Seryjne rozcieńczenia i posiew: oznaczanie liczby drobnoustrojów

1. Konfiguracja

1. Schemat blokowy z listą wszystkich materiałów, stopniowy protokół eksperymentalny i metodę wyrzucania materiałów eksploatacyjnych powinien być zapisany w zeszycie laboratoryjnym i przechowywany w pobliżu miejsca pracy doświadczalnej.
2. Miejsca pracy powinny być wysterylizowane odpowiednim środkiem antyseptycznym (70% etanolu), a eksperymentator powinien ograniczyć ryzyko zanieczyszczenia, nosząc czystą odzież laboratoryjną, która również chroni je przed anomaliami ekspozycji. Odpowiednia odzież to między innymi fartuch laboratoryjny, rękawice lateksowe lub nitrylowe, gogle, respiratory i zamknięte buty. Bardzo ważne jest, aby przez cały czas utrzymywać technikę aseptyczną.
3. Przygotuj 90 ml 0,45% soli fizjologicznej. Za pomocą czystego cylindra z podziałką odmierz 90 ml sterylnej wody i przenieś ją do czystej kolby Erlenmeyera z 0,45% solą fizjologiczną. Odważyć 405 g chlorku sodu (Sigma-Aldrich NaCl S9888) i dodać go do kolby oznaczonej 0,45% solą fizjologiczną. Obracać kilkakrotnie, aż nie będzie widać substancji rozpuszczonej.
4. Po zakończeniu eksperymentator powinien ponownie wysterylizować wszystkie powierzchnie i wyrzucić wszelkie niepożądane organizmy, rozcieńczalniki, szalki Petriego lub jednorazowe pętle inokulacyjne zgodnie z wytycznymi OSHA. Odzież laboratoryjną można zdjąć przed umyciem rąk.

2. Przygotowanie mediów

1. Wybierz pożywkę, która jest odpowiednia do uprawy pożądanego organizmu. W większości scenariuszy bulion umożliwiłby wystarczający wzrost bakterii. Ponieważ pożądane są tu organizmy z protokołu Winogradsky'ego, kolumnę składającą się z węglanu wapnia, siarki, celulozy i błota zmontowano i pozostawiono w spokoju na 7 dni. Wspomniana kolumna jest podzielona na sekcje tlenowe, mikroaerofilne i beztlenowe.
2. Wybierz podłoże odpowiednie do posiewu interesującego Cię organizmu. Uzupełnienie płynnych pożywek agarem klasy mikrobiologicznej jest zwykle stosowane jako środek krzepiący. Pożywka LB/agar jest wystarczająca przy zbieraniu próbek z obszarów tlenowych, mikroaerofilowych i beztlenowych wyżej wymienionej kolumny. Uwaga: Próbki z obszaru mikroaerofilnego nie zostały pobrane do tej procedury. Jednak organizmy te powinny być hodowane w słoikach ze świecami. Wprowadzenie świecy do tej komory uprawowej przed uszczelnieniem tworzy środowisko o niskiej zawartości tlenu, które jest odpowiednie do proliferacji mikroaerofilowej.
3. Ponieważ chcemy przygotować 250 ml, należy użyć kolb Erlenmeyera o pojemności 500 ml (lub większej), aby zapobiec wykipieniu podczas autoklawowania. Oznacz jeden "bulion", a drugi "Agar".
4. Określ ilość pożywki wymaganą do wytworzenia każdego roztworu, postępując zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi stężenia. LB Agar, stosowany tutaj, jest przygotowywany przez połączenie 25g/L z ultraczystą wodą. Nasza objętość 250 ml wymaga roztworu 6,25 funta agaru / 250 ml wody. Podobnie, bulion LB przygotowuje się przez połączenie tego samego stosunku bulionu LB i wody. Ponieważ nie jest uzupełniany środkiem zestalającym, nie twardnieje po schłodzeniu.
5. Zważ podłoże i wymieszaj je z wodą w proporcjach zgodnych z zaleceniami producenta. Dodaj 6,25 g agaru LB do kolby oznaczonej "Agar" i 6,25 g bulionu LB do kolby oznaczonej "Rosół". Dodaj 250 ml ultraczystej wody do każdej kolby.
6. Owinąć każdą kolbę folią aluminiową i użyć autoklawu do sterylizacji pożywki przez co najmniej 15 minut w temperaturze 121°C, 15 psi.
7. Używając żaroodpornej rękawicy lub podkładki, wyjmij kolby z autoklawu po zakończeniu cyklu i umieść je w łaźni wodnej o temperaturze 40-50°C.
8. Po osiągnięciu odpowiedniej temperatury wlać zawartość kolby oznaczonej jako "bulion" do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml lub kolby okrągłodennej. Oznaczyć kolbę o pojemności 250 ml jako "roztwór₀".
9. Zaopatrz się w 10 sterylnych szalek Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm i oznacz je datą, nazwą, rodzajem użytej pożywki i strefą kolumny Winogradsky'ego, z której będą zbierane organizmy.
10. Wyjmij kolbę z napisem "Agar" z łaźni wodnej i zacznij nalewać do każdej z 10 szalek Petriego. Do każdego naczynia nie należy dodawać więcej niż 15 ml. Można to również wykonać za pomocą pipety i pipety serologicznej o pojemności 25 ml w celu poprawy dokładności. Użyj sterylnej końcówki pipety, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, a następnie przykryj pokrywkami płytki i pozostaw na noc do zestalenia.

