Transformacja komórek E. coli przy użyciu dostosowanej procedury chlorku wapnia

Protokół ten opisuje przygotowanie i transformację kompetentnego E. coli DH5α przy użyciu adaptacji procedury chlorku wapnia (12).

1. Ustawienie

1. Sprzęt
   • Spektrofotometr
   • Wirówka Sorval (lub równoważna)
   • Wirówka stołowa
   • Blok grzewczy lub kąpiel wodna
   • Wytrząsarka orbitalna
   • Inkubator stacjonarny
   • Tacka do odlewania żelu
   • Dobrze grzebienie
   • Źródło napięcia
   • Pudełko żelowe
   • Źródło światła UV
   • Kuchenka mikrofalowa
2. Roztwory i odczynniki
   • Rosół Luria-Bertani (LB) (10 g hydrolizatu enzymatycznego kazeiny, 5 g ekstraktu drożdżowego i 5 g chlorku sodu w 1000 ml H₂O)
   • Super Optymalny bulion z represją katabolityczną (SOC): (2% (w/v) trypton, 0,5% (w/v) ekstrakt drożdżowy, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM MgSO₄ i 20 mM glukozy)
   • CaCl₂-MgCl₂ (80 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂) roztworu.
   • M CaCl₂ roztwór (jeśli komórki mają być natychmiast przekształcone) lub 0,1M roztwór CaCl₂ zawierający 10% (v/v) glicerolu (jeśli komórki zostaną zamrożone do wykorzystania w przyszłości).
   • Płytki agarowe LB
   • Selektywne płytki agarowe LB (w tym eksperymencie, ponieważ zastosowany plazmid nadaje odporność na ampicylinę, użyto płytek agarowych LB zawierających ampicylinę 100 μg/ml)
   • E. coli Szczep DH5α
   • Plazmid DNA pUC19 (100 pg/ μl)
   • Zestaw do miniprzygotowania QIAprep Spin (Qiagen)
   • HindIII enzym restrykcyjny
   • 1 kb plus drabinka DNA
   • Niska temperatura topnienia agarozy
   • 1X bufor TAE (40 mM zasady Tris, 20 mM kwas octowy i 1mM EDTA)
   • Bromek etydyny (10mg/ml)
3. Ogólne uwagi dotyczące bezpieczeństwa
   E. coli DH5α jest sklasyfikowany jako poziom bezpieczeństwa biologicznego 1 (BSL1). Drobnoustroje z tej kategorii stanowią niewielkie lub żadne zagrożenie infekcją u zdrowych osób dorosłych. Wymagana jest jednak ostrożna manipulacja mikroorganizmem.

WAŻNE: wszystkie czynności opisane w tym protokole muszą być wykonywane przy użyciu technik aseptycznych i w temperaturze lodu lub 4°C, chyba że jest to wskazane.

