6.11: Koniugacja: metoda przenoszenia oporności na ampicylinę z dawcy na biorcę E. coli

1. Ustawiać

1. Autoklaw około 1L pożywki Luria-Bertani (LB). Ten sterylny LB zostanie użyty do wytworzenia około 5 ml LB zawierającego 0,3 mM kwasu diaminopimelowego (DAP).
2. Zbierz następujące płytki: płytki agarowe LB z 1X Tet i 0,3 mM DAP, płytki agarowe LB tylko z 1X Tet i płytki agarowe LB tylko z 1X Amp/Tet.
3. Upewnij się, że pod ręką znajduje się trochę glicerolu i pudełko wstępnie wysterylizowanych plastikowych końcówek do pipet.
4. Przed przystąpieniem do jakichkolwiek prac związanych z drobnoustrojami należy wysterylizować miejsce pracy 70% etanolem. Zawsze noś niezbędne środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny i rękawice.
5. Po zakończeniu wysterylizuj wszystkie powierzchnie i rękawice 70% etanolem i umyj ręce.

2. Przygotowanie szczepu dawcy i biorcy

1. Przygotować 5 ml kultur bakterii szczepów dawcy i biorcy i hodować je przez noc w temperaturze 37 °C z napowietrzaniem i wstrząsaniem przy 220 obr./min. Szczep dawcy powinien być uprawiany w LB z 0,3 mM DAP.
2. Odwiruj 1 ml obu kultur (~3000 obr./min przez 5 minut) i umyj komórki PBS.
3. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).

3. Koniugacja

1. Połączyć 50 μl komórek biorczych z 50 μl komórek dawcy w probówce do mikrowirówki i wymieszać przez pipetowanie.
2. Inkubować mieszaninę komórek przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C. Zwiększy to skuteczność koniugacji przed i w trakcie następnego etapu powlekania.
3. Odpipetować 100 μl mieszaniny komórek na płytkę agarową za pomocą 1X Tet i 0,3 mM DAP. Nie rozprowadzać na talerzu.
4. Odpipetować 100 μl hodowli komórek biorcy na płytkę agarową za pomocą 1X Tet i 0,3 mM DAP. Nie rozprowadzać na talerzu.
5. Inkubować obie płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
6. Zeskrobać mieszaninę komórek koniugacyjnych i hodowlę komórek biorcy za pomocą sterylnego skrobaka do komórek. Przenieść komórki do sterylnej probówki do mikrowirówki i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS.
7. Wiruj komórki i delikatnie obracaj je w dół (~3000 obr./min przez 5 minut).
8. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS.
9. Mieszaninę komórek reakcji koniugacji umieścić na płytce agarowej LB tylko z 1X Amp/Tet. Na tej płytce oczekuje się, że będą rosły tylko bakterie biorcy, które pomyślnie uzyskały gen oporności na Amp poprzez koniugację.
10. Umieść komórki biorcze na płytce agarowej LB tylko za pomocą 1X Tet. Na tej płytce oczekuje się, że będą rosły tylko niesprzężone bakterie biorcze, które nie mają genu oporności na Amp.
11. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
12. Pobrać pojedyncze kolonie z obu płytek i użyć ich do wyhodowania kultur przez noc w 5 ml pożywki (37 °C z napowietrzaniem przy 220 obr./min).

4. Izolacja DNA

1. Wyizolować DNA z wcześniej przygotowanych kultur, używając 4,5 ml całkowitej objętości kultury za pomocą minipreparatu DNA.
2. Aby to zrobić, wymyj DNA za pomocą 35 μl wody wolnej od nukleaz.
3. Czyste DNA wygeneruje współczynnik absorbancji (A_260/280) wynoszący około 1,8.
4. Użyj pozostałych 0,5 ml każdej kultury do przygotowania bulionu glicerynowego, tworząc mieszaninę 1:1 kultury bakteryjnej i 100% glicerolu.
5. Przechowuj zapasy w zamrażarce w temperaturze -80 °C.

