Test na śmierć komórki: Test uwalniania chromu o zdolności cytotoksycznej

Przegląd procedur

Typowy test uwalniania ⁵¹Cr do pomiaru śmierci komórki obejmuje następujące kroki:

1. Najpierw komórki docelowe są oznaczone symbolem Na₂[⁵¹Cr]O₄. To odróżnia je od komórek efektorowych w teście.
2. Podczas znakowania komórek docelowych pobiera się komórki efektorowe i, stosując technikę rozcieńczania seryjnego, na 96-dołkowej płytce testowej z okrągłym dnem generowane jest zmniejszające się miareczkowanie komórek efektorowych.
3. Pod koniec znakowania komórek docelowych komórki są najpierw myte, a następnie do płytki testowej, która zawiera już serię rozcieńczeń komórek efektorowych, dodaje się określoną liczbę komórek.
4. Następnie mieszanina komórek celu-efektora jest inkubowana przez określony czas, aby umożliwić wystarczającą interakcję komórek z komórkami docelowymi, aby pośredniczyć w lizie komórek.
5. Na koniec supernatanty hodowlane są zbierane i zbierane do probówek. Ilość ⁵¹Cr jest określana ilościowo za pomocą licznika gamma.
6. Na koniec dane są zbierane i wykorzystywane do obliczenia "procentowej specyficznej lizy komórek" komórek docelowych.

1. Oznaczanie komórek docelowych za pomocą ⁵¹Cr

1. Aby rozpocząć, przygotuj komórki docelowe (tutaj - ludzka linia komórkowa czerniaka WM793) do zawiesiny pojedynczej komórki.
2. W tym celu należy najpierw wyjąć pożywkę z kolby do hodowli tkankowej.
3. Następnie umyj komórki 5 ml 1X PBS.
4. Trypsynizuj komórki, dodając 1 ml trypsyny do płytki przez ~2 min.
5. Delikatnie postukać w kolbę, aby poluzować komórki z powierzchni kolby.
6. Dodać 5 ml pożywki RPMI do kolby i pipetować pożywkę w górę iw dół, aby odłączyć komórki.
7. Zebrać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 1200 obr./min. Zdekantować supernatant.
8. Dodaj 10 ml pożywki do osadu i delikatnie pipetuj pożywkę w górę iw dół, aby doprowadzić komórki do zawiesiny.
9. Określ stężenie komórek za pomocą hemocytometru.
10. Przenieś komórki 1x10⁶ do nowej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
11. Odwirować zawiesinę komórek przez 5 minut przy 1200 obr./min i zdekantować supernatant.
12. Krótko zawirować rurkę, aby ponownie zawiesić osad komórek w małej objętości pozostawionego podłoża.
13. Dodaj 100 μCi ⁵¹Cr bezpośrednio do zawiesiny komórki docelowej WM793.
    Uwaga: Powinna być przygotowana dedykowana przestrzeń laboratoryjna dla tej konkretnej radioaktywności. Ponadto powinno być zapewnione wystarczające ekranowanie ołowiu do bezpiecznego przechowywania i używania ⁵¹Cr podczas wszystkich etapów, a także odpowiednie oznakowanie wskazujące, gdzie przechowywane są próbki z ⁵¹Cr. Niezbędny jest również licznik Geigera wyposażony w sondę naleśnikową, do badania przestrzeni pod kątem ewentualnego zanieczyszczenia.
14. Dodaj mały kawałek taśmy radioaktywnej do probówki, aby wskazać, że probówka jest teraz radioaktywna.
15. Umieścić probówkę w inkubatorze o temperaturze 37°C z ołowianą osłoną i inkubować przez 1 godzinę. Przesuwaj probówkę co 15-20 minut, aby zwiększyć wychwyt chromu przez komórki docelowe.
16. Po okresie inkubacji przemyj komórki docelowe 5 ml FBS, aby usunąć nadmiar ⁵¹Cr.
17. Odwirować komórki z prędkością 1200 obr./min przez 5 min. Zdekantować radioaktywny FBS do odpowiedniego pojemnika na odpady.
18. Ponownie zawiesić granulat i umyć po raz drugi za pomocą FBS. Sprawdzić osad pod kątem wbudowanej radioaktywności za pomocą licznika Geigera.
19. Zawiesić osad w 10 ml kompletnej pożywce, uzyskując stężenie komórek 10⁵ komórek/ml.
    Uwaga:Krok liczenia komórek po oznaczeniu ⁵¹Cr jest tutaj pomijany, głównie ze względów bezpieczeństwa. Można założyć, że stężenie komórek WM793 jest takie samo jak przed oznakowaniem ⁵¹Cr.

