Adoptywny transfer komórek: wprowadzenie splenocytów myszy dawcy do myszy gospodarza i ocena sukcesu za pomocą FACS

1. Przygotowanie

1. Przed rozpoczęciem należy założyć rękawice laboratoryjne i odpowiednią odzież ochronną.
2. Wysterylizuj wszystkie narzędzia do preparacji, najpierw detergentem, a następnie 70% etanolem, a następnie dokładnie wysusz
.
3. Przygotuj 50 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) zawierającego 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS).

2. Sekcja

1. Korzystając z systemu dostarczania dwutlenku węgla, poddaj mysz eutanazji przez niedotlenienie. Zabezpiecz uśpioną mysz na płytce sekcyjnej w pozycji leżącej na plecach i wykonaj laparotomię podłużną za pomocą nożyczek i kleszczy.
2. Za pomocą kleszczy przesuwaj jelita i żołądek po prawej stronie brzucha, aby odsłonić żołądek i śledzionę. Śledziona jest przymocowana do żołądka.
3. Za pomocą kleszczy ostrożnie odłącz śledzionę od żołądka i umieść ją na szalce Petriego zawierającej 5 ml HBSS 2% FCS.

3. Izolacja komórek immunologicznych

1. Umieścić śledzionę na sitku o wielkości 40 μm nad szalką Petriego. Zmiażdż śledzionę tłokiem, aby ją oddzielić.
2. Odzyskać przylegające komórki, przepłukując tłok i sitko 1 ml HBSS 2% FCS.
3. Przenieś zdysocjowaną śledzionę i płyn do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
4. Umyj szalkę Petriego 5 mililitrami HBSS 2% FCS i przenieś płyn do probówki o pojemności 15 ml.
5. Odwirować probówkę o sile 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C i wyrzucić supernatant omijając osad.
6. Zawiesić osad w 2 ml chlorku potasu i amonu, pipetować w górę iw dół, aby ponownie zawiesić osad i poddać lizie erytrocyty.
7. Odczekaj 2 minuty i dodaj HBSS 2% FCS do zawieszonego osadu, aby uzyskać objętość do 14 ml.
8. Ponownie odwirować probówkę o stężeniu 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml HBSS 2% FCS, pipetując w górę i w dół.
9. Policz komórki za pomocą testu barwienia błękitem trypanowym i dostosuj końcowe stężenie komórek do^10-7 komórek/ml, używając odpowiedniej objętości HBSS 2% FCS.

4. Przeniesienie adopcyjne

1. Przenieść 2 ml zawiesiny komórkowej otrzymanej w probówce zbiorczej o pojemności 5 ml.
2. Odwirować probówkę o sile 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C, a następnie odrzucić supernatant.
3. Zawiesić osad w 2 ml PBS i odwirować probówkę o stężeniu 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C.
4. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS.
5. Za pomocą strzykawki o pojemności 0,5 ml z igłą 29G wstrzyknij 200 μl zawiesiny komórkowej eksperymentalnej myszy dożylnie do zatoki krewnej zaoczodołowej.
6. Jako kontrolę, wstrzyknąć drugiej myszy w tę samą zatokę krwi 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.

5. Zbieranie i barwienie komórek

1. Cztery dni po przeniesieniu adopcyjnym należy poddać myszy eutanazji i usunąć śledzionę.
2. Zebrać splenocyty zgodnie z opisem w sekcji 3.
3. Przenieś 100 μl zawiesin komórkowych z każdej myszy do dwóch probówek FACS, oznaczonych jako "kontrolne" i "przeniesione".
4. Odwirować probówkę o sile 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C, a następnie odrzucić supernatanty.
5. Przygotować mieszaninę zawierającą cztery przeciwciała w rozcieńczeniach wymienionych w tabeli 1.

) szt. TGL

przeciwciała	Fluorochrom	Rozcieńczeniu
CD45.1	Zobacz materiał BV711	1/200
CD45.2	APCCy7 (wersja angielska	1/400
Płyta CD4	Zobacz materiał BV786	1/1600
Płyta CD3	Zobacz materiał BV421	1/200

Tabela 1: Skład mieszanki przeciwciał. Przygotowanie czterech koktajli przeciwciał przy użyciu skoncentrowanych koniugatów przeciwciało-fluorescencja i HBSS.

6. Dodaj 100 μl mieszanki do każdej probówki, a następnie inkubuj przez 20 minut na lodzie w ciemności.
7. Dodać 1 ml HBSS 2%FCS, a następnie odwirować probówki o sile 370 x g przez 3 minuty w temperaturze 10°C.
8. Odrzucić supernatanty i ponownie zawiesić granulki w 200 μl HBSS 2% FCS.
9. Przenieś zawieszone komórki do nowych, oznaczonych probówek FACS.
10. Za pomocą cytometrii przepływowej, jak pokazano w protokole FACS, oceń obecność limfocytów CD45.2 dodatnich.

6. Analiza danych

1. Otwórz oprogramowanie "FlowJo" i przeciągnij pliki dla każdej probówki w oknie "Wszystkie próbki".
2. Kliknij dwukrotnie "przeniesiony" plik, aby wyświetlić komórki nagrane z tej próbki na wykresie kropkowym, który wyświetla rozproszenie do przodu "SSC-A" na osi Y i rozproszenie boczne "FSC-A" na osi X.
3. Kliknij "wielokąt" i utwórz strategię bramkowania, aby wybrać limfocyty, a następnie odróżnić komórki dawcy i gospodarza za pomocą markerów powierzchni komórki (CD45.1, CD45.2), a następnie scharakteryzować populację komórek CD45.2⁺ (CD3, CD4).
4. Powtórz kroki analizy z plikiem "control mouse".
5. Aby wyświetlić populację komórek, kliknij "Edytor układu".
6. Przeciągnij populację "przeniesionych komórek" i "przeniesionych komórek CD4" z plików "przeniesionych" i "kontrolnych" na kartę "Edytor układu".
7. Pojawi się wykres punktowy reprezentujący komórki CD45.2⁺ i limfocyty CD4.
8. Komórki przeniesione do CD45.2 powinny pojawiać się tylko na wykresie kropkowym "przeniesiona mysz".