$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Komórki bakteryjne, takie jak E. coli, są zdolne do przenoszenia informacji genetycznej z komórki do komórki. Koniugacja różni się od innych mechanizmów transferu DNA, takich jak transdukcja czy transformacja, tym, że wymaga fizycznego kontaktu między komórkami.
Aby kontynuować, koniugacja wymaga komórki dawcy, która wyraża czynnik płodności lub F, oraz komórki biorcy bez niego, komórki F minus. Proces ten składa się z dwóch kroków. Pierwszym z nich jest nawiązanie bezpośredniego kontaktu między komórkami. Aby to zrobić, komórka dawcy wytwarza zewnątrzkomórkową nitkowatą strukturę zwaną pilusem płciowym. Nazywa się tak, ponieważ koniugacja jest formą krycia bakterii rozmnażających się bezpłciowo, ale należy zauważyć, że nie jest to prawdziwe rozmnażanie płciowe, ponieważ nie dochodzi do wymiany gamet i nie powstaje potomstwo.
Drugim krokiem jest dostarczenie DNA do komórki biorcy. Po tym, jak pilus płciowy nawiąże kontakt między dwiema komórkami, budowany jest kanał zwany systemem wydzielania typu IV, który umożliwia transfer DNA. Następnie komórka dawcy zaczyna replikować pozachromosomalne DNA, które zostanie przeniesione, wybrane na podstawie obecności elementu genetycznego znanego jako OriT lub pochodzenie transferu. Jeden koniec nowo zreplikowanego DNA jest nawleczony do przewodu poprzez wiązanie białka DNA. W miarę dalszej replikacji DNA jest pompowane przez kanał, co ułatwia kompleks białek kodowanych przez geny znajdujące się w pobliżu OriT. Gdy DNA zostanie w pełni przeniesione, albo utworzy dodatkowy plazmid chromosomalny, albo może zintegrować się z chromosomem komórki biorcy. Niezależnie od tego, który jest punkt końcowy przeniesionego DNA, geny, które koduje, ulegną ekspresji. Ta ekspresja genu może być wykorzystana do potwierdzenia udanej koniugacji.
Rozważmy na przykład scenariusz, w którym szczep dawcy wyraża oporność na ampicylinę i przekazuje ją w sprzężonym DNA bakterii biorcy, ale szczep biorcy ma również gen oporności na tetracykliny, który nie występuje u dawcy. W tym przypadku, gdy komórki są posiane na pożywce LB zawierającej zarówno tetracyklinę, jak i ampicylinę, kolonie powinny rosnąć tylko z pomyślnie sprzężonych bakterii, które będą wyrażać oba fenotypy oporności. Aby dodatkowo potwierdzić udaną koniugację, plazmidowe DNA z tych kolonii można zebrać, a następnie odcinek DNA specyficzny dla przeniesionego plazmidu można amplifikować za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy lub PCR. Gdy produkt PCR jest uruchamiany na żelu do elektroforezy wraz z drabinką o standardowych rozmiarach, na żelu powinien być widoczny fragment PCR o znanym rozmiarze, co dodatkowo potwierdza udaną koniugację. W tym eksperymencie plazmid zostanie wykorzystany do przeniesienia genu oporności na ampicylinę poprzez koniugację ze szczepu dawcy do szczepu biorcy opornego na tetracykliny. Następnie, aby potwierdzić koniugację, mieszanina koniugacyjną będzie inkubowana na płytce zawierającej oba antybiotyki, pozostawiając tylko przekształcone bakterie. Na koniec udana koniugacja zostanie dodatkowo potwierdzona za pomocą PCR.
Przed przystąpieniem do zabiegu należy założyć odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny i rękawice. Następnie wysterylizuj miejsce pracy przy użyciu 70% etanolu, aby wytrzeć powierzchnię.
W tej procedurze gen oporności na ampicylinę zostanie przeniesiony ze szczepu WM3064 E. coli do szczepu J53 E. coli poprzez koniugację. Szczep dawcy WM3064 jest odporny na tetracyklinę i ampicylinę, a do wzrostu wymaga kwasu diaminomelicznego lub DAP. Szczep biorczy J53 jest odporny tylko na tetracyklinę i nie wymaga DAP do wzrostu. Oznacza to, że pomyślnie sprzężone komórki powinny być odporne na tetracyklinę i ampicylinę oraz mogą rosnąć bez DAP.
Przygotuj kulturę szczepu dawcy, zaszczepiając pięć mililitrów LB zawierających 0,3 milimola DAP skrawkiem zamrożonego szczepu dawcy glicerolu. Następnie przygotuj szczep biorcy, zaszczepiając pięć mililitrów bulionu LB bez DAP skrawkiem zamrożonego szczepu biorcy glicerolu. Hoduj te kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z napowietrzaniem i wytrząsaniem z prędkością 220 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem. Gdy kultury osiągną OD 600 z dwóch, usuń jeden mililitr kultury z każdej i umieść go w dwóch nowych oddzielnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra. Następnie odwiruj te porcje z prędkością 3000 obr./min przez pięć minut, aby osadzać komórki bakteryjne. Odrzucić supernatant i przemyć każdą osadkę 250 mikrolitrami 1X PBS. Ponownie odwirować próbki i po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić każdą osadkę w 500 mikrolitrach PBS.
Aby rozpocząć procedurę koniugacji, najpierw połącz 50 mikrolitrów komórek biorcy z 50 mikrolitrami komórek dawcy w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Następnie pipetować 100 mikrolitrów kultury komórkowej biorcy na inną płytkę tetracyklinową 1X zawierającą DAP. Następnie należy przygotować kontrolę ujemną, pipetując 100 mikrolitrów kultury komórkowej biorcy tylko na nieselektywną płytkę agarową zawierającą DAP. Następnie inkubuj płytki koniugacyjne i kontrolne ujemne przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnego dnia weź sterylny skrobak do komórek i zbierz komórki z płytki koniugacyjnej, zbierając kolonie. Następnie przenieś kolonie do sterylnej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr 1X PBS. Powtórz ten proces, aby zebrać komórki biorcze z drugiej płytki.