2. Przygotowanie komórek efektorowych

1. Można stosować różne komórki efektorowe, takie jak ludzkie lub mysie limfocyty T oraz komórki NK. W tym przykładzie użyto PBMC wyizolowanych z krwi pełnej metodą wirowania w standardowym gradionym gradicynie gęstości (do stężenia 5x10⁶).
2. Na początek dodaj 100 μl pożywki do hodowli tkankowej do każdego dołka w jednym z rzędów (tutaj rząd A, Patrz tabela 1) 96-dołkowej płytki o okrągłym dnie. W tym przypadku nie są dodawane żadne komórki efektorowe i będą one służyć jako "ślepa próba" do określenia "minimalnego/spontanicznego uwolnienia ⁵¹Cr" z komórek docelowych.

Tabela 1: ⁵¹Układ testu uwalniania Cr: Wiersz A- Komórki docelowe (10⁴ komórek/ 100 μL) inkubowane tylko z pożywką (generuje "ślepą próbę" w celu określenia "minimalnego/spontanicznego uwolnienia ⁵¹Cr"). Rzędy dołków B do C- zawierających różne proporcje efektora do komórki docelowej (E:T), w zakresie od 50:1 do 1,5:1. Wiersz komórek docelowych H- (10⁴ komórek/100 μL) inkubowanych z 1% NP-40 (NP-40 lizuje komórki docelowe, generując "maksymalne lub całkowite uwolnienie ⁵¹Cr"). Każdy stosunek E:T jest testowany w trzech egzemplarzach dla każdego warunku eksperymentalnego. Kolumna 1-3- niestymulowane PBMC i kolumna 4-6- PBMC stymulowane CpG.

3. Następnie wygeneruj 2-krotne szeregowe rozcieńczenie komórek PBMC (w trzech egzemplarzach dla każdego warunku eksperymentalnego), aby uzyskać stężenie komórek efektorowych w zakresie od 5x10⁵ do 15,625 komórek/100 μL pożywki (tutaj rzędy od B do G).
   Uwaga: W tym przykładzie stosunek początkowy efektora do komórki docelowej (E: T) wynosi 50:1. Stosunek ten można jednak dostosować w zależności od specyfiki eksperymentu.
4. Pozostaw ostatni wiersz pusty (tutaj wiersz H), nie dodając żadnych komórek efektorowych do tych studzienek. (Ten wiersz zostanie użyty do wygenerowania "całkowitej liczby zliczeń/min, lub (c. p. m)" lub "maksymalnego uwolnienia ⁵¹Cr").
5. Umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37°C, aż komórki docelowe będą gotowe do dodania.

3. Dodanie do testu komórek docelowych ⁵¹Cr oznaczonych WM793 do testu

1. Po okresie inkubacji wyjąć komórki docelowe z inkubatora i przemyć 5 ml FBS w celu usunięcia nadmiaru ⁵¹Cr.
2. Odwirować komórki z prędkością 1200 obr./min przez 5 minut, używając przeznaczonej do tego wirówki.
3. Usunąć płuczkę FBS (radioaktywny supernatant) do odpowiedniego pojemnika na odpady.
4. Powtórz etap mycia, ponownie zawieszając granulkę w świeżych 5 ml FBS.
5. Ponownie odwirować komórki z prędkością 1200 obr./min przez 5 minut.
6. Na koniec ponownie zawiesić osad w 10 ml kompletnego podłoża.
7. Wlej ⁵¹Zawiesinę komórek WM793 znakowaną Cr (10⁵ komórek/ml) do jednorazowego zbiornika na odczynnik.
8. Następnie dodaj 100 μl tych znakowanych komórek docelowych do każdej studzienki 96-dołkowej płytki komórki efektorowej, używając pipety wielokanałowej.
9. Następnie dodaj 100 μL 1% NP-40 (w wodzie) do rzędu studzienek, które są pozbawione jakichkolwiek komórek efektorowych (tutaj rząd H). 1% NP-40 spowoduje lizę komórek docelowych, a zatem te studzienki będą służyć jako kontrole do określenia "całkowitej liczby / min, lub (c. p. m)" lub maksymalnego uwolnienia ⁵¹Cr.
10. Przymocuj pokrywkę do talerza, dodając mały kawałek taśmy przepuszczającej gaz z każdej strony płytki i umieść kawałek taśmy radioaktywnej na pokrywie, aby wskazać, że zawiera ⁵¹Cr.
11. Krótko odwirować płytkę z prędkością 1200 obr./min. Jeśli używana jest tylko jedna płytka doświadczalna, dodaj płytkę równoważącą do wirówki.
    Uwaga: Ważne jest, aby używać wirówki oznaczonej do pracy z próbkami radioaktywnymi.
12. Wyjmij płytkę z wirówki.
13. Umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37°C z małym kawałkiem ołowianej osłony nad płytką dla dodatkowego bezpieczeństwa. Inkubować przez 16 godzin, aby umożliwić lizę komórek docelowych.
    Uwaga: Okres inkubacji może wynosić od 4 do 18 godzin, w zależności od użytych komórek efektorowych i potencjalnego zastosowanego mechanizmu zabijania.

