Why are variable regions of 16S rRNA useful for bacterial identification?

Variable regions of 16S rRNA serve as unique molecular fingerprints for bacterial species because they differ among bacteria while conserved regions remain essential for ribosome function. These variable regions allow scientists to distinguish phenotypically identical strains that appear the same under microscopy or on growth media, making 16S rRNA sequencing more accurate than conventional identification methods.

What are the main steps in a PCR reaction for 16S rRNA amplification?

PCR consists of repeated cycles of three key steps: denaturation of double-stranded DNA template, annealing of universal primer pairs to conserved regions of the gene, and extension of primers by DNA polymerase. Universal primers bind to highly conserved regions, allowing amplification of the 16S rRNA gene in any bacterial species. The process generates millions of copies of the target DNA fragment for subsequent analysis.

How do you evaluate the quality of a PCR product before sequencing?

PCR product quality is assessed using agarose gel electrophoresis, where successful amplification yields a single band of expected size, typically up to 1500 base pairs. The band should appear distinct without smearing or multiple bands, indicating a pure product. If the gel shows multiple bands or no band, the PCR reaction failed and should be repeated with optimized conditions.

What information does a DNA chromatogram reveal about sequencing quality?

A DNA chromatogram displays peaks representing nucleotides in the sequence. An ideal chromatogram has evenly spaced peaks with minimal background signals. Double peaks indicate multiple DNA templates were present, while broad peaks suggest loss of resolution. Poor quality sections typically appear at the five prime and three prime ends and should be removed before database comparison.

How does BLAST database searching confirm bacterial species identity?

After assembling forward and reverse primer sequences into one continuous sequence, the sequence is entered into the BLAST nucleotide database for comparison with reference 16S rRNA sequences. BLAST returns matches ranked by highest similarity, allowing confirmation of bacterial identity. One hundred percent identity with a reference sequence provides definitive species identification.

Why is genomic DNA quality critical before beginning PCR?

High-quality genomic DNA free of contaminants is essential because impurities can inhibit the PCR reaction and prevent successful amplification. DNA should appear as a thick band above 10 kilobases with minimal smearing on an agarose gel. Creating serial dilutions of the isolated DNA helps optimize the template concentration for PCR, improving amplification efficiency and product quality.

What advantages does 16S rRNA sequencing offer over conventional bacterial identification methods?

Sixteen S rRNA sequencing is faster and more accurate than conventional methods like microscopy, growth on selective media, and biochemical tests. It enables identification of bacteria difficult to culture in laboratory conditions and allows discrimination between phenotypically identical strains at the molecular level. This molecular approach provides definitive species and strain identification based on genetic variation.

Sekwencjonowanie 16S rRNA: technika identyfikacji gatunków bakterii oparta na PCR

0 wyświetleń10:57 min

1. Ustawić

Podczas obchodzenia się z mikroorganizmami wymagane jest przestrzeganie dobrej praktyki mikrobiologicznej. Wszystkie mikroorganizmy, zwłaszcza nieznane próbki, powinny być traktowane jako potencjalne patogeny. Postępuj zgodnie z techniką aseptyczną, aby uniknąć zanieczyszczenia próbek, badaczy lub laboratorium. Myj ręce przed i po kontakcie z bakteriami, używaj rękawiczek i noś odzież ochronną.
Przeprowadzenie oceny ryzyka w odniesieniu do protokołu eksperymentalnego dotyczącego izolacji genomowego DNA i oczyszczania produktu metodą PCR. Niektóre odczynniki mogą być szkodliwe!
Czysta kultura jest niezbędna do sekwencjonowania 16S rRNA. Przed przystąpieniem do izolacji genomowego DNA upewnij się, że materiał wyjściowy jest całkowicie czysty. Można to zrobić poprzez powlekanie smugami w celu odizolowania poszczególnych kolonii. Można je dalej uprawiać z smugami na talerzach pojedynczo lub w bulionie, jeśli to konieczne.
Wymagany sprzęt laboratoryjny:
1. Termocykler do PCR. Funkcją termocyklera jest podnoszenie i obniżanie temperatury zgodnie z ustalonym programem. Podczas tworzenia programu zostaniesz poproszony o wprowadzenie wartości temperatury i czasu dla każdego kroku PCR, a także całkowitej liczby cykli.
2. System elektroforezy w żelu agarozowym. Służy do oddzielania fragmentów DNA na podstawie ich wielkości i ładunku. W tym protokole elektroforeza w żelu agarozowym zostanie wykorzystana do wizualizacji jakości wyizolowanego genomowego DNA i produktów PCR.

