6.2: Seryjne rozcieńczenia i posiew: oznaczanie liczby drobnoustrojów

1. Konfiguracja

1. Schemat blokowy z listą wszystkich materiałów, stopniowy protokół eksperymentalny i metodę wyrzucania materiałów eksploatacyjnych powinien być zapisany w zeszycie laboratoryjnym i przechowywany w pobliżu miejsca pracy doświadczalnej.
2. Miejsca pracy powinny być wysterylizowane odpowiednim środkiem antyseptycznym (70% etanolu), a eksperymentator powinien ograniczyć ryzyko zanieczyszczenia, nosząc czystą odzież laboratoryjną, która również chroni je przed anomaliami ekspozycji. Odpowiednia odzież to między innymi fartuch laboratoryjny, rękawice lateksowe lub nitrylowe, gogle, respiratory i zamknięte buty. Bardzo ważne jest, aby przez cały czas utrzymywać technikę aseptyczną.
3. Przygotuj 90 ml 0,45% soli fizjologicznej. Za pomocą czystego cylindra z podziałką odmierz 90 ml sterylnej wody i przenieś ją do czystej kolby Erlenmeyera z 0,45% solą fizjologiczną. Odważyć 405 g chlorku sodu (Sigma-Aldrich NaCl S9888) i dodać go do kolby oznaczonej 0,45% solą fizjologiczną. Obracać kilkakrotnie, aż nie będzie widać substancji rozpuszczonej.
4. Po zakończeniu eksperymentator powinien ponownie wysterylizować wszystkie powierzchnie i wyrzucić wszelkie niepożądane organizmy, rozcieńczalniki, szalki Petriego lub jednorazowe pętle inokulacyjne zgodnie z wytycznymi OSHA. Odzież laboratoryjną można zdjąć przed umyciem rąk.

2. Przygotowanie mediów

1. Wybierz pożywkę, która jest odpowiednia do uprawy pożądanego organizmu. W większości scenariuszy bulion umożliwiłby wystarczający wzrost bakterii. Ponieważ pożądane są tu organizmy z protokołu Winogradsky'ego, kolumnę składającą się z węglanu wapnia, siarki, celulozy i błota zmontowano i pozostawiono w spokoju na 7 dni. Wspomniana kolumna jest podzielona na sekcje tlenowe, mikroaerofilne i beztlenowe.
2. Wybierz podłoże odpowiednie do posiewu interesującego Cię organizmu. Uzupełnienie płynnych pożywek agarem klasy mikrobiologicznej jest zwykle stosowane jako środek krzepiący. Pożywka LB/agar jest wystarczająca przy zbieraniu próbek z obszarów tlenowych, mikroaerofilowych i beztlenowych wyżej wymienionej kolumny. Uwaga: Próbki z obszaru mikroaerofilnego nie zostały pobrane do tej procedury. Jednak organizmy te powinny być hodowane w słoikach ze świecami. Wprowadzenie świecy do tej komory uprawowej przed uszczelnieniem tworzy środowisko o niskiej zawartości tlenu, które jest odpowiednie do proliferacji mikroaerofilowej.
3. Ponieważ chcemy przygotować 250 ml, należy użyć kolb Erlenmeyera o pojemności 500 ml (lub większej), aby zapobiec wykipieniu podczas autoklawowania. Oznacz jeden "bulion", a drugi "Agar".
4. Określ ilość pożywki wymaganą do wytworzenia każdego roztworu, postępując zgodnie z zaleceniami producenta dotyczącymi stężenia. LB Agar, stosowany tutaj, jest przygotowywany przez połączenie 25g/L z ultraczystą wodą. Nasza objętość 250 ml wymaga roztworu 6,25 funta agaru / 250 ml wody. Podobnie, bulion LB przygotowuje się przez połączenie tego samego stosunku bulionu LB i wody. Ponieważ nie jest uzupełniany środkiem zestalającym, nie twardnieje po schłodzeniu.
5. Zważ podłoże i wymieszaj je z wodą w proporcjach zgodnych z zaleceniami producenta. Dodaj 6,25 g agaru LB do kolby oznaczonej "Agar" i 6,25 g bulionu LB do kolby oznaczonej "Rosół". Dodaj 250 ml ultraczystej wody do każdej kolby.
6. Owinąć każdą kolbę folią aluminiową i użyć autoklawu do sterylizacji pożywki przez co najmniej 15 minut w temperaturze 121°C, 15 psi.
7. Używając żaroodpornej rękawicy lub podkładki, wyjmij kolby z autoklawu po zakończeniu cyklu i umieść je w łaźni wodnej o temperaturze 40-50°C.
8. Po osiągnięciu odpowiedniej temperatury wlać zawartość kolby oznaczonej jako "bulion" do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml lub kolby okrągłodennej. Oznaczyć kolbę o pojemności 250 ml jako "roztwór₀".
9. Zaopatrz się w 10 sterylnych szalek Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm i oznacz je datą, nazwą, rodzajem użytej pożywki i strefą kolumny Winogradsky'ego, z której będą zbierane organizmy.
10. Wyjmij kolbę z napisem "Agar" z łaźni wodnej i zacznij nalewać do każdej z 10 szalek Petriego. Do każdego naczynia nie należy dodawać więcej niż 15 ml. Można to również wykonać za pomocą pipety i pipety serologicznej o pojemności 25 ml w celu poprawy dokładności. Użyj sterylnej końcówki pipety, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, a następnie przykryj pokrywkami płytki i pozostaw na noc do zestalenia.

