6.12: Transdukcja fagowa: metoda przenoszenia oporności na ampicylinę od dawcy do biorcy E. coli

1. Ustawienie

1. Przed przystąpieniem do jakichkolwiek prac z drobnoustrojami należy wysterylizować miejsce pracy przy użyciu 70% etanolu. Zawsze używaj niezbędnych środków ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny i rękawice).
2. Upewnij się, że pod ręką znajdują się płytki agarowe LB z 1x ampicyliną, dostępnym w handlu roztworem lizatu fagowego P1, chloroformem, 1 M cytrynianem sodu, glicerolem oraz pudełkiem wstępnie wysterylizowanych plastikowych końcówek do pipet i rozsiewaczy komórek.
3. Przygotować sterylny LB przez autoklawowanie i użyć go do przygotowania trzech 1 ml porcji roztworu soli LB.
   1. mM MgCl₂ (952,11-2,3803 μg), 5 mM CaCl₂ (11,098 mg), 0,1-0,2% glukozy (100-200 μg)
   2. mM MgSO₄ (12,0366 mg), 5 mM CaCl₂ (11,098 mg)
   3. mM cytrynian sodu (25,806 mg)
4. Po zakończeniu wysterylizuj wszystkie powierzchnie, a także rękawice 70% etanolem i umyj ręce.