2. Protokół

1. Z zamrożonego wywaru E. coli DH5α (zamrożonego w 20% glicerolu z nocnej kultury wyhodowanej w LB) usuń bakterie do izolacji na płytce agarowej LB. Inkubować w temperaturze 37°C przez noc (16-20 godzin).
2. Zaszczepij pojedynczą kolonię w 3 ml bulionu LB w probówce. Rosną wytrząsając z prędkością 210 obr./min w temperaturze 37°C przez noc (16-20 godzin).
3. Zmierz OD600 w nocnej hodowli. Użyj kultury nocnej, aby zaszczepić 100 ml bulionu LB w 1-litrowej kolbie do OD600=0,01. Inkubować kulturę, energicznie wstrząsając (210 obr./min) w temperaturze 37°C, monitorując OD600 w spektrofotometrze co 15-20 minut, aż kultura osiągnie OD600=0,35 (około 3 godziny).
   UWAGA: Aby transformacja była wydajna, komórki bakteryjne muszą znajdować się w środkowej fazie wzrostu wykładniczego. Maksymalna liczba komórek musi wynosić 10⁸ komórek/ml, co dla większości szczepów E. coli odpowiada OD600=0,4. Zastosowanie spektrofotometru pozwala na pomiar OD600, co pozwala określić, czy komórki znajdują się w odpowiednim etapie wzrostu. Jeśli protokół ten będzie stosowany dla innych szczepów bakterii, konieczna będzie kalibracja w celu określenia liczby kolonii tworzących jednostki przy określonych wartościach OD600 w celu określenia tej korelacji.
4. Przenieś 50 ml kultury do każdej z 2 lodowatych polipropylenowych butelek wirówek. Umieść butelki na lodzie na 20 minut, aby ostygły.
5. Odzyskaj komórki przez odwirowanie w temperaturze 2700 g (4100 obr./min w wirniku Sorval GSA) przez 10 minut w temperaturze 4°C.
6. Usunąć supernatant. Odcedź ostatnie ślady pożywki, kładąc butelkę do góry nogami na podkładce lub ręczniku papierowym.
7. Ponownie zawiesić każdą osadkę bakteryjną w 30 ml lodowatego roztworu CaCl₂-MgCl₂ (80 mM MgCl₂, 20 mM CaCl₂). Najpierw dodaj 5 ml roztworu, ostrożnie mieszaj, aż osad całkowicie się rozpuści, a następnie dodaj pozostałe 25 ml roztworu.
8. Powtórz krok 2.4.
9. Powtórz krok 2.5.
10. Jeśli kompetentne komórki mają zostać bezpośrednio przekształcone, ponownie zawieś każdą osadkę bakteryjną w 2 ml lodowatego roztworu CaCl₂ (0,1 M), ostrożnie obracając probówki. Jeśli osad nie zostanie ponownie zawieszony tą metodą, należy go ponownie zawiesić, delikatnie pipetując w górę i w dół (unikając tworzenia się pęcherzyków).
    Alternatywnie właściwe komórki można zamrozić i przechowywać do późniejszego wykorzystania. Aby przygotować zamrożone zapasy kompetentnych komórek, należy ponownie zawiesić osad w 2 ml 0,1M roztworu CaCl₂ zawierającego 10% (v/v) glicerol. To rozwiązanie musi być lodowate. Zawiesinę komórek podwielokrotnych do lodowato zimnych probówek polipropylenowych o pojemności 1,5 ml (160 μl na probówkę). Natychmiast zamrozić kompetentne komórki w kąpieli z suchym lodem i etanolem. Przenieś probówki do zamrażarki o temperaturze -70°C.
11. Aby przekształcić komórki potraktowane CaCl₂, przenieś 50 μl kompetentnych komórek do każdej z 2 probówek polipropylenowych o pojemności 1,5 ml. Dodać 1 μl (100 pg) plazmidowego DNA pUC19 do jednej z probówek i pozostawić drugą probówkę bez DNA (kontrola ujemna). Delikatnie wymieszaj (unikaj tworzenia się pęcherzyków). Inkubować przez 30 minut na lodzie.
    UWAGA: Do przemiany nie należy używać więcej niż 50 ng DNA w objętości 10 μl lub mniejszej.
12. Przenieść probówki do bloku grzewczego i inkubować w temperaturze 42°C dokładnie przez 45 sekund.
    UWAGA: Szok cieplny jest krytycznym krokiem. Nie przekraczać temperatury ani czasu inkubacji.
13. Łatwo przenieś probówki do lodu. Inkubuj przez 2 minut.
14. Dodać 950 μl pożywki SOC i inkubować probówki przez 1 godzinę w temperaturze 37°C, aby umożliwić bakteriom odzyskanie sił i ekspresję markera oporności na antybiotyki zakodowanego w plazmidzie.
15. Rozcieńczyć 10 μl zawiesiny komórek w 1000 μl w SOC (rozcieńczenie 1/100) i 100 μl zawiesiny komórek w 1000 μl w SOC (rozcieńczenie 1/10). Umieścić 100 μl rozcieńczeń, jak również kontrolę, na selektywnych płytkach i rozprowadzić za pomocą szpatułki. Zwykle posiew 100 μl rozcieńczenia 1/100 i 1/10 daje wystarczającą liczbę jednostek tworzących kolonie (cfu) na płytkę. Idealnie, liczba ta powinna wynosić od 30 do 300 jtk, aby było wystarczająco dużo kolonii, ale oddzielonych od siebie. Jednak liczba jtk będzie zależała od wydajności transformacji (patrz sekcja Analiza danych i wyniki).
16. Inkubować płytki w temperaturze 37°C. Przekształcone kolonie powinny pojawić się w ciągu 12-16 godzin (zakres ten będzie zależał od szczepu komórki i metody selekcji). W kontroli ujemnej nie powinny rosnąć żadne kolonie.
17. Policz jtk/płytkę otrzymaną do przemiany (Tabela 1).
18. Aby sprawdzić, czy transformanty zawierają plazmid pUC19, zostanie przeprowadzone przygotowanie plazmidu, a następnie trawienie. W tym celu zaszczepij pojedynczą kolonię w 3 ml bulionu LB w probówce. Rosną wytrząsając z prędkością 210 obr./min w temperaturze 37°C przez noc (16-20 godzin).
19. Przygotuj preparat plazmidowy za pomocą zestawu QIAprep Spin Miniprep Kit, zgodnie z instrukcją producenta.
20. Trawić 1 μg oczyszczonego pUC19 enzymem restrykcyjnym HindIII w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.
    UWAGA: Na tym etapie można użyć dowolnego enzymu, który przecina miejsce wielokrotnego klonowania pUC19.