3. Przygotowanie rozcieńczalnika

1. Przygotuj dziesięć probówek, które mogą pomieścić 20 ml lub więcej w stojaku i oznacz je T1-T10. Każdy numer probówki jest zgodny ze współczynnikiem rozcieńczenia, któremu odpowiada (tj. T4 = 1x10-4 lub 0,0001 lub 1/10 000 stężenia podstawowego).
2. Odpipetuj 9 ml 0,45% soli fizjologicznej do każdej z 10 probówek
.
3. Półfabrykaty soli fizjologicznej są teraz gotowe do sterylizacji w autoklawie. Użyj folii aluminiowej, aby przykryć każdą z 10 probówek, a następnie przenieś je do stojaka na probówki kompatybilnego z autoklawem. Sterylizować przez minimum 15 minut w temperaturze 121°C, 15 psi.
4. Usuń półfabrykaty za pomocą rękawic żaroodpornych i pozostaw do ostygnięcia. Przykryj i przechowuj w temperaturze 4°C do czasu, gdy probówki osiągną temperaturę pokojową lub gdy ostygną w dotyku.

4. Uprawa organizmu docelowego

1. Zaszczepić "roztwór₀" pojedynczą kolonią z uprzednio prążkowanej płytki lub 50 μl zamrożonego bulionu. Dać organizmowi docelowemu czas na replikację, umieszczając zaszczepiony "roztwór₀" w inkubatorze o temperaturze 37°C na noc z wytrząsaniem (jeśli to konieczne). (Uwaga: Kolba powinna być przykryta, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Jeśli organizm docelowy jest tlenowy, użyj sterylnych zatyczek z gazy i bawełny, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Jeśli oceniasz regiony kolumny Winogradsky'ego, po prostu usuń 1 gram z każdej żądanej strefy (tlenowej i beztlenowej dla celów tego badania) i ponownie zawieś w T1 przed przejściem do kroku 5.3.

