Krzywe wzrostu: generowanie krzywych wzrostu przy użyciu jednostek tworzących kolonie i pomiarów gęstości optycznej
1. Ustawienie
- Wymagane materiały laboratoryjne: pożywka płynna, zestalone podłoże agarowe, kolby Erlenmeyera, probówki 15 ml, sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), rozsiewacz komórek bakteryjnych, 70% etanol i spektrofotometr. Wszystkie roztwory i naczynia szklane należy wysterylizować przed użyciem.
- Przygotuj stanowisko pracy, sterylizując 70% etanolem. Pracuj w pobliżu palnika Bunsena, aby zapobiec zanieczyszczeniu mediów.
- Podczas pracy z bakteriami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i technikę aseptyczną. Podczas pracy z kulturami bakteryjnymi wymagany jest fartuch laboratoryjny i rękawice.
- Receptury buforów, roztworów i odczynników
- Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (8).
- Rosół Luria-Bertani (LB) (9).
2. Protokół
- Przygotowanie pożywek
- Zidentyfikuj pożywkę wzrostową, za pomocą której hodować bakterie i przygotuj zarówno płynny bulion, jak i stałe podłoże agarowe (1,5% w/v agar) w oddzielnych butelkach do sterylizacji w autoklawie. Tutaj przygotowano bulion LB i agar LB do wzrostu Escherichia coli.
- Sterylizuj pożywkę z częściowo dokręconą nakrętką w autoklawie ustawionym na 121 °C przez 35 minut.
- W przypadku pożywek agarowych, po sterylizacji w autoklawie, umieścić w łaźni wodnej ustawionej na 50 °C na 30 minut do ostygnięcia. Po schłodzeniu wlej 20-25 ml pożywki agarowej do okrągłych szalek Petriego o wymiarach 100x15 mm. Przed użyciem pozwól płytkom zastygnąć na 24 godziny w temperaturze pokojowej.
- Wstępne przygotowanie bakterii
- Z zamrożonego bulionu należy rozszczepić bakterie smugowe do izolacji na wybranym agarze pożywki, aby uzyskać izolaty pojedynczej kolonii. Inkubować w warunkach wzrostu dopuszczalnych dla wybranych bakterii. Tutaj E. coli jest smugowany na agarze LB i inkubowany w temperaturze 37 °C przez noc (16-18 godzin).
- Za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej wybierz pojedynczą kolonię z płytki smugowej i zaszczepij 4 ml płynnej pożywki w probówce o pojemności 15 ml i hoduj w warunkach dopuszczalnych dla wybranych bakterii. Tutaj E. coli jest uprawiany w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 210 obr./min przez noc (16-18 godzin).
- Konfiguracja krzywej wzrostu
- Przygotowanie kolby wzrostowej
- Autoklaw odpowiedniej wielkości kolb Erlenmeyera. Zazwyczaj stosuje się stosunek pożywki do całkowitej objętości kolby 1:5. W tym przypadku stosuje się pożywkę LB o pojemności 100 ml w kolbie o pojemności 500 ml.
- Za pomocą pipety serologicznej przenieść sterylne podłoże do kolby Erlenmeyera.
- Przygotowanie serii rozcieńczeń
- Oznacz probówki o pojemności 15 ml: -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 i -9, rozprowadzając 9 ml PBS do każdej. Liczby te odpowiadają współczynnikowi rozcieńczenia stosowanemu do obliczania jtk/ml. Dla każdego punktu czasowego zbiórki potrzebny jest nowy zestaw probówek. (Rysunek 2)
- Przygotowanie płytki agarowej
- Tabliczki znamionowe z czasem zbioru i współczynnikiem rozcieńczenia. Dla każdego punktu czasowego będzie dostępna jedna tabliczka dla każdego rozcieńczenia.
- Przygotowanie kolby wzrostowej
- Protokół krzywej wzrostu
- Inokulacja pożywek
- Używając płynnej kultury przez noc przygotowanej w ramach kroku 2.2.2, zaszczepić pożywkę kolby kulturą w objętości 1:1000. Tutaj 100 μl płynnej kultury przez noc dodaje się do 100 ml pożywki LB.