Komponent	Ilość
10X Bufor skrótu ograniczenia	2.5 μl
Plazmid pUC19	1 μg
HindIII	1 μl
H2O	20,5 μl (do 25 μl)

21. Uruchom drabinę masy cząsteczkowej, strawione DNA pUC19 i taką samą ilość niestrawionego DNA pUC19 w 1% żelu agarozowym zawierającym 1 μg/ml bromku etydyny przez 1 godzinę przy 95 V.
    UWAGA: czas i napięcie będą się różnić w zależności od używanego sprzętu.
22. Wizualizuj żel w świetle UV. Porównaj wielkość strawionego i niestrawionego DNA pUC19 (Rysunek 2) (patrz sekcja Analiza danych i wyniki).
    Postępuj zgodnie z niezbędnymi krokami wymaganymi do zweryfikowania transformacji zgodnie z celem każdego konkretnego eksperymentu transformacji.

Ryc. 2: Trawienie odzyskanego plazmidowego DNA z przekształconych komórek DH5α. Plazmidowe DNA odzyskano z przekształconych komórek DH5α, trawiono za pomocą HindIII, prowadzono w 1% żelu agarozowym i wizualizowano za pomocą źródła UV (kroki 2.19 do 2.22).

3. Analiza danych i wyniki

Aby obliczyć wydajność transformacji, wskaźnik tego, jak dobrze komórki przyjęły zewnątrzkomórkowe DNA, należy policzyć kolonie uzyskane w transformacji:

Rozcieńczenie	Cfu
1/100	34
1/10	246

Tabela 1: Jednostki tworzące kolonie (cfu) liczone na podstawie eksperymentu transformacji.

Wydajność przemiany (TE) jest miarą liczby jtk wynikającej z przekształcenia 1 μg plazmidu w daną objętość kompetentnych komórek. Na efektywność przemiany wpływa wiele parametrów: wielkość plazmidu, genotyp komórki, etap wzrostu podczas przygotowania kompetencji, metody transformacji itp.). Przy obliczaniu TE ważne jest, aby wziąć pod uwagę, jakie rozcieńczenie (jeśli w ogóle) zostało przeprowadzone przed posiewem i uwzględnić je w obliczeniach całkowitej liczby jtk. Sprawność transformacji (TE) oblicza się za pomocą następującego równania:

Najpierw podziel jtk przez μg DNA, w tym przykładzie 0,0001 μg. Następnie podziel wynik przez współczynnik rozcieńczenia. W tym przykładzie użyto rozcieńczenia 1/10 i posiano 100 μl 1 ml roztworu (rozcieńczenie: 1/10 × 100 μL /1000 μL=0,01).