5. Seryjne rozcieńczanie

1. Zaopatrzyć się w kolbę z napisem "Bulion odżywczy" z inkubatora i energicznie wstrząsnąć.
2. Odpipetować 1 ml "roztworu₀" do probówki oznaczonej T1. Wir T1. Jeśli oceniasz eksplantaty Winogradsky'ego, zważ 1 gram żądanej strefy i dodaj go do T1 przed wirowaniem. (Uwaga: dla uproszczenia stosuje się tutaj 1 ml - można również użyć mniejszych lub większych objętości rozcieńczalnika).
3. Usuń 1 ml z probówki T1 i dodaj go do probówki T2. Wir T2.
4. Wyjmij 1 ml z probówki T2 i dodaj go do probówki T3. Wir T3.
5. Usuń 1 ml z probówki T3 i dodaj go do probówki T4. Wir T4.
6. Wyjmij 1 ml z probówki T4 i dodaj ją do probówki T5. Wir T5.
7. Wyjmij 1 ml z probówki T5 i dodaj go do probówki T6. Wir T6.
8. Wyjmij 1 ml z probówki T6 i dodaj go do probówki T7. Wir T7.
9. Wyjmij 1 ml z probówki T7 i dodaj go do probówki T8. Wir T8.
10. Wyjmij 1 ml z probówki T8 i dodaj go do probówki T9. Wir T9.
11. Usuń 1 ml z probówki T9 i dodaj go do probówki T10.

6. Poszycie rozłożone

1. Odmierzyć pipetą 100 μl rozcieńczonej próbki z T1 bezpośrednio na szalkę Petriego. Ten krok można powtórzyć, ale nie trzeba, dla każdej probówki.
2. Zaopatrz się w sterylny, jednorazowy pręt do rozsiewania lub wysterylizuj płomieniem szklany pręt do rozsiewania. Ruchem zgodnie z ruchem wskazówek zegara/przeciwnie do ruchu wskazówek zegara przesuwaj poziomą część pręta rozprowadzającego, aby równomiernie rozprowadzić próbkę na szalce Petriego.
3. Powtórz te czynności dla każdej strefy kolumny Winogradsky'ego, która ma być oceniana.
4. Inkubować płytki w inkubatorze w temperaturze 37°C przez 24 godziny. W przypadku organizmów beztlenowych należy użyć komory beztlenowej.

7. Smugi

1. Należy wybrać odpowiednie rozcieńczenie organizmu docelowego. Na przykład roztwór₄ da 1/10 000 rozcieńczenie początkowego stężenia. Zazwyczaj rozcieńczenia 1/1 000^th (T3 / roztwór), 1/1 000^{000 th} (T6 / Roztwór₆) i 1/1 000 000^{000 th} (T9 / roztwór₉) są oceniane w celu wyliczenia drobnoustrojów.
2. Używając plastikowej, sterylnej, jednorazowej pętli do zaszczepiania lub metalowej pętli do zaszczepiania wielokrotnego użytku, która była pod ostrzałem przez co najmniej 10 sekund, zanurz w żądanym roztworze z kroku 5. Skalibrowane pętle inokulacyjne powinny przenosić 0,01 ml. (Uwaga: Nie pozwól, aby płonąca pętla miała kontakt z bakteriami natychmiast po zdjęciu z ognia)
3. Lekko podnieść pokrywę szalki Petriego z jednej strony, tak aby tylko pętla zaszczepiająca miała dostęp do agaru. Przesuwaj pętlę zaszczepiającą po górnej części podłoża w sposób zygzakowaty, uważając, aby nie naruszyć agaru. Opuść pokrywę szalki Petriego.
4. Użyj nowej jednorazowej pętli do zaszczepiania lub ponownie wysterylizuj pętlę wielokrotnego użytku.
5. Obróć płytkę o około 1/3^rd (~118°) i zmniejsz częstotliwość ruchu zygzakowatego.
6. Ponownie użyj nowej jednorazowej pętli lub ponownie wysterylizuj metalową pętlę przed ostatnim obróceniem i ponownie zmniejsz częstotliwość zygzakowatego. Opuść pokrywę szalki Petriego.
7. Powtarzaj kroki 7.2 - 7.6, aż co najmniej trzy szalki Petriego zostaną pokryte smugami w trzech różnych rozcieńczeniach, używając nowej jednorazowej pętli lub ponownie zapalając pętlę wielokrotnego użytku (Rysunek 2).
8. Umieść na noc szalki Petriego w inkubatorze w temperaturze 37°C. W przypadku organizmów beztlenowych użyj komory beztlenowej.

