespecyficzne miejsca wiązania białek.
   Uwaga: Objętości buforu blokującego, przeciwciała pierwszorzędowego, przeciwciała drugorzędowego i płukania mogą wymagać zwiększenia dla większych plamek.
10. Inkubować blot z 5 ml przeciwciała anty-c-myc w buforze blokującym przez noc w temperaturze 4°C na bujaczku w niskim ustawieniu.
    Uwaga: Użyte tutaj przeciwciało powinno być inne niż to użyte w kroku opuszczania.
11. Umyj blot 3-6 razy za pomocą 5 ml TBST, przy czym każde pranie trwa 5 minut w temperaturze pokojowej na bujaku na niskim ustawieniu.
12. Inkubować blot z przeciwciałem wtórnym przeciwko królikowi łańcuchowi lekkiemu znakowanemu HRP w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej na kołysce przy niskim ustawieniu.
    Uwaga: Wybór przeciwciała drugorzędowego będzie zależał od przeciwciała pierwszorzędowego użytego do Western blot. Dodatkowo, w protokole stosuje się wtórny specyficzny dla łańcucha lekkiego, ponieważ białko docelowe ma masę cząsteczkową zbliżoną do ciężkiego łańcucha przeciwciała. Jeśli białko docelowe jest bliskie 50 kDa, należy użyć wtórnego specyficznego dla łańcucha lekkiego. Jeśli białko docelowe jest bliskie 25 kDa, użyj i specyficznego dla łańcucha ciężkiego wtórnego.
13. Umyj blot 3-6 razy za pomocą 5 ml TBST, przy czym każde pranie trwa 5 minut w temperaturze pokojowej na bujaku na niskim ustawieniu.
14. Usuń płyn z blot i przetrzyj krawędź blot na chusteczki laboratoryjne, aby usunąć nadmiar płynu.
15. Przykryj blot 1x chemiluminescencyjnym odczynnikiem detekcyjnym i inkubuj przez 1 min.
    Uwaga: Poniższe kroki powinny być wykonywane w krótkich odstępach czasu, ponieważ odczynnik do wykrywania jest wrażliwy na światło i czas.
16. Naniec krawędź blot na chusteczki laboratoryjne, aby usunąć nadmiar odczynnika wykrywającego.
17. Umieść plamę na powierzchni obrazowania tacy imagera.
    Uwaga: Plamy chemiluminescencyjne można również wizualizować za pomocą filmu.
18. Obraz za pomocą 'Chemiluminescencyjny program{' do uchwycenia wielu punktów czasowych od 10 s do 5 min.
    Uwaga: Optymalny czas może ulec zmianie w zależności od ilości białka i jakości przeciwciał.
19. Wybierz obraz z optymalną widocznością pasma, a następnie wyeksportuj ten obraz.
20. Przed przeniesieniem plamy zrób zdjęcie plamy za pomocą imagera, aby uchwycić położenie drabiny. Następnie wyeksportuj również ten obraz.
21. Korzystając z oprogramowania do przygotowywania slajdów (takiego jak PowerPoint), wyrównaj pasma i obrazy drabin, aby utworzyć jeden obraz.

Immunoprecypitacja lub IP jest szeroko stosowaną techniką izolowania białka będącego przedmiotem zainteresowania z lizatu komórkowego lub tkankowego lub płynu ustrojowego w celu scharakteryzowania białka lub zbadania interakcji białko-białko.

Proces rozpoczyna się od przeciwciała, które ma wysokie powinowactwo i swoistość do białka docelowego. Przeciwciało to miesza się z próbką, umożliwiając utworzenie kompleksów przeciwciało-cel. Każde białko związane z białkiem docelowym jest również pośrednio przyłączane do przeciwciała w tym procesie. Następnie roztwór inkubuje się z kulkami agarozy, sprzężonymi z białkiem bakteryjnym, które ma silne powinowactwo do stałego regionu przeciwciał. Białko bakteryjne wiąże się z przeciwciałem i łączy kompleksy przeciwciało-cel z kulkami. Następnie roztwór jest odwirowywany w celu wytrącenia kulek, ekstrahując w ten sposób cały kompleks zawierający przeciwciało wiążące, białko docelowe i wszelkie białka oddziałujące. Na koniec związane białka są ekstrahowane z kulek i uwalniane od siebie nawzajem i wykorzystywane do dalszej analizy za pomocą technik takich jak Western blotting.

