Why is streak plating used instead of spreading bacteria across multiple plates?

Streak plating achieves progressive dilution of a bacterial sample on a single Petri dish, making it far more practical than using multiple plates. A loopful of mixed culture can contain up to one trillion bacteria. Spreading this across enough plates to isolate single colonies would require encircling Liberty Island. Streak plating solves this by systematically diluting bacteria across five sections using a sterile loop between each streak.

What happens when you flame sterilize an inoculation loop between streaks?

Flaming the wire loop until it glows red hot removes any remaining bacterial cells from the previous streak, assisting in dilution. The hot loop is then cooled in air for a few seconds before being dragged through the next section. This cycle of streaking and sterilizing ensures that each subsequent section contains progressively fewer bacteria, eventually yielding isolated colonies.

How does streak plating create isolated bacterial colonies from a mixed sample?

Streak plating divides a Petri dish into five sections and progressively dilutes bacteria using a sterile loop. Each section is streaked with fewer bacteria than the previous one. By the final section, only a few discretely located bacteria remain. Upon incubation, these individual bacteria multiply through binary fission to produce isolated clonal colonies, referred to as Colony Forming Units or CFUs.

What is a pure culture and why is it important in microbiology?

A pure culture consists of only one bacterial type derived from a single mother cell, making all cells genetically similar. Pure cultures are essential for genetic and proteomic examinations, analyzing sample purity, and identifying infectious agents from clinical samples. Re-streaking isolated colonies ensures subsequent work involves only a single bacterial type suitable for further characterization.

How should agar plates be prepared and stored before streak plating?

Prepare media by autoclaving at 121 degrees Celsius for twenty minutes. Pour 20-25 milliliters of approximately 45 degree Celsius media into sterile Petri dishes, avoiding bubble formation. Allow agar to solidify at room temperature for at least two hours or overnight. Store solidified plates upside down at four degrees Celsius to minimize condensation on the medium's surface.

What aseptic techniques must be followed when performing streak plating?

Sterilize the workspace using 70% ethanol before beginning. Use sterile, disposable loops or flame-sterilize wire loops between each streak. Work quickly when removing plate lids and inoculating. Replace lids immediately after streaking to prevent contamination. Seal plates with parafilm if appropriate, and incubate upside down. All media, glassware, and plasticware should be autoclaved before use.

Can streak plating be used for purposes other than isolating single colonies?

Yes, streak plating is also used to select media-specific strains, determine bacterial colony morphology, and identify different bacterial species. The technique can be combined with selective and differential media to inhibit certain organisms or distinguish between them. This versatility makes streak plating a fundamental tool in microbiology for various diagnostic and research applications.

Czyste kultury bakterii i powlekanie smugowe: izolacja pojedynczych kolonii bakteryjnych z próbki mieszanej

0 views09:03 min

1. Ustawić

Wszystkie drobnoustroje należy traktować tak, jakby były niebezpieczne. Zawsze noś fartuch laboratoryjny i rękawice, zwiąż długie włosy i upewnij się, że wszelkie rany są szczególnie dobrze chronione.
Przygotuj miejsce pracy, sterylizując je przy użyciu 70% etanolu.
Upewnij się, że płytki agarowe, roztwór (roztwory) próbki i pudełko z wstępnie wysterylizowanymi plastikowymi pętlami do zaszczepiania lub metalowa pętla plus płomień Bunsena są pod ręką. Jednorazowe, plastikowe pętelki są zazwyczaj wstępnie sterylizowane. Metalowe pętle należy zanurzyć w 70% etanolu, a następnie trzymać w pobliżu niebieskiego obszaru płomienia Bunsena i podgrzewać do ognistego gorąca. Poczekaj, aż drut ostygnie, podnosząc pokrywę płytki (tylko nieznacznie, aby zapobiec zanieczyszczeniu) i stukając nią o zestalone medium.
Każdą procedurę zakończ powtórną sterylizacją miejsca pracy oraz dokładnym umyciem/sterylizacją rąk i nadgarstków.