8. Analiza danych i wyniki

1. Kultury zebrano ze stref tlenowych i beztlenowych 7-dniowej kolumny Winogradsky'ego. Strefy te są odpowiednie odpowiednio dla beztlenowców heterotroficznych i utleniających żelazo.
2. Eksplantaty kolumnowe były seryjnie rozcieńczane przed smugami lub rozprowadzeniem na płytkach agarowych LB.
3. Smugi ujawniły mieszaną populację z każdej z ocenianych stref Winogradsky. Płyty rozprowadzające dawały podobne wyniki.
4. Aby obliczyć jtk/ml lub jtk/g, uśrednij liczbę zliczonych kolonii z trzech płytek. Pomnóż średnią liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia i podziel przez ilość podniesioną. Na przykład, jeśli na płytkach zaszczepionych 0,1 ml roztworu₆ (T6) policzono średnio 65 kolonii, opisany wcześniej wzór wynosiłby 650 000 000 CFU/ml.
5. Z każdej płytki można teraz wybrać izolowane kolonie do wykorzystania w testach wzbogacania w celu określenia tożsamości gatunku.

Czasami, aby zidentyfikować i zbadać bakterie, musimy najpierw wyizolować je i wzbogacić z próbki. Na przykład próbki uzyskane z kolumny Winogradsky'ego są mieszane, co oznacza, że zawierają wiele gatunków lub szczepów bakterii, więc badanie pojedynczej bakterii lub wyliczenie różnych jej rodzajów może być trudne. W tym celu zwykle stosuje się techniki seryjnego rozcieńczania i posiewu, aby wiarygodnie określić ilościowo obciążenie bakteryjne i wyizolować poszczególne kolonie.

Rozcieńczanie seryjne to proces, w którym stężenie organizmu, w tym przypadku bakterii, jest systematycznie zmniejszane poprzez kolejne ponowne zawieszenie w stałych objętościach płynnego rozcieńczalnika. Zazwyczaj objętość rozcieńczalnika jest wielokrotnością 10, aby ułatwić logarytmiczną redukcję próbki organizmu. Na przykład jeden gram osadu jest najpierw usuwany ze strefy zainteresowania Winogradsky'ego i dodawany do 10 mililitrów odpowiedniego płynnego podłoża. Następnie jeden mililitr tego pierwszego rozcieńczenia dodaje się do innej probówki zawierającej dziewięć mililitrów pożywki. Proces można powtarzać, aż do przygotowania kilku różnych stężeń bakterii. Seryjne rozcieńczanie jest kluczem do wyliczenia bakterii w tym przykładzie, ponieważ mieszane próbki z kolumny Winogradsky'ego zawierają nieznaną, często dużą liczbę bakterii.

Następnie powlekanie smugowe i powlekanie rozsiewające umożliwiają odpowiednio izolację i zliczanie bakterii w próbce. Smugowanie uzyskuje się poprzez wprowadzenie rozcieńczonej próbki do jednej sekcji stałego podłoża uzupełnionego składnikiem odżywczym, który dzieli się na trzy części. Inokulum to jest następnie rozprowadzane na każdej trzeciej płytce w zygzakowaty wzór. Ponieważ różne sekcje płytki są prążkowane, krzyżując się z poprzednią próbką tylko raz, próbka jest rozprowadzana cieńsz. Oznacza to, że może być konieczne tylko smugowanie z jednego rozcieńczenia, aby uzyskać poszczególne kolonie w późniejszych sekcjach. Po inkubacji prążkowane płytki pozwalają na obserwację morfologii kolonii, informacje, które mogą pomóc w rozróżnieniu różnych gatunków bakterii.

