6.3: Kultury wzbogacające: hodowla drobnoustrojów tlenowych i beztlenowych na pożywkach selektywnych i różnicowych

1. Przygotowanie

1. Przed rozpoczęciem dokładnie umyj ręce i załóż rękawiczki o odpowiednim rozmiarze.
2. Wysterylizuj powierzchnię roboczą 5% podchlorynem sodu (wybielaczem) i dokładnie wysusz.
3. Umieścić pętlę do zaszczepiania w pustej kolbie Erlenmeyera o pojemności 120 ml tak, aby nie dotykała blatu stołu podczas pracy.

2. Pożywki i kultury wzrostu

1. Zbierz z lodówki cztery talerze agaru z solą mannitol (MSA), niebieskiego agaru eozyny i metylenu (EMB) i ośmiu agarów sojowych tryptycznych (TSA) (można je kupić w handlu).
2. Umieść talerze na oczyszczonym obszarze roboczym.
3. Zbierz następujące kultury bulionowe: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis i Proteus vulgaris. Zachowaj ostrożność: ponieważ są to organizmy tlenowe, nakrętki rurek powinny być lekko luźne.
4. Umieść wszystkie kultury w stojaku na probówki na oczyszczonej powierzchni roboczej.

3. Przenoszenie kultur i inkubacja

1. Stań lub usiądź na ławce, mając w zasięgu ręki wszystkie materiały.
2. Aby zastosować technikę aseptyczną do przenoszenia bakterii na płytkę, najpierw podpal pętlę, aż zacznie świecić na pomarańczowo - a następnie pozwól jej ostygnąć na powietrzu.
3. Gdy pętla ostygnie, weź kulturę bulionową E. coli, a następnie otwórz nakrętkę małym palcem.
4. Szybko podpal otwór rurki. Zapobiega to zanieczyszczeniu.
5. Zanurz pętlę w rurce i rozprowadź organizm na pierwszej ćwiartce płytki EMB.
6. Po wykonaniu pierwszej serii podpal pętlę, a następnie wykonaj drugą smugę, przecinając pierwszą smugę tylko raz lub dwa razy. Pozwoli to na odizolowanie pojedynczej kolonii i ustalenie, czy nie ma żadnego zanieczyszczenia.
7. Powtarzaj to, aż wszystkie cztery ćwiartki płytki zostaną pokryte smugami.
8. Teraz przenieś każdy z pozostałych czterech organizmów w ten sam sposób powlekania smugowego, tak aby produktem końcowym była jedna płytka MSA, jedna płytka EMB i dwie oddzielne płytki TSA na organizm.
9. Gdy wszystkie organizmy zostaną przeniesione, podpal pętlę po raz ostatni i odłóż ją.
10. Umieścić 1 płytkę TSA z każdym organizmem w opakowaniu z gazem, a następnie wstrząsnąć saszetką z gazem przed umieszczeniem jej w komorze obok płytek. Szczelnie uszczelnić.
11. Inkubować wszystkie płytki w temperaturze 37°C przez noc.
12. Wysterylizuj powierzchnię roboczą po raz ostatni 5% wybielaczem.

4. Odczytywanie i zapisywanie wyników

1. Wyjmij płytki z inkubatora i umieść je na czystym stole laboratoryjnym
2. Zwróć uwagę na wzrost i wzrost organizmów na każdej płytce w zeszycie laboratoryjnym. W szczególności należy sporządzić szczegółowe notatki dotyczące:
   1. Liczba i wielkość kolonii (jeśli występują) na każdej płytce, dla każdego posianego szczepu
   2. Wygląd agaru otaczającego kolonie rosnące na płytkach MSA
   3. Pojawienie się jakichkolwiek kolonii rosnących na płytkach EMB
   4. Różnice we wzroście między płytkami TSA uprawianymi na zewnątrz i wewnątrz opakowania gazowego

Bakterie są w stanie zasiedlić prawie każde środowisko na Ziemi, od pustynnej tundry po tropikalne lasy deszczowe. Ta zdolność do kolonizacji bardzo różnych nisz wynika z ich zdolności adaptacyjnych i ogromnej różnorodności metabolicznej, co pozwala im wykorzystywać szeroką gamę cząsteczek do wytwarzania energii. To właśnie ta ogromna różnorodność prowadzi do zjawiska, że mniej niż 1% gatunków bakterii na naszej planecie uważa się za zdolne do hodowli, a jest to możliwe tylko dzięki zrozumieniu ich specyficznych potrzeb metabolicznych i środowiskowych.