5. Potwierdzenie koniugacji transferu plazmidu metodą PCR

1. Przygotuj dwie główne mieszanki PCR, każda z innym zestawem starterów do przodu i do tyłu, jedna ukierunkowana na segment 500 par zasad w genie oporności na ampicylinę, a druga ukierunkowana na segment w genie porządkowym.
   1. Startery genów porządkowych zostały zaprojektowane w celu amplifikacji odcinka DNA w genie bakteryjnym kodującym gyrazę DNA B (14).
   2. Do przygotowania 90 μl każdej mieszanki wzorcowej użyto następujących objętości odczynników:
      7,5 μL 10 μM startera do przodu
      7,5 μL 10 μM startera odwrotnego
      75 μL 2X PCR Master Mix
2. Przygotuj następujące sześć reakcji PCR, używając 15 μl mieszanki wzorcowej, 10 ng matrycy DNA i wody wolnej od nukleaz do końcowej objętości 25 μl.
   Startery DNA i ampicyliny w reakcji koniugacji
   Reakcja koniugacji DNA i startery do porządkowania
   Startery DNA kontroli ujemnej i ampicyliny
   DNA do kontroli negatywnej i elementarze porządkowe
   Brak starterów DNA i ampicyliny
   Brak DNA i elementarzy porządkowych
3. Przenieś te reakcje do maszyny PCR z blokiem podgrzanym do 98 C i rozpocznij termocykling w następujących warunkach:
   98 °C przez 30 sekund
   25-35 cykli po 98 °C przez 5-10 sekund, 45-72 °C przez 10 do 30 sekund i 72 °C przez 15-30 sekund na kb
   72 °C przez 5-10 minut
   Utrzymać w temperaturze 4 °C
4. Załaduj wszystkie sześć reakcji PCR na 1% żel agarozowy i uruchom przy napięciu ~150 V przez około 20 minut.
5. Wizualizacja produktu PC za pomocą oświetlacza UV.

Komórki bakteryjne, takie jak E. coli, są zdolne do przenoszenia informacji genetycznej z komórki do komórki. Koniugacja różni się od innych mechanizmów transferu DNA, takich jak transdukcja czy transformacja, tym, że wymaga fizycznego kontaktu między komórkami.

Aby kontynuować, koniugacja wymaga komórki dawcy, która wyraża czynnik płodności lub F, oraz komórki biorcy bez niego, komórki F minus. Proces ten składa się z dwóch kroków. Pierwszym z nich jest nawiązanie bezpośredniego kontaktu między komórkami. Aby to zrobić, komórka dawcy wytwarza zewnątrzkomórkową nitkowatą strukturę zwaną pilusem płciowym. Nazywa się tak, ponieważ koniugacja jest formą krycia bakterii rozmnażających się bezpłciowo, ale należy zauważyć, że nie jest to prawdziwe rozmnażanie płciowe, ponieważ nie dochodzi do wymiany gamet i nie powstaje potomstwo.

Drugim krokiem jest dostarczenie DNA do komórki biorcy. Po tym, jak pilus płciowy nawiąże kontakt między dwiema komórkami, budowany jest kanał zwany systemem wydzielania typu IV, który umożliwia transfer DNA. Następnie komórka dawcy zaczyna replikować pozachromosomalne DNA, które zostanie przeniesione, wybrane na podstawie obecności elementu genetycznego znanego jako OriT lub pochodzenie transferu. Jeden koniec nowo zreplikowanego DNA jest nawleczony do przewodu poprzez wiązanie białka DNA. W miarę dalszej replikacji DNA jest pompowane przez kanał, co ułatwia kompleks białek kodowanych przez geny znajdujące się w pobliżu OriT. Gdy DNA zostanie w pełni przeniesione, albo utworzy dodatkowy plazmid chromosomalny, albo może zintegrować się z chromosomem komórki biorcy. Niezależnie od tego, który jest punkt końcowy przeniesionego DNA, geny, które koduje, ulegną ekspresji. Ta ekspresja genu może być wykorzystana do potwierdzenia udanej koniugacji.

Rozważmy na przykład scenariusz, w którym szczep dawcy wyraża oporność na ampicylinę i przekazuje ją w sprzężonym DNA bakterii biorcy, ale szczep biorcy ma również gen oporności na tetracykliny, który nie występuje u dawcy. W tym przypadku, gdy komórki są posiane na pożywce LB zawierającej zarówno tetracyklinę, jak i ampicylinę, kolonie powinny rosnąć tylko z pomyślnie sprzężonych bakterii, które będą wyrażać oba fenotypy oporności. Aby dodatkowo potwierdzić udaną koniugację, plazmidowe DNA z tych kolonii można zebrać, a następnie odcinek DNA specyficzny dla przeniesionego plazmidu można amplifikować za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy lub PCR. Gdy produkt PCR jest uruchamiany na żelu do elektroforezy wraz z drabinką o standardowych rozmiarach, na żelu powinien być widoczny fragment PCR o znanym rozmiarze, co dodatkowo potwierdza udaną koniugację. W tym eksperymencie plazmid zostanie wykorzystany do przeniesienia genu oporności na ampicylinę poprzez koniugację ze szczepu dawcy do szczepu biorcy opornego na tetracykliny. Następnie, aby potwierdzić koniugację, mieszanina koniugacyjną będzie inkubowana na płytce zawierającej oba antybiotyki, pozostawiając tylko przekształcone bakterie. Na koniec udana koniugacja zostanie dodatkowo potwierdzona za pomocą PCR.

