Krzywe wzrostu: generowanie krzywych wzrostu przy użyciu jednostek tworzących kolonie i pomiarów gęstości optycznej

1. Ustawienie

1. Wymagane materiały laboratoryjne: pożywka płynna, zestalone podłoże agarowe, kolby Erlenmeyera, probówki 15 ml, sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), rozsiewacz komórek bakteryjnych, 70% etanol i spektrofotometr. Wszystkie roztwory i naczynia szklane należy wysterylizować przed użyciem.
2. Przygotuj stanowisko pracy, sterylizując 70% etanolem. Pracuj w pobliżu palnika Bunsena, aby zapobiec zanieczyszczeniu mediów.
3. Podczas pracy z bakteriami należy stosować odpowiednie środki ochrony osobistej i technikę aseptyczną. Podczas pracy z kulturami bakteryjnymi wymagany jest fartuch laboratoryjny i rękawice.
4. Receptury buforów, roztworów i odczynników
   1. Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (8).
   2. Rosół Luria-Bertani (LB) (9).

2. Protokół

1. Przygotowanie pożywek
   1. Zidentyfikuj pożywkę wzrostową, za pomocą której hodować bakterie i przygotuj zarówno płynny bulion, jak i stałe podłoże agarowe (1,5% w/v agar) w oddzielnych butelkach do sterylizacji w autoklawie. Tutaj przygotowano bulion LB i agar LB do wzrostu Escherichia coli.
   2. Sterylizuj pożywkę z częściowo dokręconą nakrętką w autoklawie ustawionym na 121 °C przez 35 minut.
   3. W przypadku pożywek agarowych, po sterylizacji w autoklawie, umieścić w łaźni wodnej ustawionej na 50 °C na 30 minut do ostygnięcia. Po schłodzeniu wlej 20-25 ml pożywki agarowej do okrągłych szalek Petriego o wymiarach 100x15 mm. Przed użyciem pozwól płytkom zastygnąć na 24 godziny w temperaturze pokojowej.
2. Wstępne przygotowanie bakterii
   1. Z zamrożonego bulionu należy rozszczepić bakterie smugowe do izolacji na wybranym agarze pożywki, aby uzyskać izolaty pojedynczej kolonii. Inkubować w warunkach wzrostu dopuszczalnych dla wybranych bakterii. Tutaj E. coli jest smugowany na agarze LB i inkubowany w temperaturze 37 °C przez noc (16-18 godzin).
   2. Za pomocą sterylnej pętli inokulacyjnej wybierz pojedynczą kolonię z płytki smugowej i zaszczepij 4 ml płynnej pożywki w probówce o pojemności 15 ml i hoduj w warunkach dopuszczalnych dla wybranych bakterii. Tutaj E. coli jest uprawiany w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 210 obr./min przez noc (16-18 godzin).
3. Konfiguracja krzywej wzrostu
   1. Przygotowanie kolby wzrostowej
      1. Autoklaw odpowiedniej wielkości kolb Erlenmeyera. Zazwyczaj stosuje się stosunek pożywki do całkowitej objętości kolby 1:5. W tym przypadku stosuje się pożywkę LB o pojemności 100 ml w kolbie o pojemności 500 ml.
      2. Za pomocą pipety serologicznej przenieść sterylne podłoże do kolby Erlenmeyera.
   2. Przygotowanie serii rozcieńczeń
      1. Oznacz probówki o pojemności 15 ml: -1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8 i -9, rozprowadzając 9 ml PBS do każdej. Liczby te odpowiadają współczynnikowi rozcieńczenia stosowanemu do obliczania jtk/ml. Dla każdego punktu czasowego zbiórki potrzebny jest nowy zestaw probówek. (Rysunek 2)
   3. Przygotowanie płytki agarowej
      1. Tabliczki znamionowe z czasem zbioru i współczynnikiem rozcieńczenia. Dla każdego punktu czasowego będzie dostępna jedna tabliczka dla każdego rozcieńczenia.
4. Protokół krzywej wzrostu
   1. Inokulacja pożywek
      1. Używając płynnej kultury przez noc przygotowanej w ramach kroku 2.2.2, zaszczepić pożywkę kolby kulturą w objętości 1:1000. Tutaj 100 μl płynnej kultury przez noc dodaje się do 100 ml pożywki LB.
      2. Zamieszaj podłoże, aby równomiernie rozprowadzić bakterie.
   2. Zbieranie punktów czasowych
      1. Ustawienie warunków wzrostu
         1. Umieścić kolbę w eksperymentalnych warunkach wzrostu wybranych dla danej bakterii. Punkty czasowe powinny być często wykonywane w przypadku szybko rosnących bakterii i mogą być wykonywane w dłuższych odstępach czasu w przypadku wolno rosnących bakterii. Tutaj E. coli jest uprawiany w temperaturze 37°C z wytrząsaniem przy 210 obrotach na minutę (rpm) i punktami czasowymi pobieranymi co 1 godzinę.
      2. Pomiar gęstości optycznej (OD600)
         1. W każdym punkcie czasowym, w tym w początkowym punkcie czasowym (t = 0), pobrać 1 ml kultury bakteryjnej i dozować do kuwety spektrofotometru.
         2. Wytrzyj kuwetę do czysta i zapisz gęstość optyczną przy długości fali 600 nm. Jeżeli odczyt gęstości optycznej jest większy niż 1,0, rozcieńczyć 100 μl kultury w stosunku 1:10 z 900 μl świeżej pożywki, zapisać gęstość optyczną i pomnożyć tę wartość przez 10 dla pomiaru OD600.
      3. Pomiar jednostki tworzącej kolonię (jtk/ml)
         1. W każdym punkcie czasowym pobrać 1 ml kultury bakteryjnej i dozować do -1 szklanej probówki zawierającej 9 ml PBS.
         2. W przypadku serii rozcieńczeń należy przenieść kolejno 1 ml z probówki -1 w dół wszystkich probówek rozcieńczających do -9, wirując po każdym przeniesieniu. (Rysunek 2)
         3. Do każdego rozcieńczenia należy dozować 100 μl zawiesiny komórek na odpowiednio oznakowaną płytkę agarową z podłożem stałym. (Rysunek 2)
         4. Za pomocą rozsiewacza komórek, który został wysterylizowany w etanolu, przepuszczony przez płomień palnika Bunsena i schłodzony przez dotknięcie powierzchni agaru, rozprowadź 100 μl zawiesiny komórek, aż powierzchnia płytki agarowej stanie się sucha.
         5. Inkubuj rozprowadzane płytki do góry nogami w temperaturze, która sprzyja rozwojowi bakterii. Tutaj E. coli inkubuje się w temperaturze 37°C.
         6. Po inkubacji, gdy pojawią się widoczne kolonie, policz liczbę kolonii bakteryjnych na każdej płytce i zapisz te wartości wraz z powiązanym z nimi współczynnikiem rozcieńczenia dla wszystkich płytek w każdym punkcie czasowym.