Wykonywanie manipulacji pożywką i środowiskiem w laboratorium nie tylko pozwala naukowcom eksperymentować w celu znalezienia optymalnych warunków do hodowli interesującego gatunku, ale także umożliwia wzbogacenie, czyli proces zmiany warunków w celu selekcji określonych gatunków z mieszanej kultury. Niektóre gatunki drobnoustrojów są generalistami i są w stanie tolerować szeroką gamę stanów lub środowisk. Takie organizmy mogą łatwo rosnąć w warunkach laboratoryjnych, ale mogą również nie rosnąć, jeśli zapewni się im ekstremalne siedlisko - co może pomóc, jeśli celem jest wzbogacenie organizmów z mieszanej kultury, które są tolerancyjne na ten stan.

Wybredne organizmy mogą być hodowane, ale tylko wtedy, gdy spełnione są określone warunki. Na przykład gatunki Neisseria lub Haemophilus wymagają pożywek zawierających częściowo rozbite krwinki czerwone i wysokie stężenie dwutlenku węgla, co może również zniechęcać do wzrostu innych gatunków. Nazwa ekstremofilów pochodzi od ich preferencji do ekstremalnych warunków, takich jak bardzo niskie lub wysokie temperatury, warunki obniżonej ilości tlenu lub brak tlenu lub w obecności wysokiej zawartości soli. Te warunki są prawdopodobnie nie do zniesienia dla większości innych drobnoustrojów.

Aby jeszcze bardziej wzbogacić interesujący organizm, niektóre typy pożywek zawierają wskaźniki, które dają wgląd w metabolizm organizmu. Agar z solą mannitolową hamuje wzrost organizmów wrażliwych na wysoką zawartość soli. Bakterie Gram-ujemne zazwyczaj nie mogą przetrwać, ale Gram-dodatni rodzaj Staphylococcus jest w stanie się rozwijać. Ponadto agar MSA wskazuje wszelkie kolonie zdolne do fermentacji mannitolu, ponieważ kwaśne produkty uboczne fermentacji zmienią czerwony metylowy wskaźnik w pożywce na jasnożółty. Może to pozwolić na bardziej szczegółową selekcję gatunku.

Inne popularne podłoże wzbogacające, błękit metylenowy eozyny, zawiera barwniki eozyny i błękitu metylenowego, które są toksyczne dla organizmów Gram-dodatnich. Zawiera również laktozę i bakterie na tych płytkach, które mogą fermentować, co spowoduje powstanie kwasów, które obniżają pH, zachęcając do wchłaniania barwnika. Kolonie te pochłaniają duże ilości pigmentu i wydają się ciemne i metaliczne. W tym laboratorium będziesz hodować cztery różne organizmy testowe w trzech różnych warunkach pożywki, a następnie w warunkach tlenowych i beztlenowych, zanim zaobserwujesz ich rozwój.

Przed rozpoczęciem eksperymentu należy dokładnie umyć ręce i osuszyć je, zanim założysz odpowiedniej wielkości rękawice laboratoryjne. Następnie wysterylizuj powierzchnię roboczą 5% wybielaczem, dokładnie ją wycierając. Następnie weź sterylną pętlę do zaszczepiania i umieść jej uchwyt w pustej kolbie o pojemności 125 mililitrów, tak aby nie dotykała powierzchni stołu. Następnie z lodówki zbierz cztery płytki agaru z solą mannitol lub MSA, cztery płytki agaru z błękitem metylenowym eozyny, EMB i osiem płytek z agarem sojowym tryptycznym lub TSA. Pożywka TSA to nieselektywna pożywka wzrostowa, która będzie używana w dwóch różnych warunkach środowiskowych. Na koniec zbierz swoje kultury zainteresowań w stojaku na tuby. Tutaj będą uprawiane Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis i Proteus vulgaris.

Na początek zapal palnik Bunsena, który będzie używany do sterylizacji narzędzi. Następnie umieść jedną płytkę MSA, jedną płytkę EMB i dwie płytki TSA pod ręką. Następnie wybierz jedną z kultur bakteryjnych. Zaszczepisz wszystkie cztery z tych płytek pierwszą kulturą. Wolną ręką podnieś pętlę zaszczepiającą, a następnie wysterylizuj ją w płomieniu palnika, aż zaświeci się na pomarańczowo przez kilka sekund. Poczekaj, aż pętla ostygnie w powietrzu. Następnie otwórz probówkę do hodowli bulionu i szybko podpal otwór. Zanurz pętlę w kulturze, a następnie rozprowadź organizm na pierwszej ćwiartce pierwszej płytki. Następnie ponownie wysterylizuj pętlę płomieniem i przełóż smugi na drugi kwadrant. Powtórz tę czynność sterylizacji płomieniowej, a następnie smug, aby ukończyć trzecią i czwartą ćwiartkę. Smugowanie w ten sposób powinno dać izolowane kolonie, a także pozwolić na potwierdzenie, że kultura nie jest skażona.

