Badanie wrażliwości na antybiotyki: testy epsilometryczne w celu określenia wartości MIC dwóch antybiotyków i oceny synergii antybiotyków

1. Badania epsilometryczne (E-testy)

1. Ustawiać
   1. Załóż rękawice i fartuch laboratoryjny
   2. Przygotuj miejsce pracy, sterylizując je przy użyciu 70% etanolu
   3. Zbieranie płytek agarowych Muellera-Hintona (płytki MHA)
2. Przygotowanie wzorca mętności McFarlanda nr 0,5
   1. Przygotować 1% roztwór chlorku baru (BaCl₂):
      Dodać 1 gram bezwodnego chlorku baru (BaCl₂) do 100 ml wody destylowanej. Dobrze wirować.
   2. Przygotuj 1% roztwór kwasu siarkowego (H₂SO₄):
      Dodaj 1 ml stężonego H₂SO₄ w 99 ml wody destylowanej. Dobrze wirować.
   3. Przygotuj wzorzec mętności McFarlanda nr 0,5:
      50 μL BaCl₂ roztworu w 5 ml 1% roztworu H₂SO₄. Dobrze wymieszaj roztwór, aby uzyskać mętną zawiesinę.
   4. Utrzymuj wzorzec zmętnienia McFarland nr 0,5 w probówce pokrytej folią. Przechowywać w temperaturze 25°C maksymalnie 6 miesięcy. Przed użyciem dobrze przemieszać do jednorodnego roztworu.
3. Przygotowanie płytek MHA
   1. Zeskrob Streptococcus bakterie grupy G z płytki z krwią za pomocą sterylnej pętli. Wymieszaj z 1 ml soli fizjologicznej i wiruj do zawiesiny bakterii.
   2. Porównaj zawiesinę ze wzorcem McFarlanda nr 0,5, aby osiągnąć tę samą mętność, aby uzyskać ten sam rozmiar inokulum podczas eksperymentów. Dostosuj stężenie za pomocą dodatkowej soli fizjologicznej lub bakterii.
   3. Zaszczepij płytki MHA za pomocą sterylnego aplikatora z bawełnianą końcówką. Delikatnie przetrzyj płytkę, aby pokryć powierzchnię. Postępuj zgodnie z jedną z trzech metod opisanych poniżej (1.4-1.6).
4. Pojedynczy test oporności na antybiotyki. Streptococcus grupa G, oporność na penicylinę G lub gentamycynę
   1. Umieść pasek testowy E (penicylinę G lub gentamycynę) na środku płytki MHA (Rysunek 1 A,B).
   2. Inkubować przez 18-20 godzin, 37°C.
   3. Zapoznaj się z wynikami. MIC jest mierzony jako strefa inhibicji, która przecina stopniowany pasek testowy antybiotyku (Rysunek 1 C,D).

Rysunek 1: Pojedynczy test elektroniczny. Umieszczenie paska testowego E A) penicyliny G i B) gentamycyny na płytce agarowej Muellera Hintona pokrytej koloniami bakteryjnymi paciorkowców grupy G przed (A i B) oraz po (C i D) inkubacji przez noc w temperaturze 37°C 5% CO₂. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. Testowanie synergii w podejściu krzyżowym. Streptococcus grupa G, oporność na penicylinę G i gentamycynę.
   1. Umieść dwa paski testowe E z różnymi antybiotykami (np. penicyliną G i gentamycyną) na zaszczepionej płytce MHA w układzie krzyżowym.
      1. Aby uzyskać najdokładniejsze wyniki, należy dążyć do umieszczenia krzyżyka pod kątem około 90° na przecięciu skal przy ich wartościach MIC, wcześniej określonych w pojedynczym teście oporności na antybiotyki (Rysunek 2 A).
      2. Należy pamiętać, że po umieszczeniu pasków na płytce agarowej nie należy ich przesuwać, ponieważ niektóre antybiotyki mogły już zostać wchłonięte przez płytkę. Dlatego bardziej odpowiednie jest utrzymywanie pasków pod nieco niewłaściwym kątem (np. 85°) i do 1-2 mm od rzeczywistej wartości MIC. Zaleca się przeprowadzenie eksperymentu w trzech egzemplarzach, aby zmniejszyć ten problem.
   2. Inkubować przez 18-20 godzin, 37°C.
   3. Zapoznaj się z wynikami. MIC jest mierzony jako strefa inhibicji, która przecina stopniowany pasek testowy antybiotyku na każdym odpowiednim pasku testowym E (Rysunek 2 B).
   4. Użyj wzoru na ułamkowe stężenie hamujące (FIC) (Równanie 1) w celu określenia synergii.

