Test płytki nazębnej: metoda określania miana wirusa jako jednostek tworzących blaszkę (PFU)

1. Konfiguracja

1. Przed przystąpieniem do jakichkolwiek prac z drobnoustrojami należy upewnić się, że miejsce pracy jest wysterylizowane (np. przetarte 70% etanolem). Zawsze noś fartuch laboratoryjny i rękawice, trzymaj długie włosy związane z tyłu i upewnij się, że wszelkie rany są szczególnie dobrze chronione.
2. Po zakończeniu wysterylizuj wszystkie powierzchnie i dokładnie umyj/wysterylizuj ręce i nadgarstki.

2. Protokół

1. LB Przygotowanie podłoża
   nuta: W zależności od szczepu bakteryjnego gospodarza i bakteriofaga, inna płynna pożywka może być bardziej odpowiednia do początkowej hodowli szczepu bakterii gospodarza lub inna pożywka stała może być bardziej odpowiednia do późniejszego wzrostu. Rosół lizogeniczny (LB) jest używany w tym protokole do bulionu i agaru.
   1. Wymieszaj 4 g LB w 200 ml wody destylowanej, w trzech egzemplarzach, do bulionu LB, stałego dolnego agaru i miękkiego górnego agaru. Wszystkie roztwory należy przygotowywać w pojemnikach mogących pomieścić dwukrotność końcowej objętości, aby zapobiec przepełnieniu podczas autoklawowania.
      nuta: Jeśli wykonujesz test w trzech egzemplarzach, przygotuj podwójną ilość dolnego agaru LB.
   2. Dostosować pH wszystkich trzech roztworów do 7,4 przy użyciu NaOH lub HCl, w zależności od potrzeb.
   3. Dodaj 3 g mocy agaru do dolnej butelki z agarem, aby uzyskać 1,5% roztwór agaru na stały agar
   4. Dodaj 1,2 g mocy agaru do górnej butelki z agarem, aby uzyskać 0,6% roztwór agaru na miękki agar.
   5. Umieść butelki z częściowo dokręconymi nakrętkami w autoklawie ustawionym na 121°C na 20 minut w celu wysterylizowania roztworów. Zamknij nakrętki zaraz po zakończeniu biegu, aby zapobiec zanieczyszczeniu.
   6. Gdy pożywka LB osiągnie temperaturę około 45-50°C, dodaj 450 μl sterylnego 1 M CaCl₂ do wszystkich trzech 200 ml roztworów LB, aby uzyskać końcowe stężenie 2,25 mM.
   7. Wlej 15 ml porcji stałego podłoża agarowego do sterylnych szalek Petriego (unikać wstrząsania, aby zapobiec pienieniu) i pozwól agarowi zestalić się przez kilka godzin lub noc w temperaturze pokojowej (Rysunek 4A). Talerze można przechowywać do góry nogami w temperaturze 4°C przez kilka dni.
2. Hodowla komórek gospodarza
   1. Na dzień przed badaniem dodaj 10 μl kultury E. coli do 10 ml bulionu LB.
   2. Inkubować bakterie w temperaturze 37°C przez noc przy 160 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem.
   3. Rano w dniu testu dodać 0,5 ml nocnej kultury do 10 ml świeżego LB.
      nuta: Jeśli wykonujesz test w trzech egzemplarzach, przygotuj podwójną ilość tej kultury.
   4. Inkubować w temperaturze 37 °C przy 160 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem, aż kultura bakteryjna znajdzie się w fazie logarytmicznej. Można to określić spektrofotometrycznie za pomocą OD600 0,5-0,7.
   5. Utrzymuj kulturę w temperaturze pokojowej do czasu, gdy bakterie zostaną dodane do górnego agaru LB.
3. 10-krotne seryjne rozcieńczanie bakteriofaga
   1. Dodaj 180 μl bulionu LB do siedmiu dołków w pierwszym rzędzie do 96-dołkowej płytki
      nuta: Sugeruje się przeprowadzenie rozcieńczenia w trzech egzemplarzach w celu zwiększenia jego wiarygodności statystycznej. Aby to zrobić, przygotuj dodatkowe rozcieńczenia bakteriofaga w drugim i trzecim rzędzie płytki.
   2. Ostrożnie zwirować oryginalną próbkę bakteriofaga, aby zapewnić jednorodność i przenieść 20 μl do pierwszego dołka.
   3. Dobrze wymieszać próbkę przez pipetowanie i w dół.
   4. Przenieść 20 μl powstałej zawiesiny do drugiego dołka.
   5. Kontynuować seryjne rozcieńczanie, przenosząc 20 μl roztworu z drugiego dołka do trzeciego dołka i tak dalej, aż do szóstego dołka, pozostawiając siódmy studzienka jako kontrolę ujemną, do której nie dodaje się zawiesiny fagowej. Spowoduje to utworzenie zakresu rozcieńczenia 10-1-10-6.
4. Poszycia
   1. Oznaczyć podstawę szalek Petriego (uprzednio przygotowanych w kroku 2.1.7) nazwą, datą i krótkim opisem próbki (w tym współczynnikiem rozcieńczenia próbki fagowej). Podgrzej szalki Petriego w inkubatorze o temperaturze 37°C na godzinę przed badaniem.
   2. Rozpuść zestaloną miękką pożywkę agarową (zwykle robi się to za pomocą kuchenki mikrofalowej; zestalony agar topi się w temperaturze 85°C) i pozwól mu osiągnąć temperaturę około 45°C. Podgrzane media można umieścić w łaźni wodnej o temperaturze 45°C na ~1h, aby osiągnąć odpowiednią temperaturę. Powinien być wystarczająco gorący, aby pozostać w postaci płynnej, ale wystarczająco chłodny, aby nie zabijać dodanych bakterii.
   3. Wymieszać 4 ml kultury bakteryjnej (z kroku 2.2) z 35 ml miękkiego agaru LB (w temperaturze 45°C). Obracaj, aby równomiernie rozprowadzić komórki, ale unikaj potrząsania, aby zapobiec pienieniu się (Rysunek 4A).
   4. Oznacz jedną sterylną probówkę dla każdego z etapów seryjnego rozcieńczania i jedną dla próbki kontrolnej, co daje w sumie 7 oznakowanych probówek. Umieścić 5 ml porcji mieszaniny kultur bakteryjnych i miękkiego agaru z kroku 2.4.3 w 7 probówkach. Szybko wykonaj krok 2.4.6, ponieważ tak małe objętości pożywek na bazie agaru szybko zestalą się w temperaturze pokojowej.
   5. Dodać 100 μl próbki kontrolnej (z kroku 2.3) do probówki kontrolnej i ostrożnie zamieszać. Wyrzucić zużytą końcówkę pipety i przenieść tę samą objętość z każdej z seryjnie rozcieńczonych próbek bakteriofagów (krok 2.3) do odpowiednich probówek, obracając w celu wymieszania.
   6. Natychmiast przenieś mieszaniny o pojemności 5 ml na oznakowane, wstępnie podgrzane, stałe płytki agarowe (Rysunek 4A). Delikatnie obracaj talerzami, aby równomiernie rozprowadzić mieszanki.
      nuta: Jeśli test jest wykonywany w trzech powtórzeniach, powtórz kroki 2.4.3-6 jeszcze dwa razy.
   7. Uszczelnij każdą płytkę folią laboratoryjną i pozwól obu warstwom prawidłowo zestalić się w temperaturze pokojowej (około 15 minut) przed umieszczeniem ich do góry nogami w inkubatorze o temperaturze 37°C, stymulując wzrost zarówno bakterii, jak i faga, przez 24 godziny lub do momentu rozwoju blaszek, Zwykle potrzeba około 1-5 dni, aby pojawiły się blaszki (Rysunek 4B), ale czas różni się znacznie w zależności od warunków inkubacji, pożywki i gatunku bakterii.