2. Protokół

Uwaga: Zademonstrowany protokół dotyczy sekwencjonowania genu 16S rRNA z czystej kultury bakterii. Nie dotyczy to badań metagenomicznych.

Hodowla bakterii w celu izolacji genomowego DNA (gDNA).
1. Wyhoduj swój mikroorganizm na odpowiednim podłożu. Na tym etapie można użyć zarówno mediów płynnych, jak i stałych. Wybierz warunki, które dają najlepszy wzrost. Planując eksperyment, należy pamiętać, że wolno rosnące bakterie mogą potrzebować kilku dni, aby osiągnąć późną/stacjonarną fazę wzrostu. W tym protokole Bacillus subtilis 168 hodowano w bulionie lizogenicznym (LB) przez noc w inkubatorze z wytrząsaniem ustawionym na 200 obr./min, 37°C.
Izolacja gDNA.
1. Jeśli bakterie były hodowane na stałym podłożu, zeskrob niektóre komórki za pomocą sterylnej pętli i zawieś je ponownie w 1 ml wody destylowanej
2. Jeśli bakterie były hodowane w płynnym podłożu, użyj około 1,5 ml kultury na noc.
3. Osadzać komórki przez odwirowanie (1 minuta, 12 000 - 16 000 × g), usunąć supernatant i użyć komórek do izolacji gDNA przy użyciu komercyjnego zestawu lub standardowych protokołów [e.g. Przygotowanie całkowitego DNA CTAB (13) lub ekstrakcja fenolowo-chloroformowa (14)]. W tym przypadku użyto komercyjnego zestawu do wyizolowania gDNA z 1,5 ml B. subtilis 168 hodowli nocnej, OD₆₀₀ = 1,5.
  Uwaga 1: W przypadku niektórych bakterii Gram-ujemnych ten krok można pominąć i zastąpić prostym uwalnianiem DNA z komórek przez gotowanie. Zawiesić osad bakteryjny w wodzie destylowanej i inkubować w bloku grzewczym ustawionym na 100 °C przez 10 minut.
  Uwaga 2: Komórki bakterii Gram-dodatnich są trudne do rozbicia. Dlatego zaleca się wybór metody lub zestawu do izolacji gDNA, który jest dedykowany do izolacji z tej grupy bakterii.
Kontrola jakości gDNA.
1. Sprawdź jakość wyizolowanego gDNA za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym. Najpierw wymieszaj 5 μl wyizolowanego gDNA z 1 μl barwnika ładującego (6x) i załaduj próbkę na 0,8% żelu agarozowym, który zawiera odczynnik do barwienia DNA.
2. Załaduj wzorzec masy cząsteczkowej i uruchom elektroforezę, aż przód barwnika dotrze do dna żelu.
3. Po zakończeniu elektroforezy zwizualizuj żel na odpowiednim transiluminatorze (UV lub niebieskim świetle). gDNA pojawia się jako grube pasmo o wysokiej molekularności (powyżej 10 kb). Przykład kontroli jakości gDNA pokazano na Rysunek 3.
4. Jeśli gDNA przejdzie kontrolę jakości (i.e. występuje pasmo wysokocząsteczkowe i rozmazywanie gDNA jest niewielkie lub żadne), rozcieńcz swoje gDNA seryjnie, najpierw znakując 3 probówki mikrowirówkowe w następujący sposób: "10x", "100x" i "1000x".
5. Odpipetować 90 μl sterylnej wody destylowanej do każdej z 3 probówek.
6. Weź 10 μl roztworu gDNA i dodaj go do probówki oznaczonej "10x".
7. Dokładnie odpipetować całą objętość (i.e. 100 μL) w górę i w dół, aby upewnić się, że roztwór jest równomiernie wymieszany. Następnie należy pobrać 10 μl roztworu z tej probówki i przenieść go do probówki oznaczonej "100x".
8. Wymieszać zgodnie z powyższym opisem i powtórzyć tę samą procedurę, przenosząc 10 μl roztworu z probówki "100x" do probówki "1000x". Rozcieńczenia te zostaną wykorzystane jako matryca w reakcji PCR.

