What is the chromium release assay and why is it used to measure immune cell function?

The chromium release assay quantifies the cytotoxic potential of immune cells like T cells and NK cells by measuring their ability to kill target cells. Target cells are labeled with radioactive chromium-51, co-cultured with effector cells, and cell lysis releases the chromium into the supernatant. A gamma counter measures the radioactivity, providing a quantifiable output of target cell death that reflects immune cell activation and potency.

How does chromium-51 labeling enable detection of target cell death?

Chromium-51 is a radioactive isotope that is rapidly taken up by target cells and nonspecifically labels cellular proteins. When effector cells induce lysis and loss of membrane integrity in target cells, the labeled chromium is released into the culture supernatant. The radioactive chromium spontaneously undergoes gamma radiation decay, which is detected and quantified using a gamma counter to determine the extent of cell death.

What is the role of serial dilutions in the chromium release assay protocol?

Serial dilutions create a range of effector cell concentrations in the assay plate, allowing researchers to establish the relationship between effector cell number and target cell killing. By progressively diluting effector cells across plate rows, the assay generates multiple data points showing how cytotoxic activity varies with different effector-to-target cell ratios, enabling comparison of immune cell potency under different conditions.

Why are control wells essential in the chromium release assay?

Control wells serve critical functions: row A contains target cells alone to measure spontaneous chromium release without effector cells, and row H contains 1% NP-40 detergent to lyse all target cells and determine total counts per minute. These controls establish baseline and maximum chromium release values, enabling calculation of percent specific lysis by accounting for background radioactivity and normalizing experimental results.

How is percent specific lysis calculated from chromium release assay data?

Percent specific lysis is calculated using the formula: (experimental CPM minus spontaneous CPM) divided by (maximum CPM minus spontaneous CPM), then multiplied by 100. Counts per minute from triplicate wells are averaged, and spontaneous release from control wells is subtracted from experimental values. This calculation normalizes results and allows direct comparison of cytotoxic activity between different effector cell populations or treatment conditions.

What safety precautions are necessary when working with chromium-51?

Chromium-51 requires dedicated laboratory space with ample lead shielding for safe storage and handling during all steps. A Geiger counter with a pancake probe must be available to survey for contamination. Proper signage indicates where radioactive samples are kept, and all radioactive materials must be labeled with radioactive tape. Appropriate personal protective equipment, including lab coat and gloves, is essential when handling chromium-51.

How does CpG stimulation affect the cytotoxic capacity of peripheral blood mononuclear cells?

CpG-stimulated peripheral blood mononuclear cells demonstrate significantly enhanced killing of target cells compared to unstimulated cells, particularly as the effector-to-target cell ratio increases. In the assay example, CpG stimulation was necessary for observed increases in target cell lysis, indicating that immune cell activation through CpG stimulation is required to achieve robust cytotoxic responses against melanoma cells.

Test na śmierć komórki: Test uwalniania chromu o zdolności cytotoksycznej

0 wyświetleń11:48 min

Przegląd procedur

Typowy test uwalniania ⁵¹Cr do pomiaru śmierci komórki obejmuje następujące kroki:

Najpierw komórki docelowe są oznaczone symbolem Na₂[⁵¹Cr]O₄. To odróżnia je od komórek efektorowych w teście.
Podczas znakowania komórek docelowych pobiera się komórki efektorowe i, stosując technikę rozcieńczania seryjnego, na 96-dołkowej płytce testowej z okrągłym dnem generowane jest zmniejszające się miareczkowanie komórek efektorowych.
Pod koniec znakowania komórek docelowych komórki są najpierw myte, a następnie do płytki testowej, która zawiera już serię rozcieńczeń komórek efektorowych, dodaje się określoną liczbę komórek.
Następnie mieszanina komórek celu-efektora jest inkubowana przez określony czas, aby umożliwić wystarczającą interakcję komórek z komórkami docelowymi, aby pośredniczyć w lizie komórek.
Na koniec supernatanty hodowlane są zbierane i zbierane do probówek. Ilość ⁵¹Cr jest określana ilościowo za pomocą licznika gamma.
Na koniec dane są zbierane i wykorzystywane do obliczenia "procentowej specyficznej lizy komórek" komórek docelowych.