Teraz załóż pokrywkę i oznacz spód płytki nazwą bakterii, typem podłoża, datą i inicjałami. Następnie powtórz powlekanie smugowe, używając tej samej kultury bakteryjnej dla każdej z pozostałych trzech płytek, uważając, aby za każdym razem je oznaczyć. Teraz, gdy pierwsza kultura została pokryta smugami, powtórz te kroki dla innych bakterii, aby uzyskać jedną zaszczepioną płytkę MSA, jedną płytkę EMB i dwie płytki TSA dla każdego gatunku. Gdy wszystkie organizmy zostaną przeniesione, podpal pętlę po raz ostatni.

Aby określić, które organizmy mogą rosnąć w środowisku o obniżonej zawartości tlenu, otwórz szczelny system komór gazowych i umieść w nim jeden zestaw czterech płytek z bakteriami TSA. Następnie umieść saszetkę z kondycją beztlenową w komorze i szczelnie ją zamknij. Na koniec umieść wszystkie płytki, w tym te znajdujące się wewnątrz szczelnego systemu komory gazowej, w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na noc. Idąc dalej, sprawdzaj płytki co 24 do 48 godzin, aby dać koloniom czas na wzrost i metabolizowanie wszelkich reagentów wskaźnikowych.

Aby ocenić, jak dobrze różne gatunki bakterii zareagowały na każdy warunek wzrostu, najpierw zbadaj płytki pod kątem wzrostu i zapisz, które gatunki były w stanie wytworzyć kolonie na każdym typie pożywki oraz w warunkach beztlenowych i tlenowych. Zwróć uwagę na kolor rosnących organizmów, a także rozmiary i kształt kolonii.

Pożywka z soli mannitolu jest selektywna dla organizmów Gram-dodatnich, które są w stanie przetrwać w 6. 5% chlorek sodu. W tym eksperymencie oznaczało to, że Gram-ujemne E. coli i P. vulgaris nie rosły z powodu wysokich stężeń soli. S. epidermis i S. aureus były jednak w stanie rosnąć, co potwierdza, że są Gram-dodatnie. Ponadto istnieje wyraźna różnica między tymi dwoma gatunkami, ponieważ S. aureus jest w stanie fermentować mannitol, zmieniając wskaźnik czerwieni metylowej w pożywce na jasnożółty z powodu kwaśnych produktów ubocznych fermentacji. Nie zaobserwowano tego w przypadku S. epidermis.

Z drugiej strony pożywka EMB jest selektywna dla organizmów Gram-ujemnych, ponieważ barwniki eozyny i błękitu metylenowego są toksyczne dla komórek Gram-dodatnich. Zewnętrzna błona bakterii Gram-ujemnych zapobiega przedostawaniu się tych toksycznych barwników do komórek, co oznacza, że są one w stanie rosnąć. Co więcej, pożywka ta wskazuje, czy obecne w niej gatunki bakterii są zdolne do fermentacji laktozy. Tutaj kolonie E. coli zmieniają kolor na ciemnofioletowy, czasami z zielonym metalicznym połyskiem wskazującym na fermentację. P. vulgaris rośnie na tym podłożu, ale nie fermentuje laktozy, a więc wydaje się jasnoróżowawy do fioletowego w obecności barwnika. W warunkach beztlenowych gatunki bakterii na pożywce TSA powinny nadal rosnąć, ale mogą to robić bardzo słabo w porównaniu z tymi z dużą ilością tlenu. Wynika to z faktu, że żaden z badanych gatunków nie jest obligatoryjnym beztlenowcem.

Eksperymenty takie jak ten, mające na celu wzbogacenie środowiska wzrostu, mogą pomóc w faworyzowaniu i izolowaniu określonego gatunku z mieszanej próbki. Mogą również pomóc w określeniu optymalnych warunków wzrostu dla różnych gatunków bakterii w warunkach laboratoryjnych, pomagając w ten sposób w dalszych badaniach.