- Zamieszaj podłoże, aby równomiernie rozprowadzić bakterie.
- Zbieranie punktów czasowych
- Ustawienie warunków wzrostu
- Umieścić kolbę w eksperymentalnych warunkach wzrostu wybranych dla danej bakterii. Punkty czasowe powinny być często wykonywane w przypadku szybko rosnących bakterii i mogą być wykonywane w dłuższych odstępach czasu w przypadku wolno rosnących bakterii. Tutaj E. coli jest uprawiany w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przy 210 obrotach na minutę (rpm) i punktami czasowymi pobieranymi co 1 godzinę.
- Pomiar gęstości optycznej (OD600)
- W każdym punkcie czasowym, w tym w początkowym punkcie czasowym (t = 0), pobrać 1 ml kultury bakteryjnej i dozować do kuwety spektrofotometru.
- Wytrzyj kuwetę do czysta i zapisz gęstość optyczną przy długości fali 600 nm. Jeżeli odczyt gęstości optycznej jest większy niż 1,0, rozcieńczyć 100 μl kultury w stosunku 1:10 z 900 μl świeżej pożywki, zapisać gęstość optyczną i pomnożyć tę wartość przez 10 dla pomiaru OD600.
- Pomiar jednostki tworzącej kolonię (jtk/ml)
- W każdym punkcie czasowym pobrać 1 ml kultury bakteryjnej i dozować do -1 szklanej probówki zawierającej 9 ml PBS.
- W przypadku serii rozcieńczeń należy przenieść kolejno 1 ml z probówki -1 w dół wszystkich probówek rozcieńczających do -9, wirując po każdym przeniesieniu. (Rysunek 2)
- Do każdego rozcieńczenia należy dozować 100 μl zawiesiny komórek na odpowiednio oznakowaną płytkę agarową z podłożem stałym. (Rysunek 2)
- Za pomocą rozsiewacza komórek, który został wysterylizowany w etanolu, przepuszczony przez płomień palnika Bunsena i schłodzony przez dotknięcie powierzchni agaru, rozprowadź 100 μl zawiesiny komórek, aż powierzchnia płytki agarowej stanie się sucha.
- Inkubuj rozprowadzane płytki do góry nogami w temperaturze, która sprzyja rozwojowi bakterii. Tutaj E. coli inkubuje się w temperaturze 37°C.
- Po inkubacji, gdy pojawią się widoczne kolonie, policz liczbę kolonii bakteryjnych na każdej płytce i zapisz te wartości wraz z powiązanym z nimi współczynnikiem rozcieńczenia dla wszystkich płytek w każdym punkcie czasowym.
- Ustawienie warunków wzrostu
- Inokulacja pożywek
3. Analiza danych i wyniki
- Wykres krzywej wzrostu gęstości optycznej (OD600)
- Wykreśl gęstość optyczną (OD600) w funkcji czasu w skali półlogarytmicznej. (Rysunek 3)
- Wykres krzywej wzrostu jednostki tworzącej kolonie (CFU/mL)
- Dla każdego punktu czasowego wybierz płytkę rozcieńczającą, na której liczba kolonii mieściła się w zakresie 30-300 bakterii. Pomnóż liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia, a następnie przez 10, ponieważ rozpiętość 100 μl jest uważana za dodatkowe rozcieńczenie 1:10 przy obliczaniu CFU/ml.
- Wykreśl jednostki tworzące kolonie w funkcji czasu w skali półlogarytmicznej. (Rysunek 4)
- Dla każdego punktu czasowego wybierz płytkę rozcieńczającą, na której liczba kolonii mieściła się w zakresie 30-300 bakterii. Pomnóż liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia, a następnie przez 10, ponieważ rozpiętość 100 μl jest uważana za dodatkowe rozcieńczenie 1:10 przy obliczaniu CFU/ml.
- Powiązanie gęstości optycznej i jednostek tworzących kolonie
- Wykreśl jednostki tworzące kolonie w funkcji gęstości optycznej na skali liniowej dla odczytów OD600 mniejszych lub równych 1,0 OD600, ponieważ zależność między OD600 a CFU/ml jest mniej dokładna powyżej 1,0 OD600. W tym miejscu wykreślanych jest pierwszych sześć punktów czasowych. (Rysunek 5)
- Wygeneruj linię trendu regresji liniowej, wyświetlając równanie i wartość R2.
