What is adoptive cell transfer and why is it used in research?

Adoptive cell transfer is a method for introducing cells into an organism to study biological mechanisms or treat disease. It enables researchers to examine specific immune cell functions, study hematopoiesis, and test novel therapies like cancer treatments where patient T-cells are extracted, modified to recognize tumors, and returned to fight cancer. Animal models allow detailed investigation of transferred cell behavior and efficacy.

Why are CD45.1 Rag gamma-c knockout mice used in adoptive transfer studies?

CD45.1 Rag gamma-c knockout mice lack fundamental cytokine receptors essential for normal lymphocyte development, resulting in compromised immune systems without natural killer cells, T-cells, or B-cells. These immunocompromised mice serve as ideal recipients for adoptive transfer because they allow researchers to study how donor immune cells establish and function in a lymphocyte-deficient host.

How are splenocytes isolated and purified from donor tissue?

The spleen is dissociated using a cell strainer and plunger to release cells into suspension. Unwanted erythrocytes are lysed using ammonium chloride potassium lysing buffer, and centrifugation separates white blood cells from debris. The resulting purified splenocytes are counted using trypan blue and adjusted to the desired concentration before transfer into recipient mice.

What is the role of flow cytometry in confirming successful adoptive transfer?

Flow cytometry using fluorescence-activated cell sorting (FACS) confirms transfer success by detecting donor cells in the host spleen. Labeled antibodies against donor markers like CD45.2 distinguish transferred cells from host cells. The technique allows researchers to identify specific lymphocyte populations, such as CD4 T-cells, and verify their presence and distribution in recipient mice.

How is the cell suspension prepared before intravenous injection into recipient mice?

The cell suspension is centrifuged and resuspended in phosphate buffered saline through two sequential wash steps. The final pellet is resuspended in 200 microliters of phosphate buffered saline. Using a 0.5 milliliter syringe with a 29-gauge needle, 200 microliters of this purified cell suspension is injected intravenously into the retro-orbital blood sinus of the recipient mouse.

What does the FACS analysis reveal about transferred versus host lymphocytes?

FACS analysis distinguishes CD45.2 positive transferred cells from CD45.1 positive host cells using dot plots. Transferred cells appear only in the transferred mouse sample, not in control mice receiving phosphate buffered saline alone. Further analysis identifies specific transferred lymphocyte subsets, such as CD4 T-cells, demonstrating both successful engraftment and the phenotype of donor cells within the host.

What compatibility factors must be considered before performing adoptive cell transfer?

Host and donor compatibility is crucial to ensure cell adoption without rejection. In this protocol, CD45.2 donor splenocytes are transferred into CD45.1 Rag gamma-c recipient mice, allowing discrimination between donor and host cells. This genetic distinction enables researchers to track transferred cells and assess their integration, survival, and function within the immunocompromised host environment.

Adoptywny transfer komórek: wprowadzenie splenocytów myszy dawcy do myszy gospodarza i ocena sukcesu za pomocą FACS

0 views11:04 min

1. Przygotowanie

Przed rozpoczęciem należy założyć rękawice laboratoryjne i odpowiednią odzież ochronną.
Wysterylizuj wszystkie narzędzia do preparacji, najpierw detergentem, a następnie 70% etanolem, a następnie dokładnie wysusz
Przygotuj 50 ml zbilansowanego roztworu soli Hanka (HBSS) zawierającego 2% płodowej surowicy cielęcej (FCS).

2. Sekcja

Korzystając z systemu dostarczania dwutlenku węgla, poddaj mysz eutanazji przez niedotlenienie. Zabezpiecz uśpioną mysz na płytce sekcyjnej w pozycji leżącej na plecach i wykonaj laparotomię podłużną za pomocą nożyczek i kleszczy.
Za pomocą kleszczy przesuwaj jelita i żołądek po prawej stronie brzucha, aby odsłonić żołądek i śledzionę. Śledziona jest przymocowana do żołądka.
Za pomocą kleszczy ostrożnie odłącz śledzionę od żołądka i umieść ją na szalce Petriego zawierającej 5 ml HBSS 2% FCS.

3. Izolacja komórek immunologicznych

Umieścić śledzionę na sitku o wielkości 40 μm nad szalką Petriego. Zmiażdż śledzionę tłokiem, aby ją oddzielić.
Odzyskać przylegające komórki, przepłukując tłok i sitko 1 ml HBSS 2% FCS.
Przenieś zdysocjowaną śledzionę i płyn do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
Umyj szalkę Petriego 5 mililitrami HBSS 2% FCS i przenieś płyn do probówki o pojemności 15 ml.
Odwirować probówkę o sile 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C i wyrzucić supernatant omijając osad.
Zawiesić osad w 2 ml chlorku potasu i amonu, pipetować w górę iw dół, aby ponownie zawiesić osad i poddać lizie erytrocyty.
Odczekaj 2 minuty i dodaj HBSS 2% FCS do zawieszonego osadu, aby uzyskać objętość do 14 ml.
Ponownie odwirować probówkę o stężeniu 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml HBSS 2% FCS, pipetując w górę i w dół.
Policz komórki za pomocą testu barwienia błękitem trypanowym i dostosuj końcowe stężenie komórek do^10-7 komórek/ml, używając odpowiedniej objętości HBSS 2% FCS.