2. Protokół

1. Przygotowanie lizatu fagowego dawcy
   1. Przygotuj 1 ml kultury szczepu W3110 dawcy E. coli w LB z 1x ampicyliną uprawianą przez noc w temperaturze 37 °C z napowietrzeniem i wytrząsaniem przy 220 obr./min.
   2. Rozcieńczyć tę nocną kulturę w stosunku 1:100 w 1 ml świeżego LB uzupełnionego 10-25 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂ i 0,1-0,2% glukozy.
   3. Tę rozcieńczoną bakterię hodować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny z napowietrzaniem i wstrząsaniem przy 220 obr./min.
   4. Gdy komórki te osiągną wczesną logarytmiczną fazę wzrostu (zauważalny wzrost i lekkie zmętnienie), dodać 40 μl dostępnego w handlu faga P1 i pozostawić w temperaturze 37 °C z napowietrzeniem i wstrząsaniem z prędkością 220 obr./min.
      1. Przed dodaniem faga zmierzona gęstość optyczna tych komórek przy 600 nm powinna wynosić około 0,4 (6).
   5. Monitoruj komórki przez 1-3 godziny, aż kultura ulegnie lizie.
      1. Liza spowoduje zwiększenie ilości resztek komórkowych, a także znaczny spadek zmętnienia (tj. komórki zostaną uznane za zlizowane, gdy będzie się w stanie przejrzeć kulturę).
   6. Dodać kilka kropli (50-100 μl) chloroformu do lizatu i wymieszać wirowo.
      1. Chloroform sterylizuje lizat faga, zabijając wszelkie pozostałe komórki dawcy, pozostawiając tylko fag i zwiększając miano tego lizatu.
   7. Odwiruj lizat z prędkością 14 000 obr./min przez 2 minuty, aby usunąć zanieczyszczenia i przenieść supernatant do świeżej probówki.
   8. Dodać kilka kropli chloroformu i przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż jeden dzień.
2. Transdukcja
   1. Przygotować 1 ml kultury biorcy szczepu J53 E. coli wyhodowanego przez noc w LB w temperaturze 37 °C z napowietrzeniem i wstrząsaniem przy 220 obr./min.
   2. Przenieść 100 μl lizatu fagowego dawcy (2.1) do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i inkubować z otwartym wieczkiem w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
      1. Ta inkubacja pozwala na odparowanie pozostałego chloroformu w roztworze lizatu P1 przed dodaniem do komórek biorcy.
   3. Delikatnie osadzać komórki szczepu biorcy przez wirowanie z prędkością 6,000 obr./min przez 5 minut.
   4. Zawieś te komórki w 300 μl świeżego LB zawierającego 100 mM MgSO₄ i 5 mM CaCl₂. (Fag P1 wymaga, aby wapń był zakaźny).
   5. Ustaw dwie reakcje z wykorzystaniem komórek bakteryjnych biorcy i przygotowanego lizatu fagowego dawcy: 1) reakcję transdukcji łączącą 100 μL biorcy szczepu J53 E. coli i 100 μL lizatu fagowego dawcy oraz 2) kontrolę ujemną łączącą 100 μL szczepu J53 biorcy E. coli i 100 μL LB zawierającego 100 mM MgSO₄ i 5 mM CaCl₂.
   6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, wytrząsając przy 220 obr./min.
   7. Dodać 1 ml LB i 200 μl 1M cytrynianu sodu (pH = 5,5) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min.
      1. Cytrynian stosuje się w celu zmniejszenia zakaźności P1 poprzez chelatację wapniem, zapobiegając lizie bakterii biorcy.
      2. Inkubacja tego roztworu pozwala na ekspresję markera oporności na ampicylinę.
   8. Komórki peletowe przez wirowanie z prędkością 6 000 obr./min przez 5 minut.
   9. Zawiesić osady komórkowe w 100 μl LB ze 100 mM cytrynianu sodu (pH 5,5). Wirować i płytkować cały roztwór dla obu reakcji na dwóch płytkach agarowych LB.
      1. Płytka LB powinna mieć 1x Amp dla transdukowanej próbki i brak Amp dla kontroli ujemnej.
      2. Zanieczyszczenie fagami P1 na tej płytce wymaga ponownego spryskania przed przygotowaniem zapasów do zamrażania.
      3. Jeśli fag nie zostanie usunięty, kultury wyhodowane z tych kolonii nie będą rosły, chyba że w obecności chelatora wapnia.
   10. Zbierz około 3-4 kolonii z obu płytek i ponownie rozprowadź smugi na dwóch płytkach agarowych LB posmarowanych 100 μl 1 M cytrynianu sodu (pH = 5,5).
       1. Płytka LB powinna mieć 1x Amp dla transdukowanej próbki i brak Amp dla kontroli ujemnej.
   11. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc, aby umożliwić wzrost kolonii wolnych od fagów.
   12. Zbierz kolonie z obu płytek i użyj ich do wyhodowania kultur przez noc w 5 ml LB w temperaturze 37 °C z napowietrzaniem i wytrząsaniem przy 220 obr./min.
   13. Wyizolować DNA z tych kultur za pomocą minipreparatu DNA, używając 4,5 ml całkowitej objętości hodowli.
       1. Elutować DNA za pomocą 35 μl wody wolnej od nukleaz.
       2. Zmierz wynikowe stężenie za pomocą Nanodrop. Czyste DNA wygeneruje współczynnik absorbancji (A_260/280) wynoszący około 1,8.
   14. Użyj pozostałych 0,5 ml każdej kultury, aby przygotować 1 ml bulionu glicerynowego, tworząc mieszaninę 1:1 100% glicerolu i kultury bakteryjnej.
   15. Zapasy glicerolu bakteryjnego należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Analiza danych i wyniki