- Określanie czasu podwajania bakterii
- Korzystając z wykresu krzywej wzrostu jednostki tworzącej kolonie, w fazie wykładniczej zidentyfikuj dwa punkty na wykresie o największym nachyleniu między nimi, aby obliczyć czas podwojenia.
- Obliczanie czasu podwojenia
- ΔTime = t2 - t1, gdzie t1 = Punkt czasowy 1 i t2 = Punkt czasowy 2
, gdzie b = liczba bakterii w t2, B = liczba bakterii w t1, a n = liczba pokoleń. Pochodzi od: .
- Oblicz czas podwojenia za pomocą:
Źródło: Andrew J. Van Alst1, Rhiannon M. LeVeque1, Natalia Martin1 i Victor J. DiRita1
1 Zakład Mikrobiologii i Genetyki Molekularnej, Uniwersytet Sta…
1. Ustawienie
- Wymagane materiały laboratoryjne: pożywka płynna, zestalone podłoże agarowe, kolby Erlenmeyera, probówki 15 ml, sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), rozsiewacz komórek bakteryjnych, 70% etanol i spektrofotometr. Wszystkie roztwory i naczynia szklane należy wysterylizować przed użyciem.
- Przygotuj stanowisko pracy, sterylizując 70% etanolem. Pracuj w pobliżu palnika Bunsena, aby zapobiec zanieczyszczeniu mediów.
- Podczas pracy z bakteriami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i technikę aseptyczną. Podczas pracy z kulturami bakteryjnymi wymagany jest fartuch laboratoryjny i rękawice.
- Receptury buforów, roztworów i odczynników
- Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (8).
- Rosół Luria-Bertani (LB) (9).
2. Protokół
- Przygotowanie pożywek
- Zidentyfikuj pożywkę wzrostową, za pomocą której hodować bakterie i przygotuj zarówno płynny bulion, jak i stałe podłoże agarowe (1,5% w/v agar) w oddzielnych butelkach do sterylizacji w autoklawie. Tutaj przygotowano bulion LB i agar LB do wzrostu Escherichia coli.
- Sterylizuj pożywkę z częściowo dokręconą nakrętką w autoklawie ustawionym na 121 °C przez 35 minut.
- W przypadku pożywek agarowych, po sterylizacji w autoklawie, umieścić w łaźni wodnej ustawionej na 50 °C na 30 minut do ostygnięcia. Po schłodzeniu wlej 20-25 ml pożywki agarowej do okrągłych szalek Petriego o wymiarach 100x15 mm. Przed użyciem pozwól płytkom zastygnąć na 24 godziny w temperaturze pokojowej.
- Wstępne przygotowanie bakterii
- Z zamrożonego bulionu należy rozszczepić bakterie smugowe do izolacji na wybranym agarze pożywki, aby uzyskać izolaty pojedynczej kolonii. Inkubować w warunkach wzrostu dopuszczalnych dla wybranych bakterii. Tutaj E. coli jest smugowany na agarze LB i inkubowany w temperaturze 37 °C przez noc (16-18 godzin).
- Za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej wybierz pojedynczą kolonię z płytki smugowej i zaszczepij 4 ml płynnej pożywki w probówce o pojemności 15 ml i hoduj w warunkach dopuszczalnych dla wybranych bakterii. Tutaj E. coli jest uprawiany w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 210 obr./min przez noc (16-18 godzin).
- Konfiguracja krzywej wzrostu
- Przygotowanie kolby wzrostowej
- Autoklaw odpowiedniej wielkości kolb Erlenmeyera. Zazwyczaj stosuje się stosunek pożywki do całkowitej objętości kolby 1:5. W tym przypadku stosuje się pożywkę LB o pojemności 100 ml w kolbie o pojemności 500 ml.
- Za pomocą pipety serologicznej przenieść sterylne podłoże do kolby Erlenmeyera.