Rysunek 3: Elektroforeza gDNA w żelu agarozowym wyizolowana z Bacillus subtilis. Tor 1: M - marker masy cząsteczkowej (od góry do dołu: 10000 pz, 8000 pz, 6000 pz, 5000 pz, 4000 pz, 3500 pz, 3000 pz, 2500 pz, 2000 pz, 1500 pz, 1000 pz). Ścieżka 2: gDNA - genomowe DNA wyizolowane z Bacillus subtilis. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Amplifikacja genu 16S rRNA metodą PCR.
Uwaga: Poniższy protokół PCR jest zoptymalizowany dla konkretnej pary polimerazy DNA i starterów 8F - 1492R (patrz Tabela 1). Optymalizacja protokołu jest wymagana dla każdej pary polimerazy i startera.
1. Rozmrozić wszystkie odczynniki na lodzie.
2. Przygotować główną mieszankę PCR, jak pokazano w tabeli 2. Ponieważ polimeraza DNA jest aktywna w temperaturze pokojowej, układ reakcji musi być przeprowadzony na lodzie, tj. probówki do PCR i składniki reakcji powinny być cały czas trzymane na lodzie. Przygotować jedną reakcję na każdą próbkę gDNA i jedną reakcję do kontroli ujemnej. Kontrola ujemna to mieszanina PCR bez matrycy gDNA i służy do zapewnienia, że inne składniki reakcji nie są zanieczyszczone.
  Uwaga: W przypadku wielu próbek, zwykle przygotowuje się mieszankę wzorcową. Mieszanka wzorcowa jest roztworem zawierającym wszystkie składniki reakcji z wyjątkiem matrycy. Pomaga to uniknąć powtarzającego się pipetowania, uniknąć błędów pipetowania i zapewnia wysoką spójność między próbkami. Aby przygotować mieszaninę wzorcową, należy pomnożyć objętość każdego składnika (z wyjątkiem matrycy DNA) przez liczbę badanych próbek. Wymieszaj wszystkie składniki w probówce do mikrowirówek i kilkakrotnie odpipetuj całą objętość w górę iw dół.
3. Podaniec 49 μl mieszanki wzorcowej do poszczególnych probówek PCR.
4. Dodaj 1 μl szablonu do probówek z mieszanką główną. W celu kontroli ujemnej dodać 1 μl sterylnej wody. Aby upewnić się, że składniki są dobrze wymieszane, delikatnie pipetuj mieszaninę w górę i w dół ~10 razy za pomocą pipety ustawionej na 30-50 μl.
5. Ustaw maszynę do PCR za pomocą programu pokazanego w Tabeli 3.
6. Umieść probówki w maszynie do PCR i uruchom program.
7. Po zakończeniu programu sprawdź jakość produktu PCR za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.
8. Udana reakcja PCR z użyciem pary starterów 8F-1492R daje pojedyncze prążki o wielkości około 1,5 kb (Rysunek 4). Jeśli obecne są inne prążki (tj. niespecyficzne produkty), zoptymalizuj program PCR, dostosowując temperaturę wyżarzania. Jeśli występuje pojedynczy pas o oczekiwanym rozmiarze, przejdź do następnego kroku. W tym przypadku reakcja PCR ze 100-krotnie rozcieńczoną matrycą gDNA dała najlepszy produkt, ponieważ miał ostry pas o oczekiwanej wielkości i brakowało w nim niespecyficznych produktów. W związku z tym wybrano go do oczyszczenia i wysłano do sekwencjonowania.
9. Przed sekwencjonowaniem produkt musi zostać oczyszczony z resztkowych starterów, dezoksyrybonukleotydów, polimerazy i buforu, które były obecne w reakcji PCR. Produkty PCR można wyizolować za pomocą komercyjnego zestawu do oczyszczania PCR. Reakcja PCR jest ładowana do kolumny zawierającej matrycę wiążącą DNA. Produkt PCR wiąże się z kolumną, podczas gdy inne składniki przepływają przez kolumnę. Kolumna jest następnie myta za pomocą buforu myjącego, a na koniec DNA jest eluowane w wybranym buforze. Potwierdzić, że bufor elucyjny, który jest uzupełniony do zestawu, jest kompatybilny z sekwencjonowaniem.
10. Wyślij oczyszczony produkt PCR do sekwencjonowania DNA. Należy postępować zgodnie z wytycznymi dotyczącymi przekazywania próbek do sekwencjonowania w wybranej placówce sekwencjonowania. W celu uzyskania najlepszego pokrycia sekwencji, należy użyć starterów amplifikacyjnych PCR (takich samych jak użyte w sekcji 2.4.1) jako starterów sekwencjonowania. W tym przypadku do sekwencjonowania produktu PCR użyto starterów 8F i 1492R.