Rysunek 2: Wykrywanie synergizmu - test krzyżowy. Wyniki badań synergii przeciwdrobnoustrojowej MIC penicyliny G i gentamycyny na Streptococcus grupie G przed (A) i po (B) inkubacji przez noc w temperaturze 37°C 5% CO₂. Pomiędzy dwiema indywidualnymi wartościami MIC tworzy się kąt 90° (penicylina G: 0,094 μg/ml, gentamycyna: 8 μg/ml). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

6. Testowanie synergii bez podejścia krzyżowego. Streptococcus grupa G, oporność na penicylinę G i gentamycynę.
   1. Umieść pasek testowy E na środku płytki MHA (Rysunek 3 A,D).
   2. Zaznacz miejsce, w którym na każdym pasku znajdowała się wcześniej określona wartość MIC.
   3. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
   4. Wyrzuć pasek testowy E dla każdej płytki MHA (Rysunek 3 B,E).
   5. Umieść drugi pasek testu elektronicznego (zawierający inny antybiotyk) odpowiednio na obszarze wcześniej usuniętego paska, tak aby ich wartości MIC odpowiadały znakowi i były wyrównane.
   6. Inkubować przez 18-20 godzin, 37°C.
   7. Zapoznaj się z wynikami. MIC jest mierzony jako strefa inhibicji, która przecina stopniowany pasek testowy antybiotyku na każdym odpowiednim pasku testowym E (Rysunek 3 C,F).
   8. W celu wyznaczenia synergii stosuje się wzór na frakcjonowane stężenie hamujące (FIC) (Równanie 1).

Rysunek 3: Wykrywanie synergizmu - test niekrzyżowy. Wyniki badań synergii przeciwdrobnoustrojowej MIC penicyliny G i gentamycyny na Streptococcus grupie G. A) Pasek gentamycyny (8 μg/ml wyśrodkowany) na wierzchu Streptococcus grupy G, B) Usunięcie paska gentamycyny, C) Połączony pasek G gentamycyny / penicyliny (0,094 μg/ml wyśrodkowany) na Streptococcus bakterie grupy G, D) Pasek penicyliny G (0,094 μg/ml wyśrodkowany), E) Usunięcie paska penicyliny G, F) Połączony pasek penicyliny G / gentamycyny (8 μg/ml wyśrodkowany) na wierzchu Streptococcus bakterii grupy G. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Testowanie bulionu