- Przygotowanie serii rozcieńczeń
- Oznacz probówki o pojemności 15 ml: -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 i -9, rozprowadzając 9 ml PBS do każdej. Liczby te odpowiadają współczynnikowi rozcieńczenia stosowanemu do obliczania jtk/ml. Dla każdego punktu czasowego zbiórki potrzebny jest nowy zestaw probówek. (Rysunek 2)
- Przygotowanie płytki agarowej
- Tabliczki znamionowe z czasem zbioru i współczynnikiem rozcieńczenia. Dla każdego punktu czasowego będzie dostępna jedna tabliczka dla każdego rozcieńczenia.
- Przygotowanie kolby wzrostowej
- Protokół krzywej wzrostu
- Inokulacja pożywek
- Używając płynnej kultury przez noc przygotowanej w ramach kroku 2.2.2, zaszczepić pożywkę kolby kulturą w objętości 1:1000. Tutaj 100 μl płynnej kultury przez noc dodaje się do 100 ml pożywki LB.
- Zamieszaj podłoże, aby równomiernie rozprowadzić bakterie.
- Zbieranie punktów czasowych
- Ustawienie warunków wzrostu
- Umieścić kolbę w eksperymentalnych warunkach wzrostu wybranych dla danej bakterii. Punkty czasowe powinny być często wykonywane w przypadku szybko rosnących bakterii i mogą być wykonywane w dłuższych odstępach czasu w przypadku wolno rosnących bakterii. Tutaj E. coli jest uprawiany w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przy 210 obrotach na minutę (rpm) i punktami czasowymi pobieranymi co 1 godzinę.
- Pomiar gęstości optycznej (OD600)
- W każdym punkcie czasowym, w tym w początkowym punkcie czasowym (t = 0), pobrać 1 ml kultury bakteryjnej i dozować do kuwety spektrofotometru.
- Wytrzyj kuwetę do czysta i zapisz gęstość optyczną przy długości fali 600 nm. Jeżeli odczyt gęstości optycznej jest większy niż 1,0, rozcieńczyć 100 μl kultury w stosunku 1:10 z 900 μl świeżej pożywki, zapisać gęstość optyczną i pomnożyć tę wartość przez 10 dla pomiaru OD600.
- Pomiar jednostki tworzącej kolonię (jtk/ml)
- W każdym punkcie czasowym pobrać 1 ml kultury bakteryjnej i dozować do -1 szklanej probówki zawierającej 9 ml PBS.
- W przypadku serii rozcieńczeń należy przenieść kolejno 1 ml z probówki -1 w dół wszystkich probówek rozcieńczających do -9, wirując po każdym przeniesieniu. (Rysunek 2)
- Do każdego rozcieńczenia należy dozować 100 μl zawiesiny komórek na odpowiednio oznakowaną płytkę agarową z podłożem stałym. (Rysunek 2)
- Za pomocą rozsiewacza komórek, który został wysterylizowany w etanolu, przepuszczony przez płomień palnika Bunsena i schłodzony przez dotknięcie powierzchni agaru, rozprowadź 100 μl zawiesiny komórek, aż powierzchnia płytki agarowej stanie się sucha.
- Inkubuj rozprowadzane płytki do góry nogami w temperaturze, która sprzyja rozwojowi bakterii. Tutaj E. coli inkubuje się w temperaturze 37°C.
- Po inkubacji, gdy pojawią się widoczne kolonie, policz liczbę kolonii bakteryjnych na każdej płytce i zapisz te wartości wraz z powiązanym z nimi współczynnikiem rozcieńczenia dla wszystkich płytek w każdym punkcie czasowym.
- Ustawienie warunków wzrostu
- Inokulacja pożywek
3. Analiza danych i wyniki
- Wykres krzywej wzrostu gęstości optycznej (OD600)
- Wykreśl gęstość optyczną (OD600) w funkcji czasu w skali półlogarytmicznej. (Rysunek 3)
- Wykres krzywej wzrostu jednostki tworzącej kolonie (CFU/mL)
- Dla każdego punktu czasowego wybierz płytkę rozcieńczającą, na której liczba kolonii mieściła się w zakresie 30-300 bakterii. Pomnóż liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia, a następnie przez 10, ponieważ rozpiętość 100 μl jest uważana za dodatkowe rozcieńczenie 1:10 przy obliczaniu CFU/ml.