Powszechnie stosuje się kilka odmian różnych części tej techniki, takich jak wstępne oczyszczanie, używanie znaczników peptydowych lub kulek magnetycznych lub analizowanie innych partnerów wiążących białka. IP może być poprzedzony etapem wstępnego oczyszczania, aby usunąć niespecyficzne białka wiążące przeciwciała w próbce i zminimalizować tło. Polega to najpierw na inkubacji próbki z przeciwciałami kontrolnymi izotypu, umożliwiając im związanie się z tymi białkami, a następnie użyciu kulek agarozy do wytrącenia kompleksów. Próbka jest następnie gotowa do przejścia do rzeczywistego adresu IP.

Znaczniki peptydowe są przydatne, jeśli określone przeciwciało nie jest dostępne dla IP. W tym przypadku białko docelowe może być genetycznie zmodyfikowane tak, aby zawierało znacznik epitopu peptydu, a przeciwciało przeciwko znacznikowi jest w stanie wyciągnąć interesujące białko. Kulki magnetyczne są często używane zamiast agarozy do wytrącania celu. Po związaniu się z kompleksem przeciwciało-cel, probówkę z próbką umieszcza się w silnym polu magnetycznym, które ekstrahuje kulki z roztworu. Eliminuje to potrzebę wirowania oraz poprawia szybkość i wygodę.

Immunoprecypitacja jest również stosowana do badania białek wiążących DNA lub RNA i jest znana odpowiednio jako immunoprecypitacja chromatyny i immunoprecypitacja RNA. Te warianty są przydatne do rozwiązywania problemów i dostosowywania metody do różnych zastosowań eksperymentalnych. W tym filmie zobaczysz, jak wstępnie oczyścić lizat komórkowy i przeprowadzić immunoprecypitację w celu ekstrakcji interesującego białka, a następnie przeprowadzić analizę Western blot w celu walidacji eksperymentu.

Na początek umieść wstępnie zebrane komórki w mikrowirówce i wiruj z prędkością 13 tysięcy obr./min przez trzy minuty. Po wirowaniu usunąć supernatant, a następnie ponownie zawiesić komórki w 500 mikrolitrach buforu do lizy RIPA z PMSF. Teraz rozerwij komórki za pomocą kilku szybkich impulsów wirem, a następnie odessaj lizat kilka razy za pomocą igły o rozmiarze 25 dołączonej do strzykawki, uważając, aby nie tworzyć pęcherzyków. Umieść komórki na lodzie na 15 minut. Po inkubacji próbek na lodzie odwirować lizat przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Oznacz nową probówkę do mikrowirówki o pojemności 1,5 mililitra. Po wirowaniu przenieść supernatant do świeżo oznakowanej probówki i wyrzucić osad. Następnie wstępnie oczyść lizat z zanieczyszczeń, które wiążą się niespecyficznie z kulkami agarozy lub przeciwciałem pierwszorzędowym, dodając 20 mikrolitrów kulek agarozowych Protein A / G PLUS i jeden mikrogram przeciwciała kontrolnego izotypu do lizatu, który w tym przykładzie jest kontrolą izotypu IgG1 myszy. Inkubować probówkę na rotatorze w chłodnym pomieszczeniu przez 30 minut. Po obracaniu lizatu w chłodni przez 30 minut, odwirować próbkę z prędkością 3200 obr./min przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Wyjmij probówkę z wirówki i przenieś wstępnie oczyszczony supernatant do świeżo oznakowanej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 mililitra. Wyrzuć granulkę.