1. Potwierdzenie transdukcji za pomocą qPCR
   1. Przygotować dwie główne mieszaniny qPCR dla sześciu reakcji qPCR, trzy przy użyciu starterów qPCR dla genu oporności na ampicylinę, a pozostałe trzy przy użyciu starterów qPCR dla genu porządkowego (14,5 μl na reakcję): 12,5 μl mieszaniny buforowej qPCR + 1 μl startera do przodu + 1 μl startera odwrotnego.
      1. W tym eksperymencie użyliśmy miksu SYBR Green master.
      2. Startery genów porządkowych zostały zaprojektowane w celu amplifikacji segmentu DNA w genie bakteryjnym kodującym gyrazę DNA B (7).
   2. Dla każdej reakcji qPCR połącz 100 μg DNA z każdej reakcji (10,5 μl) z 14,5 μl głównej mieszanki qPCR.
   3. Za pomocą urządzenia qPCR i protokołu termocyklingu wymienionego w tabeli 1 zmierzono amplifikację pod kątem oporności na ampicylinę i genów porządkowych dla wszystkich sześciu reakcji.
   4. Wartości Cq wygenerowane przez qPCR wykorzystano do obliczenia znormalizowanej skuteczności transdukcji genu oporności na ampicylinę (ryc. 3), potwierdzając pomyślną transdukcję genu oporności na ampicylinę.
      1. Wartość Cq lub wartość kwantyfikacji cyklu próbki jest najwcześniejszym numerem cyklu PCR, przy którym wykryto sygnał przekraczający próg tła. Niskie wartości Cq odpowiadają większej liczbie sekwencji docelowej i na odwrót.
      2. Znormalizowaną wydajność transdukcji genu w próbce można obliczyć przy użyciu tych wartości Cq, odejmując wartość genu porządkowego od wartości genu docelowego, generując wartość ΔCq, którą można wykorzystać do obliczenia znormalizowanej wydajności transdukcji przez 2^(-ΔCq).

Tabela 1: Protokół termocyklingu qPCR

Bakterie mogą szybko przystosować się do szybko zmieniającego się środowiska poprzez wymianę materiału genetycznego, a jednym ze sposobów, w jaki mogą to zrobić, jest transdukcja, wymiana materiału genetycznego, w której pośredniczą wirusy bakteryjne. Bakteriofag, często w skrócie fag, to rodzaj wirusa, który infekuje bakterie, najpierw przyczepiając się do powierzchni gospodarza, a następnie wstrzykując swoje DNA do komórki bakteryjnej. Następnie degraduje własne DNA komórki gospodarza i replikuje jej genom wirusa, jednocześnie przejmując kontrolę nad maszynerią komórki w celu syntezy wielu kopii jej białek. Te białka fagowe następnie samoorganizują się i pakują genomy fagów, tworząc wiele potomstwa. Jednak ze względu na niską wierność mechanizmu pakowania DNA, czasami fag pakuje fragmenty bakteryjnego DNA do kapsydu faga. Po wywołaniu lizy gospodarza potomstwo faga jest uwalniane, a gdy taki fag zainfekuje inną komórkę gospodarza, przenosi fragment DNA poprzedniego gospodarza. Może to następnie rekombinować i zostać trwale włączone do chromosomu nowego gospodarza, pośrednicząc w ten sposób w transferze genów między dwiema bakteriami.

Przeprowadzenie transdukcji fagów w laboratorium wymaga szczepu dawcy, który zawiera gen będący przedmiotem zainteresowania, szczepu biorcy, który go nie posiada, faga, który może infekować oba szczepy, oraz metody selekcji transdukowanych bakterii. W większości przypadków będzie to selektywna pożywka wzrostowa w postaci stałej, która wspomaga wzrost bakterii transdukowanych, ale hamuje wzrost bakterii nietransdukowanych. Na początek szczep dawcy, który zawiera interesujący nas gen, jest hodowany w płynnym pożywce wzrostowej. Kiedy wszystkie bakterie aktywnie dzielą się w fazie logarytmicznej swojego wzrostu, kultura jest zaszczepiana docelowym fagiem. Po trzech do czterech godzinach inkubacji, kiedy prawie wszystkie bakterie poddają się lizie i uwalniają cząsteczki faga, lizat fagowy dawcy jest inokulowany do świeżo wyhodowanej kultury szczepu bakteryjnego biorcy. Po krótkiej, jednogodzinnej inkubacji, hodowla powinna teraz zawierać mieszaninę transdukowanych i nietransdukowanych komórek bakteryjnych, która jest badana pod kątem transdukowanych komórek poprzez rozprowadzenie frakcji zawiesiny na odpowiedniej selektywnej pożywce wzrostowej w postaci stałej. Po dalszej inkubacji transdukowane komórki powinny rosnąć i rozmnażać się, aby uzyskać widoczne kolonie. Kolonie te można następnie wybrać do dalszej analizy przy użyciu różnych metod, aby dodatkowo potwierdzić udaną transdukcję, takich jak PCR kolonii, sekwencjonowanie DNA lub ilościowy PCR.