Alternatywnie, jeżeli głównym celem jest zliczenie bakterii w próbce, można zastosować posiew. W przypadku powlekania przez rozsiewanie, podwielokrotność pojedynczej próbki jest równomiernie rozprowadzana na całej powierzchni podłoża stałego. Zazwyczaj, ponieważ nie znamy liczby bakterii w zmieszanej próbce, dla każdego z rozcieńczeń lub ich reprezentatywnej próbki wykonuje się płytkę do rozprowadzania. Po inkubacji należy przeprowadzić liczenie za pomocą tych płytek rozsiewających. Wszelkie płytki z liczbą kolonii mniejszą niż 30 należy wyrzucić, ponieważ małe liczby są obarczone większym błędem. Podobnie, wszelkie liczby powyżej 300 powinny zostać odrzucone, ponieważ stłoczenie i nakładanie się kolonii może prowadzić do niedoszacowania liczby kolonii. Jeśli liczba kolonii w każdej z tych pozostałych szalek zostanie zarejestrowana i pomnożona przez współczynnik rozcieńczenia, a następnie podzielona przez objętość platerowaną, otrzyma to jednostki tworzące kolonię lub CFU na mililitr zawiesiny. W tym filmie dowiesz się, jak jakościowo i ilościowo ocenić próbkę zawierającą znaną bakterię oraz społeczności drobnoustrojów zawartych w różnych regionach kolumny Winogradsky'ego za pomocą seryjnego rozcieńczania, powlekania i powlekania smugowego.

Najpierw załóż odpowiedni sprzęt ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny, rękawice i okulary. Następnie wysterylizuj miejsce pracy 70% etanolem i wytrzyj powierzchnię. Następnie zbierz dwie 500-mililitrowe kolby Erlenmeyera i oznacz jeden bulion, a drugi agar. Aby przygotować roztwór agaru LB, wymieszaj około 6,25 grama agaru LB, trzy gramy agaru technicznego i 250 mililitrów wody destylowanej w kolbie oznaczonej jako agar.

Następnie przygotuj bulion LB, łącząc 2. 5 gramów pożywki LB i 100 mililitrów wody destylowanej w kolbie oznaczonej bulionem. Po autoklawowaniu kolb należy użyć rękawicy żaroodpornej, aby wyjąć kolby z autoklawu i umieścić je w łaźni wodnej o temperaturze od 40 do 50 stopni Celsjusza. Gdy kolby osiągną temperaturę 50 stopni Celsjusza, ostrożnie przygotuj trzy 100-mililitrowe porcje roztworu bulionu i oznacz każdą podwielokrotność roztworu jako zero. Następnie zbierz 10 sterylnych szalek Petriego i oznacz je datą, nazwą, rodzajem użytych pożywek oraz strefą Kolumny Winogradzkiego, z której zostaną zebrane organizmy. Odpipetować 15 mililitrów agaru z kolby agarowej do każdej szalki Petriego. Następnie użyj końcówki pipety, aby usunąć wszelkie pęcherzyki, załóż pokrywki płytek i pozwól im zastygnąć na blacie przez noc.

Następnego dnia przetrzyj blat stołu 70% etanolem. Następnie oznacz 10 20-mililitrowych probówek od T1 do T10 i umieść je w stojaku. Odpipetuj dziewięć mililitrów 45% soli fizjologicznej do każdej probówki. Teraz przykryj luźno każdą z 10 probówek ich nakrętkami i przenieś je do stojaka na probówki kompatybilnego z autoklawem. Po zakończeniu cyklu usuń półfabrykaty soli fizjologicznej za pomocą rękawic żaroodpornych i pozwól im ostygnąć. Przechowuj probówki w temperaturze pokojowej, aż osiągną około 22 stopni Celsjusza.