Teraz określ stężenie białka w lizacie komórkowym, wykonując test Bradforda. Etykieta siedem 1. 5-mililitrowe mikroprobówki wirówkowe od pierwszej do szóstej i pobrać próbkę i porcję 1000 mikrolitrów odczynnika Bradforda do każdej probówki. Sześć probówek zostanie wykorzystanych do wykonania standardowej krzywej poprzez dodanie różnych ilości znanych ilości BSA do każdej probówki. Kwoty, które należy dodać, są wymienione w tej tabeli. Do siódmej probówki z próbką dodać jeden mikrolitr wstępnie oczyszczonego lizatu. Umieścić 200 mikrolitrów z każdej z siedmiu probówek w indywidualnych dołkach płaskodennej 96-dołkowej płytki, powtarzając każdą próbkę w trzech powtórzeniach, tak aby pozostały trzy kolumny po siedem próbek. Odczytaj płytkę na czytniku płytek, używając długości fali 595 nanometrów. Po utworzeniu krzywej standardowej w programie Excel oblicz stężenie białka we wstępnie oczyszczonym lizacie.

Następnie oznacz dwie 1,5-mililitrowe probówki do mikrowirówek - jedną jako kontrolę, a drugą jako test, które w tym przykładzie będą przeciwciałem c-myc. Umieść 500 mikrogramów wstępnie oczyszczonego lizatu w każdej z tych probówek, a następnie zwiększ całkowitą objętość każdej probówki do 500 mikrolitrów za pomocą buforu do lizy. Następnie dodaj dwa mikrogramy przeciwciała anty-c-myc do probówki z grupą testową. Do kontroli dodać dwa mikrogramy mysiego przeciwciała kontrolnego izotypu IgG1. Po dodaniu przeciwciał do probówek należy umieścić próbki na rotatorze w chłodnym pomieszczeniu i inkubować przez dwie godziny. Teraz dodaj koraliki agarozy. W tym celu zaleca się odcięcie końcówki pipety, a następnie, za pomocą tej zmodyfikowanej końcówki, dodanie 200 mikrolitrów kulek agarozowych Protein A/G PLUS-agarozy do każdej probówki. Inkubować probówki na rotatorze w chłodni przez noc.

Po inkubacji wyjmij probówki z rotatora i odwiruj lizaty w mikrowirówce, aby ściągnąć kulki. Po zakończeniu wirowania wyjmij probówki z wirówki i odessaj supernatant z każdej probówki. Następnie umyj koraliki za pomocą 500 mikrolitrów 1X PBS firmy Dulbecco. Umieść probówki w mikrowirówce i wiruj przez 30 sekund w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie usuń supernatant. Powtórz kroki mycia i wirowania jeszcze raz, w sumie dwa razy. Wyjmij probówki z mikrowirówki i odessaj bufor z każdej probówki. Używając końcówek do ładowania żelem, usuń resztki buforu z kulek, trzymając kulki na lodzie, aby wymyć związane białko.

W tym przykładzie białko jest eluowane do buforu roboczego SDS-PAGE poprzez gotowanie w celu analizy Western blot. Aby to zrobić, ponownie zawieś kulki w 20 mikrolitrach barwnika ładującego SDS-PAGE zawierającego beta-merkaptoetanol lub BME. Gotuj próbki w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, aby oddzielić immunokompleksy od kulek. Następnie odwiruj kulki z maksymalną prędkością przez 10 sekund w temperaturze pokojowej. Wyjmij probówki z mikrowirówki i trzymaj je w stojaku w temperaturze pokojowej. Za pomocą końcówek do ładowania żelu ostrożnie odpipetuj próbki z kulek i załaduj je do studzienek żelu SDS-PAGE o gradiacji od 4 do 15%. Oprócz próbek należy załadować tor z drabinką białkową, a także tor ze wstępnie oczyszczonym lizatem, który służy jako kontrola załadunku. Po załadowaniu żelu uruchom żel pod napięciem 100 woltów.