Przed przystąpieniem do zabiegu należy założyć odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny i rękawice. Następnie wysterylizuj miejsce pracy przy użyciu 70% etanolu, aby wytrzeć powierzchnię.

W tej procedurze gen oporności na ampicylinę zostanie przeniesiony ze szczepu WM3064 E. coli do szczepu J53 E. coli poprzez koniugację. Szczep dawcy WM3064 jest odporny na tetracyklinę i ampicylinę, a do wzrostu wymaga kwasu diaminomelicznego lub DAP. Szczep biorczy J53 jest odporny tylko na tetracyklinę i nie wymaga DAP do wzrostu. Oznacza to, że pomyślnie sprzężone komórki powinny być odporne na tetracyklinę i ampicylinę oraz mogą rosnąć bez DAP.

Przygotuj kulturę szczepu dawcy, zaszczepiając pięć mililitrów LB zawierających 0,3 milimola DAP skrawkiem zamrożonego szczepu dawcy glicerolu. Następnie przygotuj szczep biorcy, zaszczepiając pięć mililitrów bulionu LB bez DAP skrawkiem zamrożonego szczepu biorcy glicerolu. Hoduj te kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z napowietrzaniem i wytrząsaniem z prędkością 220 obr./min w inkubatorze z wytrząsaniem. Gdy kultury osiągną OD 600 z dwóch, usuń jeden mililitr kultury z każdej i umieść go w dwóch nowych oddzielnych probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 mililitra. Następnie odwiruj te porcje z prędkością 3000 obr./min przez pięć minut, aby osadzać komórki bakteryjne. Odrzucić supernatant i przemyć każdą osadkę 250 mikrolitrami 1X PBS. Ponownie odwirować próbki i po odrzuceniu supernatantu ponownie zawiesić każdą osadkę w 500 mikrolitrach PBS.

Aby rozpocząć procedurę koniugacji, najpierw połącz 50 mikrolitrów komórek biorcy z 50 mikrolitrami komórek dawcy w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej i delikatnie wymieszaj, pipetując w górę iw dół. Następnie pipetować 100 mikrolitrów kultury komórkowej biorcy na inną płytkę tetracyklinową 1X zawierającą DAP. Następnie należy przygotować kontrolę ujemną, pipetując 100 mikrolitrów kultury komórkowej biorcy tylko na nieselektywną płytkę agarową zawierającą DAP. Następnie inkubuj płytki koniugacyjne i kontrolne ujemne przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia weź sterylny skrobak do komórek i zbierz komórki z płytki koniugacyjnej, zbierając kolonie. Następnie przenieś kolonie do sterylnej 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej zawierającej jeden mililitr 1X PBS. Powtórz ten proces, aby zebrać komórki biorcze z drugiej płytki.

Następnie zwiruj próbki, aby się wymieszać. Po wymieszaniu przenieś probówki do wirówki, aby delikatnie granulować komórki. Wyrzuć supernatant, a następnie umyj granulki komórek w jednym mililitrze PBS i zwiruj probówki, aby ponownie zawiesić komórki. Ponownie zagnieździć komórki przez odwirowanie. Ponownie wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić obie osadki komórkowe w jednym mililitrze PBS. Teraz, używając sterylnej końcówki pipety, rozłóż 100 mikrolitrów mieszaniny komórek reakcji koniugacji na płytce agarowej LB bez DAP zawierającej 1X tetracyklinę i 1X ampicylinę. Powtórzyć metodę posiewu, stosując 100 mikrolitrów dziesięciokrotnego rozcieńczenia tej samej mieszaniny komórek w PBS na innej płytce agarowej LB bez DAP zawierającej 1X tetracyklinę i 1X ampicylinę.