1. Ustawiać
   1. Nosić rękawiczki i fartuch laboratoryjny
   2. Przygotuj miejsce pracy, sterylizując je przy użyciu 70% etanolu
   3. Zbierz 15 ml bulionu MH z 50% lizowaną krwią końską i 20 mg/ml β-NAD (MH-F)
2. (Opcjonalnie) Wykonaj test elektroniczny [Protokół 1], aby określić wartość MIC na podłożu stałym
   1. Wiedza ta, choć opcjonalna, pozwoli na lepsze zaprojektowanie eksperymentu (np. stężenia dodanych antybiotyków mogą być zaprojektowane tak, aby otaczały wartość MIC wyznaczoną na podstawie płytki), zwiększając szanse na udany eksperyment.
3. Przygotowanie inokulum bakteryjnego. Jak wspomniano powyżej, stężenie bakterii można oszacować za pomocą pomiarów OD nm lub wzorców zmętnienia McFarlanda
   1. Metoda OD600 nm
      1. Otrzymać zawiesinę bakteryjną o ustalonym stężeniu bakteryjnym
      2. Rozcieńczyć kulturę w bulionie MH-F, aby uzyskać OD600 0,003
   2. Metoda zmętnienia McFarlanda
      1. Umieść 15 ml bulionu MH-F w sterylnej probówce.
      2. Zaszczep bulion MH-F bakteriami (z talerza) do poziomu McFarlanda. Energicznie rozmieszaj roztwór. Wlej roztwór na sterylną szalkę Petriego.
4. Przygotowanie antybiotyków
   1. Określ pożądane stężenie antybiotyków
      1. Zidentyfikuj wartość MIC z testu E (np. 0,125 μg/ml dla penicyliny G i 8 μg/ml dla gentamycyny)
      2. Pomnóż wartość MIC płytki agarowej przez 2⁴-2⁷, co odpowiada czteremu-siedmiu 2-krotnym rozcieńczeniom szeregowym. Będzie to stężenie wyjściowe antybiotyków. (np. dla penicyliny G, siedem 2x seryjnych rozcieńczeń: 0,125 μg/ml x 2⁷ = 16 μg/ml; dla gentamycyny cztery 2x seryjne rozcieńczenia 8 μg/ml x 2⁴ = 128 μg/mL
      3. Pomnóż żądaną wartość początkową 100x, aby określić stężenie podstawowe antybiotyków (np. zapasy 1,6 mg/ml penicyliny G i 12,8 mg/ml gentamycyny)
   2. Przygotuj odpowiednio 100-krotne stężenie antybiotyku
      1. Rozpuść antybiotyki w 10 ml autoklalawowanej wody i wiruj, aby wytworzyć roztwór podstawowy (np. 16 mg penicyliny G i 128 mg gentamycyny, aby utworzyć powyższe zapasy)
5. Dodaj bakterie do studzienek mikropłytki
   1. Podaniec 200 μl bulionu MH-F zawierającego inokulum bakteryjne do studzienek w pierwszych 3 rzędach 96-dołkowej płytki do mikromiareczkowania do eksperymentu w trzech egzemplarzach.
6. Dodaj antybiotyki do studzienek mikropłytki
   1. Dodaj 200 μl dodatkowego bulionu MH-F z bakteriami do pierwszej kolumny studzienek (A1, B1, C1), aby uzyskać całkowitą objętość do 400 μL.
   2. Dodaj 4 μl podstawowego stężenia antybiotyków do pierwszej kolumny studzienek. Ponieważ próbka zawiera 400 μl, spowoduje to 100-krotne rozcieńczenie antybiotyków.
   3. Wygeneruj 2x seryjne rozcieńczenie, przenosząc 200 μl bakterii/antybiotyków z A1 do A2, aż do A11. Energicznie pipetować między rozcieńczeniami. Powtórz ten krok dla dodatkowych wierszy.
   4. Usunąć 200 μl z kolumny 11, tak aby końcowa objętość we wszystkich studzienkach wynosiła 200 μl.
   5. Pozostawić ostatnią kolumnę (A12, B12, C12) bez antybiotyków, jako kontrolę.
7. Określ wartości mikrofonu
   1. Inkubować 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania przez 24 godziny w temperaturze 37°C bez wstrząsania.
   2. Wartość MIC jest definiowana jako ostatni studzienka w serii rozcieńczeń, która nie wykazuje widocznego wzrostu bakterii (Rysunek 4). Tej wartości można jednak zaufać tylko wtedy, gdy oryginalny rozmiar inokulum był prawidłowy.