1. Oznaczanie komórek docelowych za pomocą ⁵¹Cr

Aby rozpocząć, przygotuj komórki docelowe (tutaj - ludzka linia komórkowa czerniaka WM793) do zawiesiny pojedynczej komórki.
W tym celu należy najpierw wyjąć pożywkę z kolby do hodowli tkankowej.
Następnie umyj komórki 5 ml 1X PBS.
Trypsynizuj komórki, dodając 1 ml trypsyny do płytki przez ~2 min.
Delikatnie postukać w kolbę, aby poluzować komórki z powierzchni kolby.
Dodać 5 ml pożywki RPMI do kolby i pipetować pożywkę w górę iw dół, aby odłączyć komórki.
Zebrać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 1200 obr./min. Zdekantować supernatant.
Dodaj 10 ml pożywki do osadu i delikatnie pipetuj pożywkę w górę iw dół, aby doprowadzić komórki do zawiesiny.
Określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru.
Przenieś komórki 1x10⁶ do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
Odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 1200 obr./min i zdekantować supernatant.
Krótko zawirować rurkę, aby ponownie zawiesić osad komórek w małej objętości pozostawionego podłoża.
Dodaj 100 μCi ⁵¹Cr bezpośrednio do zawiesiny komórki docelowej WM793.
Uwaga: Powinna być przygotowana dedykowana przestrzeń laboratoryjna dla tej konkretnej radioaktywności. Ponadto powinno być zapewnione wystarczające ekranowanie ołowiu do bezpiecznego przechowywania i używania ⁵¹Cr podczas wszystkich etapów, a także odpowiednie oznakowanie wskazujące, gdzie przechowywane są próbki z ⁵¹Cr. Niezbędny jest również licznik Geigera wyposażony w sondę naleśnikową, do badania przestrzeni pod kątem ewentualnego zanieczyszczenia.
Dodaj mały kawałek taśmy radioaktywnej do probówki, aby wskazać, że probówka jest teraz radioaktywna.
Umieścić probówkę w inkubatorze o temperaturze 37°C z ołowianą osłoną i inkubować przez 1 godzinę. Przesuwaj probówkę co 15-20 minut, aby zwiększyć wychwyt chromu przez komórki docelowe.
Po okresie inkubacji przemyj komórki docelowe 5 ml FBS, aby usunąć nadmiar ⁵¹Cr.
Odwirować komórki z prędkością 1200 obr./min przez 5 min. Zdekantować radioaktywny FBS do odpowiedniego pojemnika na odpady.
Ponownie zawiesić granulat i umyć po raz drugi za pomocą FBS. Sprawdzić osad pod kątem wbudowanej radioaktywności za pomocą licznika Geigera.
Zawiesić osad w 10 ml kompletnej pożywce, uzyskując stężenie komórek 10⁵ komórek/ml.
Uwaga:Krok liczenia komórek po oznaczeniu ⁵¹Cr jest tutaj pomijany, głównie ze względów bezpieczeństwa. Można założyć, że stężenie komórek WM793 jest takie samo jak przed oznakowaniem ⁵¹Cr.

2. Przygotowanie komórek efektorowych

Można stosować różne komórki efektorowe, takie jak ludzkie lub mysie limfocyty T oraz komórki NK. W tym przykładzie użyto PBMC wyizolowanych z krwi pełnej metodą wirowania w standardowym gradionym gradicynie gęstości (do stężenia 5x10⁶).
Na początek dodaj 100 μl pożywki do hodowli tkankowej do każdego dołka w jednym z rzędów (tutaj rząd A, Patrz tabela 1) 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie. W tym przypadku nie są dodawane żadne komórki efektorowe i będą one służyć jako "ślepa próba" do określenia "minimalnego/spontanicznego uwolnienia ⁵¹Cr" z komórek docelowych.