Następnie zwiruj próbki, aby się wymieszać. Po wymieszaniu przenieś probówki do wirówki, aby delikatnie granulować komórki. Wyrzuć supernatant, a następnie umyj granulki komórek w jednym mililitrze PBS i zwiruj probówki, aby ponownie zawiesić komórki. Ponownie zagnieździć komórki przez odwirowanie. Ponownie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić obie osadki komórkowe w jednym mililitrze PBS. Teraz, używając sterylnej końcówki pipety, rozłóż 100 mikrolitrów mieszaniny komórek reakcji koniugacji na płytce agarowej LB bez DAP zawierającej 1X tetracyklinę i 1X ampicylinę. Powtórzyć metodę posiewu, stosując 100 mikrolitrów dziesięciokrotnego rozcieńczenia tej samej mieszaniny komórek w PBS na innej płytce agarowej LB bez DAP zawierającej 1X tetracyklinę i 1X ampicylinę.
Na koniec odpipetować 100 mikrolitrów mieszaniny komórek kontroli ujemnej na pojedynczą płytkę agarową LB tylko z tetracykliną 1X. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza kolonie powinny być widoczne. Używając sterylnej końcówki pipety, wybierz pojedynczą kolonię z płytki reakcyjnej koniugacji i dodaj ją do probówki zawierającej pięć mililitrów selektywnej pożywki LB zawierającej oba antybiotyki. Następnie powtórz izolację kolonii, wybierając pojedynczą kolonię z płytki komórki biorcy. Uprawiaj te kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z napowietrzaniem przy 220 obr./min.
Następnego dnia przetrzyj blat stołu 70% etanolem i wyjmij płytki z inkubatora. Użyj mini zestawu do przygotowania DNA, aby wyizolować DNA z 4. 5 mililitrów każdej kultury zgodnie z instrukcjami producenta. Po zakończeniu mini przygotowania DNA wymyj DNA za pomocą 35 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz. Na koniec użyj pozostałego 0. 5 mililitrów każdej kultury, aby przygotować jeden mililitr glicerolu, dodając 0,5 mililitra 100% glicerolu w celu rozcieńczenia jeden do jednego. Umieść te porcje w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do przechowywania do czasu, gdy będą potrzebne.
Aby potwierdzić pomyślną koniugację metodą PCR, najpierw przygotuj główną mieszankę PCR, dodając 75 mikrolitrów głównej mieszanki 2X PCR do probówki mikrowirówkowej. Następnie dodaj po 7,5 mikrolitra 10-mikromolowego startera do przodu i 10-mikromolowego startera wstecznego przeznaczonego do amplifikacji genu oporności na ampicylinę z plazmidu. Następnie przygotuj drugą mieszankę wzorcową PCR, dodając 75 mikrolitrów głównej mieszanki 2X PCR do probówki mikrowirówkowej, a następnie dodając po 7,5 mikrolitra 10-mikromolowego startera do przodu i 10 mikromolowego startera odwrotnego przeznaczonego do amplifikacji genu porządkowego, w tym przypadku gyrazy DNA B.
Teraz dodaj 15 mikrolitrów pierwszej mieszanki głównej do probówki PCR, a następnie dodaj 10 nanogramów, około dwóch mikrolitrów eksperymentalnego DNA matrycy do tej samej probówki. Doprowadzić reakcję do końcowej objętości 25 mikrolitrów wodą bez nukleaz. Powtórz te kroki, aby wytworzyć pozostałe pięć reakcji, tak aby probówki zawierały pokazane tutaj składniki. Teraz przenieś te reakcje do termocyklera z blokiem podgrzanym do 98 stopni Celsjusza, a następnie rozpocznij program. Po zakończeniu PCR wyjmij probówki z urządzenia. Następnie załaduj dwa mikrolitry każdej reakcji zmieszane z dwoma mikrolitrami barwnika ładującego i czterema mikrolitrami markera masy cząsteczkowej do kolejnych dołków 1% żelu agarozowego. Ustaw żel tak, aby działał pod napięciem 150 woltów przez 20 minut. Na koniec zwizualizuj żel za pomocą rozświetlacza UV.
W tym eksperymencie pomyślne przeniesienie genu oporności na ampicylinę poprzez koniugację zostało potwierdzone za pomocą PCR. W tym przypadku należy zaobserwować pasmo wielkości około 500 par zasad w studzience zawierającej sprzężone DNA i startery ampicyliny, w tym przykładzie dobrze dwa. Gen porządkowy, gyraza DNA B, został załadowany do studzienek trzeciej i piątej odpowiednio ze sprzężonym DNA i DNA komórki biorcy. Paseżki zaobserwowane w tych studzienkach działają jak kontrola pozytywna, aby upewnić się, że matryca DNA była obecna i że PCR zakończył się sukcesem. Nie należy obserwować prążków w studzience zawierającej reakcję na DNA komórki biorcy i parę starterów ampicyliny, w tym przykładzie dobrze czwartą, ponieważ komórki biorcze nie są oporne na ampicylinę. Ponadto nie należy obserwować prążków w reakcjach pozbawionych matrycowego DNA, studzienek szóstej i siódmej tutaj. Jeśli te warunki zostaną spełnione, potwierdzi to pomyślne przeniesienie genu oporności na ampicylinę, nadając oporność na ampicylinę ze szczepu WM3064 E. coli na szczep J53 E. coli.