Rysunek 4: Oznaczanie MIC przez rozcieńczenie bulionu. MIC jest tutaj zdefiniowany jako ostatnia studzienka, która wykazuje klarowność (brak rozwoju bakterii) przed zmianą zmętnienia. Wiersz to duplikaty wartości MIC penicyliny G, a wiersz to duplikaty wartości MIC gentamycyny, oba w porównaniu z izolatem Streptococcus grupy G. A) rzeczywisty wynik eksperymentu, B) schematyczna interpretacja wartości z A (szary = brak wzrostu; biały = wzrost). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Schematyczna procedura serii rozcieńczeń w celu zliczenia pierwotnego stężenia bakterii. Rozcieńczenia przeprowadzono zgodnie z opisem (20 μl rozcieńczone w 180 μl dla serii 10-krotnych rozcieńczeń), a następnie 10 μl z rzędów A-H posiewa się na dwóch oddzielnych płytkach agarowych z krwią, jak wskazano. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

8. Określ pierwotną wielkość inokulum
   UWAGA: Testy mikrobulionu są bardzo czułe dla oryginalnej wielkości użytego inokulum. Nadmierny rozmiar inokulum da fałszywie dodatni wynik, ponieważ dodane antybiotyki nie będą już w stanie hamować wzrostu w tym stosunku. Dlatego tak ważne jest, aby sprawdzić, ile bakterii zostało dodanych do mikrostudzienek. Chociaż dane nie będą dostępne w momencie eksperymentu (ze względu na konieczność 24-godzinnej inkubacji), posłużą jako kontrola. Jeśli liczba dodanych bakterii mieści się w podanym zakresie stężeń, można ufać wartościom MIC. Jeśli inokulum było zbyt wysokie lub zbyt niskie, eksperyment należy powtórzyć.
   1. Seryjnie rozcieńcz bakterie
      1. Przygotować 96-dołkową płytkę do mikromiareczkowania, aby rozcieńczyć pierwotne stężenie bakterii w celu określenia wielkości inokulum. Optymalna jest objętość 200 μL z 10^5-6 bakterii. Aby przeprowadzić rozcieńczenia, najpierw podwielokrotność 180 μl sterylnego PBS do każdej studzienki w B-H (w trzech powtórzeniach 1-3).
      2. Następnie dodać 100 μl roztworu bakteryjnego do A (w trzech powtórzeniach 1-3).
      3. Uzyskać 10-krotne seryjne rozcieńczenie (w trzech powtórzeniach), przenosząc 20 μl bakterii z punktu A do punktu B, energicznie pipetować. Powtórz kroki dla C-H.
   2. Płytki z rozcieńczeniami bakterii do określenia wielkości inokulum
      1. Oznacz płytki agaru z krwią zgodnie z Rysunek 5.
      2. Przenieść 10 μl z rozcieńczenia szeregowego na płytkę zgodnie z Rysunek 5.
      3. Inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez 20-24 godziny.
   3. Określ wielkość inokulum bakteryjnego
      1. Policz liczbę bakterii w miejscach w obrębie 5-50 kolonii (Rysunek 6).
      2. Obliczyć początkową wielkość inokulum, obliczając średnią z trzech próbek, pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia (np. 10x dla próbek B, 100x dla próbek C, 1000x dla próbek D itd.), a następnie przez 100, aby skompensować objętość plamki wynoszącą 10 μl, co daje wielkość inokulum w jtk/ml. Jeśli inokulum mieści się w zakresie 10^5-6 jtk/ml, można ufać danym MIC.

Rycina 6: Określenie wielkości inokulum. Bakterie zaszczepione zgodnie z rysunkiem 5 inkubowano przez 20-24 godziny w temperaturze 37°C, a następnie policzono. Rząd D ma dużą liczbę rodzin do policzenia (np. 5-50). Próbki w A są nierozcieńczone, B rozcieńcza się 10x, C rozcieńcza się 100x, a D rozcieńcza się 1000x, a w każdym miejscu podaje się tylko 10 μl. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.