- Wykreśl jednostki tworzące kolonie w funkcji czasu w skali półlogarytmicznej. (Rysunek 4)
- Dla każdego punktu czasowego wybierz płytkę rozcieńczającą, na której liczba kolonii mieściła się w zakresie 30-300 bakterii. Pomnóż liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia, a następnie przez 10, ponieważ rozpiętość 100 μl jest uważana za dodatkowe rozcieńczenie 1:10 przy obliczaniu CFU/ml.
- Powiązanie gęstości optycznej i jednostek tworzących kolonie
- Wykreśl jednostki tworzące kolonie w funkcji gęstości optycznej na skali liniowej dla odczytów OD600 mniejszych lub równych 1,0 OD600, ponieważ zależność między OD600 a CFU/ml jest mniej dokładna powyżej 1,0 OD600. W tym miejscu wykreślanych jest pierwszych sześć punktów czasowych. (Rysunek 5)
- Wygeneruj linię trendu regresji liniowej, wyświetlając równanie i wartość R2.
- Określanie czasu podwajania bakterii
- Korzystając z wykresu krzywej wzrostu jednostki tworzącej kolonie, w fazie wykładniczej zidentyfikuj dwa punkty na wykresie o największym nachyleniu między nimi, aby obliczyć czas podwojenia.
- Obliczanie czasu podwojenia
- ΔTime = t2 - t1, gdzie t1 = Punkt czasowy 1 i t2 = Punkt czasowy 2
- , gdzie b = liczba bakterii w t2, B = liczba bakterii w t1, a n = liczba pokoleń. Pochodzi od:
.
- Oblicz czas podwojenia za pomocą:
Zaloguj się lub , aby uzyskać dostęp do pełnej treści. Dowiedz się więcej o dostępie Twojej instytucji do treści JoVE tutaj
Bakterie rozmnażają się w procesie zwanym podziałem komórkowym, w wyniku którego powstają dwie identyczne komórki potomne. Jeśli warunki wzrostu są sprzyjające, populacje bakterii będą rosły wykładniczo.
Krzywe wzrostu bakterii przedstawiają ilość bakterii w kulturze w funkcji czasu. Typowa krzywa wzrostu przechodzi przez cztery etapy: fazę opóźnienia, fazę wykładniczą, fazę stacjonarną i fazę śmierci. Faza opóźnienia to czas potrzebny bakteriom na osiągnięcie stanu, w którym mogą szybko rosnąć i dzielić się. Następnie bakterie przechodzą do fazy wykładniczej, charakteryzującej się szybkim wzrostem i podziałem komórek. Tempo wykładniczego wzrostu kultury bakteryjnej w tej fazie można wyrazić jako czas podwojenia, najszybsze tempo, w jakim bakterie mogą się rozmnażać w określonych warunkach. Następnie następuje faza stacjonarna, w której wzrost komórek bakteryjnych utrzymuje się na stałym poziomie, a wskaźniki wzrostu i śmierci wyrównują się z powodu wyczerpania składników odżywczych w środowisku. W końcu bakterie wchodzą w fazę śmierci. W tym miejscu wzrost bakterii gwałtownie spada, a poważny niedobór składników odżywczych prowadzi do lizy komórek.
Dwie techniki można zastosować do ilościowego określenia ilości bakterii obecnych w kulturze i wykreślenia krzywej wzrostu. Pierwszym z nich są jednostki tworzące kolonie lub CFU. Aby otrzymać jtk, przeprowadza się od jednej do dziesięciu serii dziewięciu rozcieńczeń w regularnych punktach czasowych. Pierwsze z tych rozcieńczeń, w tym przykładzie ujemne, zawiera 9 ml PBS i 1 ml kultury bakteryjnej. Daje to współczynnik rozcieńczenia 1:10. Następnie 1 ml tego roztworu przenosi się do następnej probówki, ujemnej dwójki, co daje współczynnik rozcieńczenia 1:100. Proces ten jest kontynuowany przez ostatnią probówkę, ujemną dziewiątkę, co daje końcowy współczynnik rozcieńczenia 1:1 miliarda. Następnie plateruje się 100 mikrolitrów każdego rozcieńczenia. Płytki są następnie inkubowane i liczone są kolonie klonów. Płytka rozcieńczająca dla danego punktu czasowego, w którym rośnie od 30 do 300 kolonii, służy do obliczania CFU na mililitr dla tego punktu czasowego.