3. Analiza danych i wyniki

1. Liczenie tabliczek
   1. Upewnij się, że na tabliczkach oznaczonych "kontrola" nie są widoczne żadne blaszki, ponieważ wskazywałoby to na zanieczyszczenie wirusowe.
   2. Zacznij od płytek oznaczonych jako ^10-6, zawierających najbardziej rozcieńczoną próbkę bakteriofaga. Policz tabliczki bez zdejmowania pokrywy, zaznaczając je długopisem w miarę przechodzenia, aby wskazać, które tabliczki zostały już policzone.
   3. Policz pozostałe talerze. Niektóre tabliczki mogą mieć za mało lub za dużo tabliczek, aby je zliczyć. Do dalszej analizy należy użyć płytek z 10-150 płytkami.
2. Obliczanie PFU
   1. Podzielić liczbę blaszek przez współczynnik rozcieńczenia (np. ^10-6 dla najbardziej rozcieńczonej próbki), aby uzyskać liczbę jednostek tworzących płytkę nazębną (PFU) w 100 μl mieszaniny fagowej.
      nuta: W przypadku wykonywania testu w trzech egzemplarzach należy użyć średniej liczby blaszek z trzech płytek.
   2. Aby określić stężenie (w PFU/ml) oryginalnej próbki, należy pomnożyć przez dodatkowy współczynnik rozcieńczenia 10, ponieważ na platerze zebrano tylko 100 μl próbki. (tj. )
   3. Obliczyć średnią wartość PFU/ml dla wszystkich rozcieńczeń, które zawierały od 10 do 150 blaszek, aby uzyskać bardziej wiarygodny wynik.