Po tym, jak czoło barwnika dotrze do dna żelu, co powinno zająć około godziny, przerwij żel i przygotuj kanapkę Western blot, upewniając się, że membrana PVDF znajduje się między żelem a katodą. Umieść kanapkę Western blot w aparacie transferowym i przenieś białka z żelu do membrany na jedną godzinę pod napięciem 100 woltów. Po zakończeniu transferu umieść membranę w pięciu mililitrach bloku, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu się przeciwciał z membraną. Kołysz na niskim poziomie przez godzinę w temperaturze pokojowej. Gdy zabrzmi odliczanie, usuń bufor blokujący. Dodać pięć mililitrów buforu blokującego z przeciwciałem wykrywającym do membrany. W tym przypadku stosuje się przeciwciało anty-c-myc, które różni się od tego, które jest używane do ściągania w dół.

Inkubuj blot przez noc, w temperaturze czterech stopni Celsjusza na bujaku na niskim ustawieniu. Po inkubacji usunąć przeciwciało i bufor blokujący. Umyj blot, używając pięciu mililitrów TBST przez pięć minut w temperaturze pokojowej, na bujaku na niskim ustawieniu. Ten etap prania należy powtórzyć od dwóch do pięciu razy, co daje łącznie od trzech do sześciu prań, używając świeżego TBST do każdego prania. Dodaj pięć mililitrów jednego do 1000 przeciwciał drugorzędowych i buforu blokującego do blot. W tym przypadku przeciwciałem drugorzędowym jest znakowany HRP łańcuch lekki anty-królika. Inkubuj blot na bujaku na niskim ustawieniu dla jednego naszego w temperaturze pokojowej. Następnie usuń bufor i umyj blot pięcioma mililitrami TBST. Inkubuj to pranie na bujaku na niskim ustawieniu przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Powtórz to pranie, w sumie od sześciu do 12 prań, z których każde zawiera świeże pięć mililitrów TBST. Usuń ostatnie pranie, najpierw wylewając płyn z plamy. Następnie za pomocą pęsety przetrzyj krawędź plamy chusteczką laboratoryjną, aby usunąć nadmiar płynu, a następnie umieść plamę w świeżym pojemniku. Następnie przykryj blot odczynnikiem do wykrywania chemiluminescencyjnego 1X i inkubuj przez minutę.

Pracując szybko, przetrzyj krawędź plamy chusteczką laboratoryjną, aby usunąć nadmiar odczynnika do wykrywania, a następnie umieść plamę na powierzchni obrazowania tacki imagera. Obraz za pomocą programu Chemiluminescencyjny do uchwycenia wielu punktów czasowych od 10 do 30 sekund. Po zobrazowaniu plamy wybierz obraz o optymalnej widoczności pasma, a następnie wyeksportuj ten obraz. Przed przesunięciem kleksa użyj termowizora, aby zrobić zdjęcie plamy, aby uchwycić położenie drabiny. Następnie wyeksportuj również ten obraz. Na koniec, korzystając z oprogramowania do przygotowywania slajdów, takiego jak PowerPoint, wyrównaj pasma i obrazy drabin, aby utworzyć jeden obraz.

Obraz ten przedstawia wynik Western blot dla immunoprecypitacji białka c-myc z komórek tymocytowych. Od lewej do prawej pasy reprezentują kontrolę izotypu, adres IP c-myc i wstępnie oczyszczone wejście lizatu. Pas po prawej stronie to scalony obraz drabiny mas cząsteczkowych. Silne prążki, o mocy około 25 kilodaltonów, pochodzą z łańcucha lekkiego, a te o mocy 50 kilodaltonów pochodzą z ciężkiego łańcucha przeciwciała wiążącego i nie są specyficzne dla IP lub próbek. C-myc przebiega około 67 kilodaltonów na Western blot i jest zwykle widoczny tuż poniżej pasma drabiny 75 kilodaltonów. W tej plamie pasmo c-myc jest widoczne na drugim pasie, ale nieobecne na pierwszym pasie, co wskazuje, że przeciwciało IP skutecznie ściągnęło c-myc. Nie ma widocznego pasma we wstępnie oczyszczonym pasie lizatu, co sugeruje, że białko to ma niski poziom endogennej ekspresji.