Komponent	Końcowe zagęszczenie	Objętość na reakcję	Objętość na x reakcji (miks główny)
5x bufor reakcyjny	1x	10 μL	10 μL × x
10 mM dNTPs	200 μM	1 μL	1 μL × x
10 μM Podkład 8F	0,5 μM	2.5 μL	2,5 μL × x
10 μM Podkład 1492R	0,5 μM	2.5 μL	2.5 μL × x
Polimeraza fuzyjna	1 jednostka	0,5 μL	0,5 μL × x
Szablon DNA *	-	1 μL	-
ddH₂O	-	32.5 μL	32.5 μL × x
Objętość całkowita		50 μL	49 μL × x

Tabela 2: Składniki reakcji PCR. * użyj 10x, 100x lub 1000x rozcieńczonego gDNA z kroku 2.3.

Krok	Temperatura	Czas	Cykle
Początkowa denaturacja	98°C	30 sekund
Denaturacja	98°C	10 sekund	25-30
Wyżarzanie	60°C	30 sekund
Rozszerzenie	72°C	45 sekund
Końcowe rozszerzenie	72°C	7 min
Trzymać	4°C	∞

Tabela 3: Program PCR do amplifikacji genu 16S rRNA.

Rysunek 4: Elektroforeza w żelu agarozowym produktów PCR amplifikowanych przy użyciu starterów 8F i 1492R oraz gDNA jako matrycy. Próbka gDNA z B. subtilis (patrz ryc. 3) została rozcieńczona 10, 100 i 1000 razy w celu uzyskania najlepszego wyniku. Tor 1: M - marker masy cząsteczkowej (od góry do dołu: 10000 pz, 8000 pz, 6000 pz, 5000 pz, 4000 pz, 3500 pz, 3000 pz, 2500 pz, 2000 pz, 1500 pz, 1000 pz, 750 pz, 500 pz, 250 pz). Tor 2: Reakcja PCR z 10x rozcieńczoną matrycą. Tor 3: Reakcja PCR ze 100x rozcieńczoną matrycą. Tor 4: Reakcja PCR z 1000x rozcieńczoną matrycą. Tor 5: (C-) - kontrola negatywna (reakcja bez matrycy DNA). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Analiza danych i wyniki