3. Przygotowanie rozcieńczalnika

1. Przygotuj dziesięć probówek, które mogą pomieścić 20 ml lub więcej w stojaku i oznacz je T1-T10. Każdy numer probówki jest zgodny ze współczynnikiem rozcieńczenia, któremu odpowiada (tj. T4 = 1x10-4 lub 0,0001 lub 1/10 000 stężenia podstawowego).
2. Odpipetuj 9 ml 0,45% soli fizjologicznej do każdej z 10 probówek
.
3. Półfabrykaty soli fizjologicznej są teraz gotowe do sterylizacji w autoklawie. Użyj folii aluminiowej, aby przykryć każdą z 10 probówek, a następnie przenieś je do stojaka na probówki kompatybilnego z autoklawem. Sterylizować przez minimum 15 minut w temperaturze 121°C, 15 psi.
4. Usuń półfabrykaty za pomocą rękawic żaroodpornych i pozostaw do ostygnięcia. Przykryj i przechowuj w temperaturze 4°C do czasu, gdy probówki osiągną temperaturę pokojową lub gdy ostygną w dotyku.

4. Uprawa organizmu docelowego

1. Zaszczepić "roztwór₀" pojedynczą kolonią z uprzednio prążkowanej płytki lub 50 μl zamrożonego bulionu. Dać organizmowi docelowemu czas na replikację, umieszczając zaszczepiony "roztwór₀" w inkubatorze o temperaturze 37°C na noc z wytrząsaniem (jeśli to konieczne). (Uwaga: Kolba powinna być przykryta, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Jeśli organizm docelowy jest tlenowy, użyj sterylnych zatyczek z gazy i bawełny, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Jeśli oceniasz regiony kolumny Winogradsky'ego, po prostu usuń 1 gram z każdej żądanej strefy (tlenowej i beztlenowej dla celów tego badania) i ponownie zawieś w T1 przed przejściem do kroku 5.3.

5. Seryjne rozcieńczanie

1. Zaopatrzyć się w kolbę z napisem "Bulion odżywczy" z inkubatora i energicznie wstrząsnąć.
2. Odpipetować 1 ml "roztworu₀" do probówki oznaczonej T1. Wir T1. Jeśli oceniasz eksplantaty Winogradsky'ego, zważ 1 gram żądanej strefy i dodaj go do T1 przed wirowaniem. (Uwaga: dla uproszczenia stosuje się tutaj 1 ml - można również użyć mniejszych lub większych objętości rozcieńczalnika).
3. Usuń 1 ml z probówki T1 i dodaj go do probówki T2. Wir T2.
4. Wyjmij 1 ml z probówki T2 i dodaj go do probówki T3. Wir T3.
5. Usuń 1 ml z probówki T3 i dodaj go do probówki T4. Wir T4.
6. Wyjmij 1 ml z probówki T4 i dodaj ją do probówki T5. Wir T5.
7. Wyjmij 1 ml z probówki T5 i dodaj go do probówki T6. Wir T6.
8. Wyjmij 1 ml z probówki T6 i dodaj go do probówki T7. Wir T7.
9. Wyjmij 1 ml z probówki T7 i dodaj go do probówki T8. Wir T8.
10. Wyjmij 1 ml z probówki T8 i dodaj go do probówki T9. Wir T9.
11. Usuń 1 ml z probówki T9 i dodaj go do probówki T10.