Tabela 1: ⁵¹Układ testu uwalniania Cr: Wiersz A- Komórki docelowe (10⁴ komórek/ 100 μL) inkubowane tylko z pożywką (generuje "ślepą próbę" w celu określenia "minimalnego/spontanicznego uwolnienia ⁵¹Cr"). Rzędy dołków B do C- zawierających różne proporcje efektora do komórki docelowej (E:T), w zakresie od 50:1 do 1,5:1. Wiersz komórek docelowych H- (10⁴ komórek/100 μL) inkubowanych z 1% NP-40 (NP-40 lizuje komórki docelowe, generując "maksymalne lub całkowite uwolnienie ⁵¹Cr"). Każdy stosunek E:T jest testowany w trzech egzemplarzach dla każdego warunku eksperymentalnego. Kolumna 1-3- niestymulowane PBMC i kolumna 4-6- PBMC stymulowane CpG.

Następnie wygeneruj 2-krotne szeregowe rozcieńczenie komórek PBMC (w trzech egzemplarzach dla każdego warunku eksperymentalnego), aby uzyskać stężenie komórek efektorowych w zakresie od 5x10⁵ do 15,625 komórek/100 μL pożywki (tutaj rzędy od B do G).
Uwaga: W tym przykładzie stosunek początkowy efektora do komórki docelowej (E: T) wynosi 50:1. Stosunek ten można jednak dostosować w zależności od specyfiki eksperymentu.
Pozostaw ostatni wiersz pusty (tutaj wiersz H), nie dodając żadnych komórek efektorowych do tych studzienek. (Ten wiersz zostanie użyty do wygenerowania "całkowitej liczby zliczeń/min, lub (c. p. m)" lub "maksymalnego uwolnienia ⁵¹Cr").
Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37°C, aż komórki docelowe będą gotowe do dodania.

3. Dodanie do testu komórek docelowych ⁵¹Cr oznaczonych WM793 do testu

Po okresie inkubacji wyjąć komórki docelowe z inkubatora i przemyć 5 ml FBS w celu usunięcia nadmiaru ⁵¹Cr.
Odwirować komórki z prędkością 1200 obr./min przez 5 minut, używając przeznaczonej do tego wirówki.
Usunąć płuczkę FBS (radioaktywny supernatant) do odpowiedniego pojemnika na odpady.
Powtórz etap mycia, ponownie zawieszając granulkę w świeżych 5 ml FBS.
Ponownie odwirować komórki z prędkością 1200 obr./min przez 5 minut.
Na koniec ponownie zawiesić osad w 10 ml kompletnego podłoża.
Wlej ⁵¹Zawiesinę komórek WM793 znakowaną Cr (10⁵ komórek/ml) do jednorazowego zbiornika na odczynnik.
Następnie dodaj 100 μl tych znakowanych komórek docelowych do każdej studzienki 96-dołkowej płytki komórki efektorowej, używając pipety wielokanałowej.
Następnie dodaj 100 μL 1% NP-40 (w wodzie) do rzędu studzienek, które są pozbawione jakichkolwiek komórek efektorowych (tutaj rząd H). 1% NP-40 spowoduje lizę komórek docelowych, a zatem te studzienki będą służyć jako kontrole do określenia "całkowitej liczby / min, lub (c. p. m)" lub maksymalnego uwolnienia ⁵¹Cr.
Przymocuj pokrywkę do talerza, dodając mały kawałek taśmy przepuszczającej gaz z każdej strony płytki i umieść kawałek taśmy radioaktywnej na pokrywie, aby wskazać, że zawiera ⁵¹Cr.
Krótko odwirować płytkę z prędkością 1200 obr./min. Jeśli używana jest tylko jedna płytka doświadczalna, dodaj płytkę równoważącą do wirówki.
Uwaga: Ważne jest, aby używać wirówki oznaczonej do pracy z próbkami radioaktywnymi.
Wyjmij płytkę z wirówki.
Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37°C z małym kawałkiem ołowianej osłony nad płytką dla dodatkowego bezpieczeństwa. Inkubować przez 16 godzin, aby umożliwić lizę komórek docelowych.
Uwaga: Okres inkubacji może wynosić od 4 do 18 godzin, w zależności od użytych komórek efektorowych i potencjalnego zastosowanego mechanizmu zabijania.