Uwaga: Produkt PCR jest sekwencjonowany przy użyciu starterów do przodu (tutaj 8F) i do tyłu (tutaj 1492R). W związku z tym generowane są dwa zestawy sekwencji danych, jeden dla startera do przodu i jeden dla startera wstecznego. Dla każdej sekwencji generowane są co najmniej dwa typy plików: i) plik tekstowy zawierający sekwencję DNA oraz ii) chromatogram DNA, który pokazuje jakość przebiegu sekwencjonowania.

W przypadku startera do przodu otwórz chromatogram i dokładnie zbadaj sekwencję. Idealny chromatogram dla sekwencji wysokiej jakości powinien mieć równomiernie rozmieszczone piki i niewiele lub brak sygnałów tła (Rysunek 5A).
Jeżeli chromatogram nie jest wysokiej jakości, sekwencja powinna zostać odrzucona lub plik tekstowy sekwencji powinien zostać poprawiony zgodnie z następującymi zasadami:
1. Obecność podwójnych pików na całym chromatogramie wskazuje na obecność wielu matryc DNA. Może się tak zdarzyć, jeśli kultura bakteryjna nie była czysta. Taką sekwencję należy odrzucić (Rysunek 5B).
2. Niejednoznaczny chromatogram może wynikać z obecności różnokolorowych pików w tym samym miejscu. Jednym z najczęstszych błędów jest obecność dwóch różnokolorowych pików w tej samej pozycji oraz niewłaściwe przypisanie zasad przez oprogramowanie do sekwencjonowania (Rysunek 5C). Ręcznie popraw wszelkie nieprawidłowo przypisane nukleotydy i edytuj je w pliku tekstowym.
3. Chromatogramy o niskiej rozdzielczości mogą powodować powstawanie "szerokich pików", które często powodują błędne zliczanie nukleotydów w tych regionach (Rysunek 5D). Błąd ten jest trudny do skorygowania, a zatem ewentualne niezgodności na dalszym etapie wyrównywania nie powinny być traktowane jako wiarygodne.
4. Słaba jakość odczytu chromatogramu i obecność wielu pików jest powszechnie obserwowana na końcach 5' i 3' sekwencji. Niektóre programy sekwencera automatycznie usuwają te fragmenty niskiej jakości (Rysunek 5E), a nukleotydy nie są zawarte w pliku tekstowym. Jeśli Twoja sekwencja nie została automatycznie obcięta, określ fragmenty niskiej jakości ( np. słaby sygnał , nakładające się szczyty, utrata rozdzielczości) na końcach i usuń odpowiednie podstawy z pliku tekstowego.