2. Protokół

Przygotowanie pożywek
1. Zidentyfikuj i przygotuj stałe podłoże (zwykle zawierające 1,5% (w/v) agaru), które utrzyma wykorzystane gatunki/szczepy bakterii. Wymieszaj pożywkę w butelce, która może pomieścić dwa razy większą objętość końcową, aby uniknąć przelania podczas autoklawowania.
2. Wysterylizuj pożywkę, umieszczając butelkę z częściowo dokręconą nakrętką w autoklawie ustawionym na 121°C na 20 minut.
3. Dokładnie zamknij nakrętkę, gdy tylko butelka zostanie wyjęta z autoklawu. Jeśli podłoże ma być używane krótko, umieść butelkę w łaźni wodnej nastawionej na 45°C, aby zachować ją w stanie płynnym. W przeciwnym razie agar zestala się w temperaturze poniżej 32-40°C, a następnie można go ponownie podgrzać (zwykle za pomocą kuchenki mikrofalowej) do temperatury topnienia 85°C.
Przygotowanie płytki(-ek) hodowlanej(-ych)
1. Zaznacz podstawę sterylnych szalek Petriego (zwykle 100 x 15 mm) z boku lub na dole z nazwiskiem eksperymentatora, datą i typem pożywki.
2. Wlać 20-25 ml pożywki do kultur agarowych o temperaturze 45°C (wcześniej przygotowanej) do każdej z oznakowanych płytek. Jeśli na krawędziach pojawi się piana, należy ją szybko usunąć za pomocą zwykłej pipety i sterylnej końcówki.
3. Natychmiast umieść wszystkie pokrywki z powrotem na naczyniach, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
4. Pozostawić agar do zestalenia się na około 2 godziny w temperaturze pokojowej lub na noc w temperaturze 4°C. Po ustawieniu, płytki do hodowli bakteryjnej należy przechowywać do góry nogami w temperaturze 4°C, aby zminimalizować kondensację na powierzchni podłoża.
Powstawanie smug
1. Zanurz sterylną pętlę w pożądanym inokulum i natychmiast rozprowadź pobraną próbkę w pierwszej ćwiartce płytki, wykonując ruch zygzakowaty (Ryc. 1, I).
2. Zamknij pokrywę i ponownie wysterylizuj pętlę inokulacyjną lub zbierz nową sterylną jednorazową pętlę.
3. Wykonaj 3-4 uderzenia promieniście od pierwszej ćwiartki (zawierającej stosunkowo gęstą populację bakterii) w kierunku drugiej ćwiartki płytki (ryc. 1, II).
4. Zamknij pokrywę i ponownie wysterylizuj pętlę inokulacyjną lub wyrzuć jednorazową pętlę i zbierz nową, sterylną.
5. Powtórz ten pasmo 3-4 uderzeń od drugiej do trzeciej ćwiartki, a następnie od trzeciej do czwartej ćwiartki, za każdym razem używając sterylnej pętli (Rysunek 1, III - IV).
6. Za pomocą sterylnej pętli wykonaj ostatnie pociągnięcie zygzakiem od czwartej ćwiartki w kierunku środka płytki (Rysunek 1, V). Częstość występowania bakterii będzie niższa w tym obszarze, co w idealnym przypadku pozwoli na założenie indywidualnych kolonii z pojedynczej, zdolnej do życia komórki macierzystej.
7. Zamknij pokrywę i (jeśli wymagają tego gatunki bakterii) uszczelnij parafilmem, aby zapobiec przepływowi powietrza.
8. W zależności od gatunku/szczepu bakterii, umieść płytkę hodowlaną do góry nogami w odpowiednim środowisku i inkubuj, aż kolonie bakteryjne będą widoczne (oddzielone kolonie mogą pojawić się w dowolnym obszarze płytki, ponieważ początkowe stężenie może się różnić).
9. Aby wygenerować klonalną populację bakterii, należy usunąć kolejną płytkę, wymieniając inokulum posiane na oryginalnej płytce na komórki wyizolowane z pojedynczej kolonii oryginalnej płytki.

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Tilde Andersson¹, Rolf Lood¹
¹ Wydział Nauk Klinicznych Lund, Zakład Medycyny Zakaźnej, Centrum Biomedyczne, Uniwersytet w Lund, 221 00 Lund,…