6. Poszycie rozłożone

1. Odmierzyć pipetą 100 μl rozcieńczonej próbki z T1 bezpośrednio na szalkę Petriego. Ten krok można powtórzyć, ale nie trzeba, dla każdej probówki.
2. Zaopatrz się w sterylny, jednorazowy pręt do rozsiewania lub wysterylizuj płomieniem szklany pręt do rozsiewania. Ruchem zgodnie z ruchem wskazówek zegara/przeciwnie do ruchu wskazówek zegara przesuwaj poziomą część pręta rozprowadzającego, aby równomiernie rozprowadzić próbkę na szalce Petriego.
3. Powtórz te czynności dla każdej strefy kolumny Winogradsky'ego, która ma być oceniana.
4. Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37°C przez 24 godziny. W przypadku organizmów beztlenowych należy użyć komory beztlenowej.

7. Smugi

1. Należy wybrać odpowiednie rozcieńczenie organizmu docelowego. Na przykład roztwór₄ da 1/10 000 rozcieńczenie początkowego stężenia. Zazwyczaj rozcieńczenia 1/1 000^th (T3 / roztwór), 1/1 000^{000 th} (T6 / Roztwór₆) i 1/1 000 000^{000 th} (T9 / roztwór₉) są oceniane w celu wyliczenia drobnoustrojów.
2. Używając plastikowej, sterylnej, jednorazowej pętli do zaszczepiania lub metalowej pętli do zaszczepiania wielokrotnego użytku, która była pod ostrzałem przez co najmniej 10 sekund, zanurz w żądanym roztworze z kroku 5. Skalibrowane pętle inokulacyjne powinny przenosić 0,01 ml. (Uwaga: Nie pozwól, aby płonąca pętla miała kontakt z bakteriami natychmiast po zdjęciu z ognia)
3. Lekko podnieść pokrywę szalki Petriego z jednej strony, tak aby tylko pętla zaszczepiająca miała dostęp do agaru. Przesuwaj pętlę zaszczepiającą po górnej części podłoża w sposób zygzakowaty, uważając, aby nie naruszyć agaru. Opuść pokrywę szalki Petriego.
4. Użyj nowej jednorazowej pętli do zaszczepiania lub ponownie wysterylizuj pętlę wielokrotnego użytku.
5. Obróć płytkę o około 1/3^rd (~118°) i zmniejsz częstotliwość ruchu zygzakowatego.
6. Ponownie użyj nowej jednorazowej pętli lub ponownie wysterylizuj metalową pętlę przed ostatnim obróceniem i ponownie zmniejsz częstotliwość zygzakowatego. Opuść pokrywę szalki Petriego.
7. Powtarzaj kroki 7.2 - 7.6, aż co najmniej trzy szalki Petriego zostaną pokryte smugami w trzech różnych rozcieńczeniach, używając nowej jednorazowej pętli lub ponownie zapalając pętlę wielokrotnego użytku (Rysunek 2).
8. Umieść na noc szalki Petriego w inkubatorze w temperaturze 37°C. W przypadku organizmów beztlenowych użyj komory beztlenowej.

8. Analiza danych i wyniki

1. Kultury zebrano ze stref tlenowych i beztlenowych 7-dniowej kolumny Winogradsky'ego. Strefy te są odpowiednie odpowiednio dla beztlenowców heterotroficznych i utleniających żelazo.
2. Eksplantaty kolumnowe były seryjnie rozcieńczane przed smugami lub rozprowadzeniem na płytkach agarowych LB.
3. Smugi ujawniły mieszaną populację z każdej z ocenianych stref Winogradsky. Płyty rozprowadzające dawały podobne wyniki.
4. Aby obliczyć jtk/ml lub jtk/g, uśrednij liczbę zliczonych kolonii z trzech płytek. Pomnóż średnią liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia i podziel przez ilość podniesioną. Na przykład, jeśli na płytkach zaszczepionych 0,1 ml roztworu₆ (T6) policzono średnio 65 kolonii, opisany wcześniej wzór wynosiłby 650 000 000 CFU/ml.
5. Z każdej płytki można teraz wybrać izolowane kolonie do wykorzystania w testach wzbogacania w celu określenia tożsamości gatunku.