Na koniec odpipetować 100 mikrolitrów mieszaniny komórek kontroli ujemnej na pojedynczą płytkę agarową LB tylko z tetracykliną 1X. Po całonocnej inkubacji w temperaturze 37 stopni Celsjusza kolonie powinny być widoczne. Używając sterylnej końcówki pipety, wybierz pojedynczą kolonię z płytki reakcyjnej koniugacji i dodaj ją do probówki zawierającej pięć mililitrów selektywnej pożywki LB zawierającej oba antybiotyki. Następnie powtórz izolację kolonii, wybierając pojedynczą kolonię z płytki komórki biorcy. Uprawiaj te kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z napowietrzaniem przy 220 obr./min.

Następnego dnia przetrzyj blat stołu 70% etanolem i wyjmij płytki z inkubatora. Użyj mini zestawu do przygotowania DNA, aby wyizolować DNA z 4. 5 mililitrów każdej kultury zgodnie z instrukcjami producenta. Po zakończeniu mini przygotowania DNA wymyj DNA za pomocą 35 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz. Na koniec użyj pozostałego 0. 5 mililitrów każdej kultury, aby przygotować jeden mililitr glicerolu, dodając 0,5 mililitra 100% glicerolu w celu rozcieńczenia jeden do jednego. Umieść te porcje w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do przechowywania do czasu, gdy będą potrzebne.

Aby potwierdzić pomyślną koniugację metodą PCR, najpierw przygotuj główną mieszankę PCR, dodając 75 mikrolitrów głównej mieszanki 2X PCR do probówki mikrowirówkowej. Następnie dodaj po 7,5 mikrolitra 10-mikromolowego startera do przodu i 10-mikromolowego startera wstecznego przeznaczonego do amplifikacji genu oporności na ampicylinę z plazmidu. Następnie przygotuj drugą mieszankę wzorcową PCR, dodając 75 mikrolitrów głównej mieszanki 2X PCR do probówki mikrowirówkowej, a następnie dodając po 7,5 mikrolitra 10-mikromolowego startera do przodu i 10 mikromolowego startera odwrotnego przeznaczonego do amplifikacji genu porządkowego, w tym przypadku gyrazy DNA B.

Teraz dodaj 15 mikrolitrów pierwszej mieszanki głównej do probówki PCR, a następnie dodaj 10 nanogramów, około dwóch mikrolitrów eksperymentalnego DNA matrycy do tej samej probówki. Doprowadzić reakcję do końcowej objętości 25 mikrolitrów wodą bez nukleaz. Powtórz te kroki, aby wytworzyć pozostałe pięć reakcji, tak aby probówki zawierały pokazane tutaj składniki. Teraz przenieś te reakcje do termocyklera z blokiem podgrzanym do 98 stopni Celsjusza, a następnie rozpocznij program. Po zakończeniu PCR wyjmij probówki z urządzenia. Następnie załaduj dwa mikrolitry każdej reakcji zmieszane z dwoma mikrolitrami barwnika ładującego i czterema mikrolitrami markera masy cząsteczkowej do kolejnych dołków 1% żelu agarozowego. Ustaw żel tak, aby działał pod napięciem 150 woltów przez 20 minut. Na koniec zwizualizuj żel za pomocą rozświetlacza UV.

W tym eksperymencie pomyślne przeniesienie genu oporności na ampicylinę poprzez koniugację zostało potwierdzone za pomocą PCR. W tym przypadku należy zaobserwować pasmo wielkości około 500 par zasad w studzience zawierającej sprzężone DNA i startery ampicyliny, w tym przykładzie dobrze dwa. Gen porządkowy, gyraza DNA B, został załadowany do studzienek trzeciej i piątej odpowiednio ze sprzężonym DNA i DNA komórki biorcy. Paseżki zaobserwowane w tych studzienkach działają jak kontrola pozytywna, aby upewnić się, że matryca DNA była obecna i że PCR zakończył się sukcesem. Nie należy obserwować prążków w studzience zawierającej reakcję na DNA komórki biorcy i parę starterów ampicyliny, w tym przykładzie dobrze czwartą, ponieważ komórki biorcze nie są oporne na ampicylinę. Ponadto nie należy obserwować prążków w reakcjach pozbawionych matrycowego DNA, studzienek szóstej i siódmej tutaj. Jeśli te warunki zostaną spełnione, potwierdzi to pomyślne przeniesienie genu oporności na ampicylinę, nadając oporność na ampicylinę ze szczepu WM3064 E. coli na szczep J53 E. coli.