4. Przeniesienie adopcyjne

Przenieść 2 ml zawiesiny komórkowej otrzymanej w probówce zbiorczej o pojemności 5 ml.
Odwirować probówkę o sile 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C, a następnie odrzucić supernatant.
Zawiesić osad w 2 ml PBS i odwirować probówkę o stężeniu 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C.
Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 200 μl PBS.
Za pomocą strzykawki o pojemności 0,5 ml z igłą 29G wstrzyknij 200 μl zawiesiny komórkowej eksperymentalnej myszy dożylnie do zatoki krewnej zaoczodołowej.
Jako kontrolę, wstrzyknąć drugiej myszy w tę samą zatokę krwi 200 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.

5. Zbieranie i barwienie komórek

Cztery dni po przeniesieniu adopcyjnym należy poddać myszy eutanazji i usunąć śledzionę.
Zebrać splenocyty zgodnie z opisem w sekcji 3.
Przenieś 100 μl zawiesin komórkowych z każdej myszy do dwóch probówek FACS, oznaczonych jako "kontrolne" i "przeniesione".
Odwirować probówkę o sile 370 x g przez 7 minut w temperaturze 10°C, a następnie odrzucić supernatanty.
Przygotować mieszaninę zawierającą cztery przeciwciała w rozcieńczeniach wymienionych w tabeli 1.

) szt. TGL

przeciwciała	Fluorochrom	Rozcieńczeniu
CD45.1	Zobacz materiał BV711	1/200
CD45.2	APCCy7 (wersja angielska	1/400
Płyta CD4	Zobacz materiał BV786	1/1600
Płyta CD3	Zobacz materiał BV421	1/200

Tabela 1: Skład mieszanki przeciwciał. Przygotowanie czterech koktajli przeciwciał przy użyciu skoncentrowanych koniugatów przeciwciało-fluorescencja i HBSS.

Dodaj 100 μl mieszanki do każdej probówki, a następnie inkubuj przez 20 minut na lodzie w ciemności.
Dodać 1 ml HBSS 2%FCS, a następnie odwirować probówki o sile 370 x g przez 3 minuty w temperaturze 10°C.
Odrzucić supernatanty i ponownie zawiesić granulki w 200 μl HBSS 2% FCS.
Przenieś zawieszone komórki do nowych, oznaczonych probówek FACS.
Za pomocą cytometrii przepływowej, jak pokazano w protokole FACS, oceń obecność limfocytów CD45.2 dodatnich.

6. Analiza danych

Otwórz oprogramowanie "FlowJo" i przeciągnij pliki dla każdej probówki w oknie "Wszystkie próbki".
Kliknij dwukrotnie "przeniesiony" plik, aby wyświetlić komórki nagrane z tej próbki na wykresie kropkowym, który wyświetla rozproszenie do przodu "SSC-A" na osi Y i rozproszenie boczne "FSC-A" na osi X.
Kliknij "wielokąt" i utwórz strategię bramkowania, aby wybrać limfocyty, a następnie odróżnić komórki dawcy i gospodarza za pomocą markerów powierzchni komórki (CD45.1, CD45.2), a następnie scharakteryzować populację komórek CD45.2⁺ (CD3, CD4).
Powtórz kroki analizy z plikiem "control mouse".
Aby wyświetlić populację komórek, kliknij "Edytor układu".
Przeciągnij populację "przeniesionych komórek" i "przeniesionych komórek CD4" z plików "przeniesionych" i "kontrolnych" na kartę "Edytor układu".
Pojawi się wykres punktowy reprezentujący komórki CD45.2⁺ i limfocyty CD4.
Komórki przeniesione do CD45.2 powinny pojawiać się tylko na wykresie kropkowym "przeniesiona mysz".

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Meunier Sylvain^1,2,3, Perchet Thibaut^1,2,3, Sophie Novault⁴, Rachel Golub^1,2,3
¹ Zakład Limfopoezy, Zakład Immunologii, Instytut Pasteura, Par…

Browse More Videos

Adoptive Cell Transfer

Splenocyte Transfer

Flow Cytometry

FACS Analysis

Immune Cell Isolation

CD45 2 Mice

CD45 1 Mice

Lymphocyte Reconstitution

Retro Orbital Injection

Antibody Staining