Rysunek 5: Przykłady rozwiązywania problemów z sekwencjonowaniem DNA. A) Przykład wysokiej jakości sekwencji chromatogramu (równomiernie rozmieszczone, jednoznaczne piki). B) Słabej jakości sekwencja, która zwykle występuje na początku chromatogramu. Obszar szarej strefy jest uważany za niskiej jakości i automatycznie usuwany przez oprogramowanie do sekwencjonowania. Więcej podstaw można przyciąć ręcznie. C) Obecność podwójnych szczytów (oznaczonych strzałkami). Nukleotyd, który jest oznaczony czerwoną strzałką, został odczytany przez sekwencer jako "T" (czerwony pik), ale niebieski szczyt jest silniejszy i może być również interpretowany jako "C". D) Nakładające się piki wskazują na zanieczyszczenie DNA ( czyli więcej niż jedną matrycę). E) Utrata rozdzielczości i tzw. "szerokie szczyty" (oznaczone prostokątem), które uniemożliwiają wiarygodne wywołanie bazy. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Powtórzyć 3.1 i 3.2 dla odwrotnego startera.
Na koniec złóż sekwencje do przodu i do tyłu w jedną ciągłą sekwencję. Dobry przebieg sekwencjonowania daje sekwencję do 1100 pz. Biorąc pod uwagę, że produkt PCR ma długość ~1500 pz, sekwencje uzyskane przy użyciu starterów do przodu i do tyłu powinny częściowo zachodzić na siebie.
1. Połącz dwie sekwencje za pomocą programu do składania sekwencji DNA, e.g. bezpłatnego narzędzia, takiego jak CAP3 (http://doua.prabi.fr/software/cap3) (15).
2. Wstaw dwie sekwencje w formacie FASTA do wskazanego pola. Kliknij przycisk "Prześlij" i poczekaj na powrót wyników.
3. Aby wyświetlić zmontowaną sekwencję, naciśnij "Contigs" w zakładce wyników. Aby wyświetlić szczegóły osiowania, naciśnij "Szczegóły montażu".
  Uwaga 1: Jeśli oprogramowanie CAP3 jest używane do montażu kontigowego, nie ma potrzeby przekształcania odwrotnej sekwencji starterów na odwrotną komplementarną; Jednak ten krok może być potrzebny, jeśli używany jest inny program.
  Uwaga 2: Format FASTA jest formatem tekstowym reprezentującym sekwencję nukleotydów. Pierwszy wiersz (wiersz opisu) w pliku FASTA zaczyna się od symbolu ">", po którym następuje nazwa lub unikalny identyfikator sekwencji. Po wierszu opisu znajduje się sekwencja nukleotydowa. Wklej swoje sekwencje w następującym formacie:
  
  >sequence_frw_primer
  Wklej swoją sekwencję z pliku tekstowego tutaj
  >sequence_rvs_primer
  Wklej swoją sekwencję z pliku tekstowego tutaj
Przeszukaj bazę danych, odwiedzając stronę internetową narzędzia Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
1. Wybierz narzędzie "Nucleotide BLAST", aby porównać swoją sekwencję z bazą danych.
2. Wprowadź swoją sekwencję (kontig złożony w 3.5) w polu tekstowym "Sekwencja zapytania", a następnie wybierz bazę danych "Sekwencje 16S rRNA (bakterie i Archea)" w menu przewijanym w dół.
3. Naciśnij przycisk "BLAST" u dołu strony. Zostaną zwrócone najbardziej podobne sekwencje. Przykładowy wynik BLAST pokazano na Rysunek 6. W prezentowanym eksperymencie na pierwszym miejscu znalazł się szczep B. subtilis 168, wykazujący 100% identyczność z sekwencją dostępną w bazie danych BLAST.
4. Jeśli górne działanie nie pokazuje 100% tożsamości, przejdź do wyrównania i sprawdź, czy nie ma niezgodności. Po kliknięciu na górne trafienie zostaniesz przekierowany do szczegółów wyrównania. Wyrównane nukleotydy zostaną połączone krótkimi pionowymi liniami, podczas gdy niedopasowane nukleotydy będą miały między sobą przerwę. Wróć do chromatogramu, który otrzymałeś od firmy sekwencjonującej i ponownie popraw sekwencję, skupiając się na niedopasowanym regionie. Popraw sekwencję, jeśli zostaną znalezione dodatkowe błędy. Uruchom BLAST ponownie, używając poprawionej sekwencji.

Rysunek 6: Przykład wyniku NLAST nukleotydu. Jako sekwencję zapytania użyto sekwencji genu 16S rRNA z czystej hodowli B. subtilis 168. Górne trafienie pokazuje 100% identyczność (podkreślone) z B. subtilis szczepem 168, zgodnie z oczekiwaniami. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Źródło: Ewa Bukowska-Faniband¹, Tilde Andersson¹, Rolf Lood¹
¹ Wydział Nauk Klinicznych Lund, Zakład Medycyny Zakaźnej, Centrum Biomedyczne, Uniwersyt…