Przed przystąpieniem do zabiegu należy założyć odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch laboratoryjny i rękawice. Następnie wysterylizuj miejsce pracy 70% etanolem i wytrzyj powierzchnię.

Następnie przygotuj trzy jednomililitrowe porcje roztworu soli LB. Teraz przygotuj hodowlę szczepu dawcy, dodając 100 mikrolitrów E. coli do 15-mililitrowej stożkowej fiolki zawierającej pięć mililitrów pożywki LB z 500 mikrogramami ampicyliny. Następnie hoduj kulturę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z napowietrzaniem i wstrząsaniem przy 220 obr./min. Następnego dnia przetrzyj blat stołu 70% etanolem przed wyjęciem kultury z inkubatora do wytrząsania. Następnie rozcieńczyć kulturę przez noc od jednego do 100, dodając 10 mikrolitrów szczepu dawcy do 990 mikrolitrów świeżego LB uzupełnionego roztworem soli.

Pozwól rozcieńczeniu bakterii rosnąć w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny z napowietrzaniem i wstrząsaniem z prędkością 220 obr./min. Gdy komórki osiągną wczesną fazę logarytmiczną, wyjmij kulturę z inkubatora, dodaj 40 mikrolitrów faga P1 do kultury i ponownie inkubuj. Kontynuuj monitorowanie komórek przez jedną do trzech godzin, aż kultura ulegnie lizie. Następnie dodaj 50 do 100 mikrolitrów chloroformu do lizatu i wymieszaj przez wirowanie. Następnie odwirować lizat w celu usunięcia zanieczyszczeń i przenieść supernatant do świeżej probówki. Dodaj kilka kropli chloroformu do supernatantu i przechowuj go w temperaturze czterech stopni Celsjusza nie dłużej niż jeden dzień.

Aby rozpocząć procedurę transdukcji, należy uzyskać jednomililitrową kulturę szczepu biorcy. Następnie przenieś 100 mikrolitrów lizatu fagowego dawcy do 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówkowej i inkubuj ją w temperaturze 37 stopni Celsjusza z otwartą nakrętką przez 30 minut, aby umożliwić odparowanie pozostałego chloroformu. Podczas inkubacji lizatu faga dawcy należy osadzać komórki szczepu biorcy poprzez delikatne wirowanie. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 300 mikrolitrach świeżego LB zawierającego 100 milimolowy siarczan magnezu i pięć milimolowy chlorek wapnia.

Następnie należy skonfigurować reakcję transdukcji, łącząc 100 mikrolitrów szczepu biorcy i 100 mikrolitrów lizatu fagowego dawcy w probówce do mikrowirówki. Następnie ustaw kontrolę negatywną, łącząc 100 mikrolitrów szczepu biorcy i 100 mikrolitrów LB z siarczanem magnezu i chlorkiem wapnia. Po inkubacji dodać 200 mikrolitrów jednego molowego cytrynianu sodu i jeden mililitr LB do obu probówek i wymieszać, delikatnie pipetując w górę iw dół. Następnie, po godzinnej inkubacji probówek, delikatnie otulić komórki przez odwirowanie.

Po odwirowaniu odrzucić supernatant i ponownie zawiesić granulowane komórki w 100 mikrolitrach LB ze 100 milimolowym roztworem cytrynianu sodu. Roztwory należy zmieszać wirami i odpipetować całą transdukowaną próbkę na płytkę agarową LB z 1X ampicyliną. Na koniec odpipetować całą objętość mieszaniny komórek kontroli ujemnej na płytkę agarową LB bez ampicyliny. Po inkubacji płytek przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza, użyj sterylnej końcówki pipety, aby wybrać trzy do czterech kolonii z płytki transdukcyjnej i rozprowadzić je na nowej płytce agarowej LB zawierającej 1X ampicylinę i 100 mikrolitrów jednego molowego cytrynianu sodu. Powtórzyć tę metodę powlekania dla kontroli ujemnej na innej płytce agarowej LB zawierającej tylko 100 mikrolitrów jednego molowego cytrynianu sodu. Następnie inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc, aby umożliwić wzrost kolonii wolnych od fagów.