Drugą powszechną metodą pomiaru stężenia bakterii jest gęstość optyczna. Gęstość optyczną kultury można zmierzyć natychmiast, w odniesieniu do ślepej próby podłoża, za pomocą spektrofotometru. Zazwyczaj do tych pomiarów używa się fali o długości 600 nanometrów, określanej również jako OD600, która zwiększa się wraz ze wzrostem gęstości komórek. Chociaż gęstość optyczna jest mniej precyzyjna niż CFU, jest wygodna, ponieważ można ją uzyskać natychmiast i wymaga stosunkowo niewielu odczynników. Obie techniki można stosować razem w celu stworzenia krzywej standardowej, która dokładniej przybliża liczbę komórek bakteryjnych w hodowli. W tym filmie dowiesz się, jak uzyskać pomiary CFU i OD600 z czasowych seryjnych rozcieńczeń E. coli. Następnie dwie krzywe wzrostu przy użyciu odpowiednio pomiarów CFU i OD600 zostaną wykreślone przed powiązaniem za pomocą krzywej standardowej.
Podczas pracy z bakteriami ważne jest stosowanie odpowiednich środków ochrony osobistej, takich jak fartuch laboratoryjny i rękawice, oraz przestrzeganie właściwej techniki aseptycznej.
Następnie wysterylizuj stację roboczą 70% etanolem. Najpierw przygotuj bulion LB i stałe podłoże agarowe LB w oddzielnych butelkach do sterylizacji w autoklawie. Po częściowym zamknięciu zakrętek butelek należy sterylizować pożywkę w autoklawie ustawionym na 121 stopni Celsjusza przez 35 minut. Następnie pozwól pożywce agarowej ostygnąć w łaźni wodnej ustawionej na 50 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po schłodzeniu wlej od 20 do 25 ml do każdej szalki Petriego. Następnie pozwól płytkom zastygnąć przez 24 godziny w temperaturze pokojowej.
Aby przygotować izolaty pojedynczej kolonii, które zostaną później wykorzystane do wytworzenia płynnej kultury bakteryjnej, należy użyć wcześniej zamrożonego bulionu i odpowiedniej techniki powlekania smugowego, aby smugować E. coli w celu izolacji na agarze LB. Inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnie schłodzić wysterylizowaną płomieniem pętlę inokulacyjną na agarze przed wybraniem pojedynczej kolonii z płytki z prążkami. Zaszczepić 4 ml płynnego podłoża w probówce o pojemności 15 ml. Następnie hoduj E. coli w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, wstrząsając z prędkością 210 obr./min.
Aby ustawić objętość kultury bakteryjnej w stosunku 1:1000, która zostanie użyta w krzywej wzrostu, należy najpierw uzyskać autoklawowaną kolbę Erlenmeyera o pojemności 500 ml. Następnie za pomocą pipety serologicznej o pojemności 50 ml przenieść 100 ml sterylnego podłoża do kolby. Następnie oznacz kolejno dziewięć probówek o pojemności 15 ml jako od jednej do dziewięciu. Liczby te odpowiadają współczynnikowi rozcieńczenia, który zostanie użyty do obliczenia jednostki tworzącej kolonię lub CFU. Następnie dodaj 9 ml 1X PBS do każdej probówki. Następnie oznacz przygotowane płytki agarowe odpowiednimi punktami czasowymi i współczynnikami rozcieńczenia, które będą uprawiane. W tym przykładzie z E. coli, po początkowym punkcie czasowym, punkty czasowe są pobierane raz na godzinę. Korzystając z uprzednio przygotowanej przez noc płynnej kultury E. coli, zaszczepić pożywkę w autoklawie 500 ml kolby Erlenmeyera z kulturą w objętości 1:1000. Zamieszaj podłoże, aby równomiernie rozprowadzić bakterie.