4. Zbieranie supernatantów

Pod koniec okresu inkubacji ostrożnie usunąć taśmę wokół krawędzi płytki i zdjąć pokrywkę.
Następnie umieść ramkę do zbioru na talerzu, upewniając się, że małe krążki filtracyjne są na swoim miejscu dla każdej z bawełnianych zatyczek. Zapewni to pobranie supernatantu bezkomórkowego.
Teraz powoli i delikatnie wciśnij bawełniane zatyczki do studzienek.
Po około 10 sekundach zwolnij nacisk na bawełniane zatyczki, a następnie przenieś bawełniane zatyczki na paski rurki.
Umieść każdą z tych probówek w wtórnej probówce FACS.
Na koniec załaduj probówki FACS na licznik gamma i uruchom próbki, aby określić ilościowo ilość ⁵¹Cr uwolnionego w każdym stanie. Próbki są zwykle mierzone przez 1 minutę, co pozwala na łatwe określenie "zliczeń na minutę".
Ostrożnie zapisz kolejność, w jakiej rurki zostały załadowane do lady.

5. Analiza danych

W tym przypadku niestymulowane PBMC dodano do pierwszych trzech kolumn, a PBMC stymulowane CpG (CpG ODN, (1 μg/ml) przez 24 godziny) dodano do kolumn 4-6. Patrz tabela 2.

	1	2	3	4	5	6	7	8
A	1251	1157	1086	917	1118	1140
B	1832	1986	1971	7629	7913	8180
C	1677	1739	1428	5454	5055	5268
D	1638	1552	1734	4239	3582	3786
E	1658	1580	1339	2818	2623	2750
F	1579	1472	1483	2028	1779	1769
G	1326	1325	1184	1801	1654	1565
H	9220	9367	8067	8774	9647	8236
I	Średnia z A1,A2,A3 ->		1164.67	Spontaniczny c.p.m		1058.33
J	Średnia z B1,B2,B3 ->		1929.67	9.91%		7907.33	87.50%	50:1
K	Średnia z C1,C2,C3 ->		1614.67	5.83%		5259	53.67%	25:1
L	Średnia z D1,D2,D3 ->		1641.33	6.17%		3869	35.91%	12.5:1
M	Średnia z E1,E2,E3 ->		1525.67	4.68%		2730.33	21.36%	6.25:1
N	Średnia z F1,F2,F3 ->		1511.33	4.49%		1858.67	10.22%	3.12:1
O	Średnia z G1,G2,G3 ->		1278.33	1.47%		1673.33	7.86%	1.56:1
P	Średnia z H1,H2,H3 ->		8884.67	Maksymalny c.p.m		8885.67
				Unstim PBMC			CpG-stim PBMC	Stosunek E:T

Tabela 2: ⁵¹Dane testu uwalniania Cr: Wartości danych "Liczby na minutę" / "c. p. m", średnie wartości c. p. m i obliczone procentowe wartości lizy specyficznej.

Zebrane dane (zliczenia na minutę, czyli c.p.m.) zostały wprowadzone do komórek arkusza kalkulacyjnego w taki sam sposób, w jaki próbki zostały ułożone na oryginalnej płytce.
W pierwszej kolejności obliczono średnie z trzech egzemplarzy. Tabela 2 - komórki od I3 do P3, dla niestymulowanych PBMC i komórki I6 do P6, dla PBMC stymulowanych CpG.
Po ustaleniu średnich obliczono procent specyficznej lizy dla każdego stanu przy użyciu następującego wzoru: -
Procent swoistej lizy obliczono dla każdego stanu (Tabela 2 - komórki J4 do O4, dla niestymulowanych PBMC i J7 do O7, dla niestymulowanych PBMC).

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Frances V. Sjaastad^1,2, Whitney Swanson^2,3 i Thomas S. Griffith^1,2,3,4
¹ Program podyplomowy z mikrobiologii, immunologii i biologii nowotworó…