Następnego dnia przetrzyj blat stołu 70% etanolem przed wyjęciem płytek z inkubatora. Za pomocą sterylnej końcówki pipety wybierz trzy kolonie z płytki transdukcyjnej i dodaj je do osobnej probówki zawierającej pięć mililitrów pożywki LB. Następnie wybierz trzy kolonie z płytki kontroli ujemnej i dodaj je do innej probówki zawierającej pięć mililitrów pożywki LB. Hoduj kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza z napowietrzaniem i wstrząsaniem z prędkością 220 obr./min. Po wysterylizowaniu blatu, jak pokazano wcześniej, użyj zestawu do miniprzygotowania DNA, aby wyizolować DNA z 4,5 mililitra każdej kultury zgodnie z instrukcjami producenta. Następnie wymyj DNA za pomocą 35 mikrolitrów wody wolnej od nukleaz i zmierz wynikowe stężenie za pomocą spektrofotometru laboratoryjnego. Na koniec przygotuj zapasy glicerolu, dodając pozostałe 0,5 mililitra obu roztworów bakteryjnych do 0,5 mililitra 100% glicerolu.

Aby potwierdzić transdukcję, najpierw przygotuj dwie główne mieszaniny qPCR dla 24 reakcji qPCR. W przypadku pierwszej mieszanki wzorcowej dodać 150 mikrolitrów mieszaniny buforowej qPCR do probówki mikrowirówki i po 12 mikrolitrów startera do przodu i do tyłu przeznaczonego do amplifikacji genu oporności na ampicylinę. Następnie przygotuj drugą mieszankę wzorcową qPCR, dodając 150 mikrolitrów głównej mieszanki qPCR do probówki mikrowirówkowej, a następnie dodając po 12 mikrolitrów startera do przodu i startera wstecznego, zaprojektowanego w celu amplifikacji genu porządkowego.

Dla każdej reakcji qPCR połącz 100 mikrogramów eksperymentalnego DNA z każdej reakcji z 14,5 mikrolitrami głównej mieszanki qPCR. Teraz przygotuj pozostałe reakcje, jak pokazano wcześniej. Przenieś reakcje do termocyklera nagrzanego do 94 stopni Celsjusza, a następnie rozpocznij program. Na koniec użyj wartości ilościowych cyklu lub Cq wygenerowanych przez qPCR, aby obliczyć znormalizowaną skuteczność transdukcji genu oporności na ampicylinę.

Wartości ilościowe cyklu lub Cq dla genów będących przedmiotem zainteresowania zostały zestawione w tabeli dla każdej z kontroli ujemnych i transdukowanych próbek. Niskie wartości Cq, zwykle poniżej 29 cykli, takie jak transdukowane próbki w tym przykładzie, wskazują na duże ilości sekwencji docelowej.

Gen porządkowy, również zestawiony tutaj, jest używany jako kontrola obciążenia w celu normalizacji ilości DNA w każdej reakcji oraz jako kontrola pozytywna, aby upewnić się, że qPCR działa. Pod warunkiem, że załadowane są te same ilości genu porządkowego, stwierdza się go w stosunkowo takim samym tempie w każdej próbce.

Następnie, aby obliczyć wartość delta Cq dla każdej próbki, odejmij wartość Cq genu porządkowego dla każdej próbki od wartości Cq odpowiadającego jej genu docelowego. Na przykład delta Cq pierwszej kontroli ujemnej wynosi 13,54. Następnie użyj tej wartości, aby obliczyć znormalizowaną wydajność transdukcji każdej próbki przy użyciu wzoru pokazanego poniżej. Na koniec można obliczyć średnią znormalizowaną wydajność transdukcji dla każdej grupy próbek.