Po wygaszeniu spektrofotometru wyczyść kuwetę niestrzępiącą się chusteczką. Następnie dozować 1 ml kultury do kuwety i umieścić ją w spektrofotometrze, aby uzyskać gęstość optyczną kultury w punkcie czasowym zero. Następnie hoduj E. coli w temperaturze 37 stopni Celsjusza, wstrząsając przy 210 obr./min. Za każdym razem, punkt po punkcie, należy pobrać kolejny 1 ml kultury bakteryjnej z kolby i powtórzyć pomiar gęstości optycznej. Jeśli odczyt gęstości optycznej jest większy niż 1,0, rozcieńczyć 100 mikrolitrów kultury bakteryjnej 900 mikrolitrami świeżej pożywki, a następnie ponownie zmierzyć gęstość optyczną. Wartość tę można pomnożyć przez 10 dla pomiaru OD 600.
Aby uzyskać jednostkę tworzącą kolonię dla każdego punktu czasowego, należy pobrać dodatkowy 1 ml kultury bakteryjnej z kolby w każdym punkcie czasowym. Dozuj kulturę bakteryjną do ujemnej jednej probówki i wiruj, aby wymieszać. Następnie wykonaj serię rozcieńczeń, przenosząc najpierw 1 ml z ujemnej jednej probówki do ujemnej dwuprobówki i wiruj w celu wymieszania. Przenieś 1 ml z ujemnej probówki z dwóch do ujemnej probówki z trzema rurkami i wymieszaj, aby wymieszać. Kontynuować ten transfer szeregowy w dół wszystkich probówek rozcieńczających do ujemnej dziewiątki. Dozować 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej na odpowiednio oznakowaną płytkę dla każdego rozcieńczenia. Dla każdego rozcieńczenia, wysterylizuj rozsiewacz komórek w etanolu, przepuść go przez płomień palnika Bunsena i schłodzić, dotykając powierzchni agaru z dala od inokulatu. Następnie użyj rozsiewacza komórek, aby rozprowadzić zawiesinę komórek, aż powierzchnia płytki agarowej stanie się sucha. Inkubuj płytki do góry nogami w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Gdy pojawią się widoczne kolonie, policz liczbę kolonii bakteryjnych na każdej płytce. Zapisać te wartości i związane z nimi współczynniki rozcieńczenia dla każdej płytki w każdym punkcie czasowym.
Aby utworzyć krzywą wzrostu OD 600, po upewnieniu się, że wszystkie punkty danych zostały poprawnie wprowadzone do tabeli, wybierz wszystkie punkty czasowe i odpowiadające im dane. Aby wygenerować wykres krzywej wzrostu jednostki tworzącej kolonię, wybierz płytkę rozcieńczającą, na której liczba kolonii mieściła się w zakresie od 30 do 300 bakterii dla każdego punktu czasowego. Pomnóż liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia, a następnie przez dziesięć. Dzieje się tak, ponieważ rozrzut 100 mikrolitrów jest uważany za dodatkowe rozcieńczenie 1:10 przy obliczaniu jednostek tworzących kolonie na mililitr. Następnie wykreśl jednostki tworzące kolonię w funkcji czasu w skali półlogarytmicznej.
Wykresy te wykonane za pomocą pomiarów OD 600 i CFU, odpowiednio, mogą dostarczyć cennych informacji na temat kinetyki wzrostu E. coli. Gęstość optyczna i jednostki tworzące kolonie mogą być powiązane, dzięki czemu CFU na mililitr można oszacować na podstawie pomiarów OD 600, oszczędzając czas i materiały w przyszłych eksperymentach.
