Koniugacja: metoda przenoszenia oporności na ampicylinę z dawcy na biorcę E. coli

1. Ustawiać

1. Autoklaw około 1L pożywki Luria-Bertani (LB). Ten sterylny LB zostanie użyty do wytworzenia około 5 ml LB zawierającego 0,3 mM kwasu diaminopimelowego (DAP).
2. Zbierz następujące płytki: płytki agarowe LB z 1X Tet i 0,3 mM DAP, płytki agarowe LB tylko z 1X Tet i płytki agarowe LB tylko z 1X Amp/Tet.
3. Upewnij się, że pod ręką znajduje się trochę glicerolu i pudełko wstępnie wysterylizowanych plastikowych końcówek do pipet.
4. Przed przystąpieniem do jakichkolwiek prac związanych z drobnoustrojami należy wysterylizować miejsce pracy 70% etanolem. Zawsze noś niezbędne środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny i rękawice.
5. Po zakończeniu wysterylizuj wszystkie powierzchnie i rękawice 70% etanolem i umyj ręce.

2. Przygotowanie szczepu dawcy i biorcy

1. Przygotować 5 ml kultur bakterii szczepów dawcy i biorcy i hodować je przez noc w temperaturze 37 °C z napowietrzaniem i wstrząsaniem przy 220 obr./min. Szczep dawcy powinien być uprawiany w LB z 0,3 mM DAP.
2. Odwiruj 1 ml obu kultur (~3000 obr./min przez 5 minut) i umyj komórki PBS.
3. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).

3. Koniugacja

1. Połączyć 50 μl komórek biorczych z 50 μl komórek dawcy w probówce do mikrowirówki i wymieszać przez pipetowanie.
2. Inkubować mieszaninę komórek przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Zwiększy to skuteczność koniugacji przed i w trakcie następnego etapu powlekania.
3. Odpipetować 100 μl mieszaniny komórek na płytkę agarową za pomocą 1X Tet i 0,3 mM DAP. Nie rozprowadzać na talerzu.
4. Odpipetować 100 μl hodowli komórek biorcy na płytkę agarową za pomocą 1X Tet i 0,3 mM DAP. Nie rozprowadzać na talerzu.
5. Inkubować obie płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
6. Zeskrobać mieszaninę komórek koniugacyjnych i hodowlę komórek biorcy za pomocą sterylnego skrobaka do komórek. Przenieść komórki do sterylnej probówki do mikrowirówki i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS.
7. Wiruj komórki i delikatnie obracaj je w dół (~3000 obr./min przez 5 minut).
8. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS.
9. Mieszaninę komórek reakcji koniugacji umieścić na płytce agarowej LB tylko z 1X Amp/Tet. Na tej płytce oczekuje się, że będą rosły tylko bakterie biorcy, które pomyślnie uzyskały gen oporności na Amp poprzez koniugację.
10. Umieść komórki biorcze na płytce agarowej LB tylko za pomocą 1X Tet. Na tej płytce oczekuje się, że będą rosły tylko niesprzężone bakterie biorcze, które nie mają genu oporności na Amp.
11. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
12. Pobrać pojedyncze kolonie z obu płytek i użyć ich do wyhodowania kultur przez noc w 5 ml pożywki (37 °C z napowietrzaniem przy 220 obr./min).

4. Izolacja DNA

1. Wyizolować DNA z wcześniej przygotowanych kultur, używając 4,5 ml całkowitej objętości kultury za pomocą minipreparatu DNA.
2. Aby to zrobić, wymyj DNA za pomocą 35 μl wody wolnej od nukleaz.
3. Czyste DNA wygeneruje współczynnik absorbancji (A_260/280) wynoszący około 1,8.
4. Użyj pozostałych 0,5 ml każdej kultury do przygotowania bulionu glicerynowego, tworząc mieszaninę 1:1 kultury bakteryjnej i 100% glicerolu.
5. Przechowuj zapasy w zamrażarce w temperaturze -80 °C.

5. Potwierdzenie koniugacji transferu plazmidu metodą PCR

1. Przygotuj dwie główne mieszanki PCR, każda z innym zestawem starterów do przodu i do tyłu, jedna ukierunkowana na segment 500 par zasad w genie oporności na ampicylinę, a druga ukierunkowana na segment w genie porządkowym.
   1. Startery genów porządkowych zostały zaprojektowane w celu amplifikacji odcinka DNA w genie bakteryjnym kodującym gyrazę DNA B (14).
   2. Do przygotowania 90 μl każdej mieszanki wzorcowej użyto następujących objętości odczynników:
      7,5 μL 10 μM startera do przodu
      7,5 μL 10 μM startera odwrotnego
      75 μL 2X PCR Master Mix
2. Przygotuj następujące sześć reakcji PCR, używając 15 μl mieszanki wzorcowej, 10 ng matrycy DNA i wody wolnej od nukleaz do końcowej objętości 25 μl.
   Startery DNA i ampicyliny w reakcji koniugacji
   Reakcja koniugacji DNA i startery do porządkowania
   Startery DNA kontroli ujemnej i ampicyliny
   DNA do kontroli negatywnej i elementarze porządkowe
   Brak starterów DNA i ampicyliny
   Brak DNA i elementarzy porządkowych
3. Przenieś te reakcje do maszyny PCR z blokiem podgrzanym do 98 C i rozpocznij termocykling w następujących warunkach:
   98 °C przez 30 sekund
   25-35 cykli po 98 °C przez 5-10 sekund, 45-72 °C przez 10 do 30 sekund i 72 °C przez 15-30 sekund na kb
   72 °C przez 5-10 minut
   Utrzymać w temperaturze 4 °C
4. Załaduj wszystkie sześć reakcji PCR na 1% żel agarozowy i uruchom przy napięciu ~150 V przez około 20 minut.
5. Wizualizacja produktu PC za pomocą oświetlacza UV.