4. Zbieranie supernatantów

1. Pod koniec okresu inkubacji ostrożnie usunąć taśmę wokół krawędzi płytki i zdjąć pokrywkę.
2. Następnie umieść ramkę do zbioru na talerzu, upewniając się, że małe krążki filtracyjne są na swoim miejscu dla każdej z bawełnianych zatyczek. Zapewni to pobranie supernatantu bezkomórkowego.
3. Teraz powoli i delikatnie wciśnij bawełniane zatyczki do studzienek.
4. Po około 10 sekundach zwolnij nacisk na bawełniane zatyczki, a następnie przenieś bawełniane zatyczki na paski rurki.
5. Umieść każdą z tych probówek w wtórnej probówce FACS.
6. Na koniec załaduj probówki FACS na licznik gamma i uruchom próbki, aby określić ilościowo ilość ⁵¹Cr uwolnionego w każdym stanie. Próbki są zwykle mierzone przez 1 minutę, co pozwala na łatwe określenie "zliczeń na minutę".
7. Ostrożnie zapisz kolejność, w jakiej rurki zostały załadowane do lady.

5. Analiza danych

1. W tym przypadku niestymulowane PBMC dodano do pierwszych trzech kolumn, a PBMC stymulowane CpG (CpG ODN, (1 μg/ml) przez 24 godziny) dodano do kolumn 4-6. Patrz tabela 2.

	1	2	3	4	5	6	7	8
A	1251	1157	1086	917	1118	1140
B	1832	1986	1971	7629	7913	8180
C	1677	1739	1428	5454	5055	5268
D	1638	1552	1734	4239	3582	3786
E	1658	1580	1339	2818	2623	2750
F	1579	1472	1483	2028	1779	1769
G	1326	1325	1184	1801	1654	1565
H	9220	9367	8067	8774	9647	8236
I	Średnia z A1,A2,A3 ->		1164.67	Spontaniczny c.p.m		1058.33
J	Średnia z B1,B2,B3 ->		1929.67	9.91%		7907.33	87.50%	50:1
K	Średnia z C1,C2,C3 ->		1614.67	5.83%		5259	53.67%	25:1
L	Średnia z D1,D2,D3 ->		1641.33	6.17%		3869	35.91%	12.5:1
M	Średnia z E1,E2,E3 ->		1525.67	4.68%		2730.33	21.36%	6.25:1
N	Średnia z F1,F2,F3 ->		1511.33	4.49%		1858.67	10.22%	3.12:1
O	Średnia z G1,G2,G3 ->		1278.33	1.47%		1673.33	7.86%	1.56:1
P	Średnia z H1,H2,H3 ->		8884.67	Maksymalny c.p.m		8885.67
				Unstim PBMC			CpG-stim PBMC	Stosunek E:T

Tabela 2: ⁵¹Dane testu uwalniania Cr: Wartości danych "Liczby na minutę" / "c. p. m", średnie wartości c. p. m i obliczone procentowe wartości lizy specyficznej.

2. Zebrane dane (zliczenia na minutę, czyli c.p.m.) zostały wprowadzone do komórek arkusza kalkulacyjnego w taki sam sposób, w jaki próbki zostały ułożone na oryginalnej płytce.
3. W pierwszej kolejności obliczono średnie z trzech egzemplarzy. Tabela 2 - komórki od I3 do P3, dla niestymulowanych PBMC i komórki I6 do P6, dla PBMC stymulowanych CpG.
4. Po ustaleniu średnich obliczono procent specyficznej lizy dla każdego stanu przy użyciu następującego wzoru: -
   
   
5. Procent swoistej lizy obliczono dla każdego stanu (Tabela 2 - komórki J4 do O4, dla niestymulowanych PBMC i J7 do O7, dla niestymulowanych PBMC).