Aby to zrobić, wykreśl jednostki tworzące kolonie w stosunku do gęstości optycznej na skali liniowej dla odczytów OD 600 mniejszych lub równych 1. 0. Następnie wygeneruj linię trendu regresji liniowej w formacie Y = MX + B, gdzie M jest nachyleniem, a B jest punktem przecięcia z osią y. Kliknij prawym przyciskiem myszy punkty danych i wybierz dodaj linię trendu i liniową. Następnie zaznacz pole, aby wyświetlić równanie na wykresie i wyświetlić wartość R kwadrat na wykresie. Wartość R kwadrat jest statystyczną miarą tego, jak bardzo dane pasowały do dopasowanej linii regresji. W tym przykładzie pierwsze 6 punktów czasowych jest wykreślanych z OD 600 na osi x i CFU na mililitr na osi y. W przyszłych eksperymentach z tymi samymi warunkami wzrostu, te wartości nachylenia i punktu przecięcia z osią y mogą być włączone do tego równania w celu oszacowania CFU na podstawie odczytów OD 600. Następnie spójrz na wykres krzywej wzrostu jednostki tworzącej kolonie. W fazie wykładniczej zidentyfikuj dwa punkty czasowe z najbardziej stromym nachyleniem między nimi. Aby obliczyć czas podwojenia, najpierw oblicz zmianę czasu między wybranymi punktami czasowymi. Następnie oblicz zmianę w pokoleniach, korzystając z równania pokazanego tutaj. Tutaj mała litera b to liczba bakterii w punkcie czasowym trzecim, a duża litera B to liczba bakterii w punkcie czasowym drugim. Na koniec podziel zmianę w czasie przez zmianę pokoleń. W tym przykładzie czas podwojenia wynosi 0. 26 godzin lub 15 minut i 19 sekund. Porównanie czasów podwojenia w różnych zabiegach eksperymentalnych pozwala nam określić najlepsze warunki wzrostu dla określonego gatunku bakterii. Dlatego zabieg z najkrótszym czasem podwojenia będzie najbardziej optymalnym z badanych warunków.
View the full transcript and gain access to JoVE Science Education videos
Q1: What are the four phases of a bacterial growth curve?
A typical bacterial growth curve progresses through four distinct phases. Lag phase is when bacteria adjust to their environment before rapid growth begins. Exponential phase follows, characterized by rapid cell division and doubling. Stationary phase occurs when growth plateaus due to nutrient depletion. Finally, death phase involves cell lysis from severe nutrient limitation.
Q2: How do colony forming units differ from optical density measurements?
Colony forming units (CFUs) provide direct bacterial cell counts through serial dilution and plate counting, yielding precise CFU/mL values. Optical density measures light absorbance at 600 nanometers (OD600) using a spectrophotometer, offering instant results with fewer reagents. While OD600 is faster and more convenient, CFUs are more accurate, especially at higher cell densities.
Q3: Why is the 30-300 colony range important when counting plates?
The 30-300 colony range minimizes counting error when calculating CFU/mL. Plates with fewer than 30 colonies show high stochastic variation, leading to unreliable estimates. Plates exceeding 300 colonies suffer from crowding and overlapping, causing underestimation. Using plates within this optimal range ensures accurate bacterial enumeration for each time point.
Q4: What is doubling time and how is it calculated?
Doubling time is the fastest rate at which bacteria reproduce under specific growth conditions, measured during the exponential phase. To calculate it, identify two time points with the steepest slope, then compute the change in time and change in generations using the bacterial counts at each point. Dividing time change by generation change yields doubling time, allowing comparison of growth conditions.
Q5: How does a standard curve relate optical density to colony forming units?
A standard curve plots CFU/mL against OD600 on a linear scale for readings at or below 1.0 OD600. A linear regression equation (Y = MX + B) is generated, where M is the slope and B is the y-intercept. This relationship allows researchers to estimate CFU/mL from OD600 measurements in future experiments, saving time and materials while maintaining accuracy.
Q6: What preparation steps are necessary before measuring bacterial growth?
First, prepare LB broth and agar media in separate bottles, then sterilize in an autoclave at 121°C for 35 minutes. Cool agar to 50°C and pour into Petri dishes. Using pure cultures and streak plating isolation of single bacterial colonies, inoculate liquid media overnight at 37°C with shaking. Finally, inoculate a sterile flask with a 1:1000 volume of the overnight culture to begin growth curve measurements.
Q7: Why does the relationship between OD600 and CFU/mL deteriorate at higher optical densities?
The OD600-to-CFU relationship becomes less accurate above 1.0 OD600 because bacterial cells begin changing shape and accumulating extracellular products in the media. These changes influence light absorbance readings independently of actual cell count, causing the spectrophotometer measurement to diverge from true bacterial enumeration. This error becomes pronounced during stationary and death phases.
Rozdziały w tym filmie
0:01
Concepts
3:44
Set-Up
8:52
Data Analysis and Results