Aby wyhodować znany organizm docelowy, w tym przykładzie E. coli, zaszczepij 100 mililitrów roztworu zero pojedynczą kolonią z wcześniej prążkowanej płytki. Następnie przykryj probówkę i inkubuj ją przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Aby ocenić obszary kolumny Winogradsky'ego, dodaj około jednego grama materiału ze strefy tlenowej do T1 i ponownie zawiesić przez wirowanie. Następnie powtórz ten proces z jednym gramem materiału ze strefy beztlenowej.

Wyjąć z inkubatora probówkę zawierającą roztwór zerowy zaszczepiony bakterią E. coli i wstrząsnąć nią. Następnie odpipetować jeden mililitr roztworu do probówki T1 i odwirować do wymieszania. Usuń jeden mililitr roztworu z T1 i przenieś go do T2, wirując, aby wymieszać. Powtórz ten proces przez rurkę T10. Aby ocenić strefy tlenowe i beztlenowe kolumny Winogradsky'ego, usuń jeden mililitr roztworu z każdej z wcześniej przygotowanych probówek T1 i przenieś go do odpowiednich probówek T2. Następnie kontynuuj seryjne rozcieńczenia przez probówki T10, jak pokazano wcześniej.

Aby rozprowadzić płytkę, należy odpipetować 100 mikrolitrów rozcieńczonej próbki z każdej probówki T3 na odpowiednią szalkę Petriego. Następnie za pomocą sterylnego pręta rozprowadzającego delikatnie rozprowadź próbkę na szalce Petriego i załóż pokrywkę płytki. Powtórzyć ten proces dla rozcieńczeń T6 i T9, jak wykazano wcześniej. Inkubować płytki zawierające organizmy tlenowe w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Inkubować płytki zawierające organizmy beztlenowe w komorze beztlenowej ustawionej na 37 stopni Celsjusza przez 24 godziny. Następnego dnia wyjąć płytki rozcieńczające T3, T6 i T9 z inkubatora i komory beztlenowej i przenieść je na stół laboratoryjny. Pracując z jedną płytką na raz, przesuwaj sterylną pętlę zaszczepiającą po górnej części podłoża w zygzakowaty wzór. Następnie załóż pokrywę szalki Petriego. Następnie obróć płytkę o 1/3 i wysterylizuj pętlę, aby zmniejszyć częstotliwość wcześniej wykonanego zygzakowatego wzoru. Ponownie, po wysterylizowaniu pętli, obróć płytkę o 1/3, po raz ostatni zmniejsz częstotliwość zygzakowatego wzoru i załóż pokrywkę. Powtórz tę metodę smugowania dla pozostałych płytek, jak pokazano wcześniej. Następnie umieść na noc płytki z prążkami zawierające organizmy tlenowe w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, a płytki z prążkami zawierające organizmy beztlenowe w komorze beztlenowej ustawionej na 37 stopni Celsjusza na noc.

Kultury zostały zebrane ze stref tlenowych i beztlenowych siedmiodniowej Kolumny Winogradzkiej. Następnie kultury były seryjnie rozcieńczane przed smugami i rozprowadzeniem na płytkach agarowych LB. Smugi ujawniły mieszaną populację z każdej z ocenianych stref Winogradsky, a płytki rozsiewające dały podobne wyniki. Płytka z prążkami pochodzącymi z mieszanej populacji spowoduje powstanie kolonii bakterii o różnych kształtach, rozmiarach, fakturach i kolorach. W przeciwieństwie do tego, prążkowane i rozłożyste płytki zawierające znany organizm, E. coli, wykazały populację homologiczną. Ogólnie rzecz biorąc, najlepiej jest obliczyć CFU na mililitr przy użyciu średniej liczby kolonii trzech płytek rozprowadzonych z tą samą próbką i współczynnikiem rozcieńczenia. Pomnóż średnią liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia i podziel przez ilość podniesioną. Wreszcie, izolowane kolonie wybrane z każdej płytki mogą być wykorzystane w dalszych testach wzbogacających w celu określenia tożsamości gatunku.