3. Analiza danych i wyniki

1. Wykres krzywej wzrostu gęstości optycznej (OD600)
   1. Wykreśl gęstość optyczną (OD600) w funkcji czasu w skali półlogarytmicznej. (Rysunek 3)
2. Wykres krzywej wzrostu jednostki tworzącej kolonie (CFU/mL)
   1. Dla każdego punktu czasowego wybierz płytkę rozcieńczającą, na której liczba kolonii mieściła się w zakresie 30-300 bakterii. Pomnóż liczbę kolonii przez współczynnik rozcieńczenia, a następnie przez 10, ponieważ rozpiętość 100 μl jest uważana za dodatkowe rozcieńczenie 1:10 przy obliczaniu CFU/ml.
      
   2. Wykreśl jednostki tworzące kolonie w funkcji czasu w skali półlogarytmicznej. (Rysunek 4)
3. Powiązanie gęstości optycznej i jednostek tworzących kolonie
   1. Wykreśl jednostki tworzące kolonie w funkcji gęstości optycznej na skali liniowej dla odczytów OD600 mniejszych lub równych 1,0 OD600, ponieważ zależność między OD600 a CFU/ml jest mniej dokładna powyżej 1,0 OD600. W tym miejscu wykreślanych jest pierwszych sześć punktów czasowych. (Rysunek 5)
   2. Wygeneruj linię trendu regresji liniowej, wyświetlając równanie i wartość R².
4. Określanie czasu podwajania bakterii
   1. Korzystając z wykresu krzywej wzrostu jednostki tworzącej kolonie, w fazie wykładniczej zidentyfikuj dwa punkty na wykresie o największym nachyleniu między nimi, aby obliczyć czas podwojenia.
   2. Obliczanie czasu podwojenia
      1. 
      2. ΔTime = t₂ - t₁, gdzie t₁ = Punkt czasowy 1 i t₂ = Punkt czasowy 2
      3. , gdzie b = liczba bakterii w t₂, B = liczba bakterii w t₁, a n = liczba pokoleń. Pochodzi od: .
      4. Oblicz czas podwojenia za pomocą: