Transdukcja fagowa: metoda przenoszenia oporności na ampicylinę od dawcy do biorcy E. coli

1. Ustawienie

1. Przed przystąpieniem do jakichkolwiek prac z drobnoustrojami należy wysterylizować miejsce pracy przy użyciu 70% etanolu. Zawsze używaj niezbędnych środków ochrony osobistej (fartuch laboratoryjny i rękawice).
2. Upewnij się, że pod ręką znajdują się płytki agarowe LB z 1x ampicyliną, dostępnym w handlu roztworem lizatu fagowego P1, chloroformem, 1 M cytrynianem sodu, glicerolem oraz pudełkiem wstępnie wysterylizowanych plastikowych końcówek do pipet i rozsiewaczy komórek.
3. Przygotować sterylny LB przez autoklawowanie i użyć go do przygotowania trzech 1 ml porcji roztworu soli LB.
   1. mM MgCl₂ (952,11-2,3803 μg), 5 mM CaCl₂ (11,098 mg), 0,1-0,2% glukozy (100-200 μg)
   2. mM MgSO₄ (12,0366 mg), 5 mM CaCl₂ (11,098 mg)
   3. mM cytrynian sodu (25,806 mg)
4. Po zakończeniu wysterylizuj wszystkie powierzchnie, a także rękawice 70% etanolem i umyj ręce.

2. Protokół

1. Przygotowanie lizatu fagowego dawcy
   1. Przygotuj 1 ml kultury szczepu W3110 dawcy E. coli w LB z 1x ampicyliną uprawianą przez noc w temperaturze 37 °C z napowietrzeniem i wytrząsaniem przy 220 obr./min.
   2. Rozcieńczyć tę nocną kulturę w stosunku 1:100 w 1 ml świeżego LB uzupełnionego 10-25 mM MgCl₂, 5 mM CaCl₂ i 0,1-0,2% glukozy.
   3. Tę rozcieńczoną bakterię hodować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny z napowietrzaniem i wstrząsaniem przy 220 obr./min.
   4. Gdy komórki te osiągną wczesną logarytmiczną fazę wzrostu (zauważalny wzrost i lekkie zmętnienie), dodać 40 μl dostępnego w handlu faga P1 i pozostawić w temperaturze 37 °C z napowietrzeniem i wstrząsaniem z prędkością 220 obr./min.
      1. Przed dodaniem faga zmierzona gęstość optyczna tych komórek przy 600 nm powinna wynosić około 0,4 (6).
   5. Monitoruj komórki przez 1-3 godziny, aż kultura ulegnie lizie.
      1. Liza spowoduje zwiększenie ilości resztek komórkowych, a także znaczny spadek zmętnienia (tj. komórki zostaną uznane za zlizowane, gdy będzie się w stanie przejrzeć kulturę).
   6. Dodać kilka kropli (50-100 μl) chloroformu do lizatu i wymieszać wirowo.
      1. Chloroform sterylizuje lizat faga, zabijając wszelkie pozostałe komórki dawcy, pozostawiając tylko fag i zwiększając miano tego lizatu.
   7. Odwiruj lizat z prędkością 14 000 obr./min przez 2 minuty, aby usunąć zanieczyszczenia i przenieść supernatant do świeżej probówki.
   8. Dodać kilka kropli chloroformu i przechowywać w temperaturze 4 °C nie dłużej niż jeden dzień.
2. Transdukcja
   1. Przygotować 1 ml kultury biorcy szczepu J53 E. coli wyhodowanego przez noc w LB w temperaturze 37 °C z napowietrzeniem i wstrząsaniem przy 220 obr./min.
   2. Przenieść 100 μl lizatu fagowego dawcy (2.1) do probówki do mikrofuge o pojemności 1,5 ml i inkubować z otwartym wieczkiem w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
      1. Ta inkubacja pozwala na odparowanie pozostałego chloroformu w roztworze lizatu P1 przed dodaniem do komórek biorcy.
   3. Delikatnie osadzać komórki szczepu biorcy przez wirowanie z prędkością 6,000 obr./min przez 5 minut.
   4. Zawieś te komórki w 300 μl świeżego LB zawierającego 100 mM MgSO₄ i 5 mM CaCl₂. (Fag P1 wymaga, aby wapń był zakaźny).
   5. Ustaw dwie reakcje z wykorzystaniem komórek bakteryjnych biorcy i przygotowanego lizatu fagowego dawcy: 1) reakcję transdukcji łączącą 100 μL biorcy szczepu J53 E. coli i 100 μL lizatu fagowego dawcy oraz 2) kontrolę ujemną łączącą 100 μL szczepu J53 biorcy E. coli i 100 μL LB zawierającego 100 mM MgSO₄ i 5 mM CaCl₂.
   6. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, wytrząsając przy 220 obr./min.
   7. Dodać 1 ml LB i 200 μl 1M cytrynianu sodu (pH = 5,5) i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przy 220 obr./min.
      1. Cytrynian stosuje się w celu zmniejszenia zakaźności P1 poprzez chelatację wapniem, zapobiegając lizie bakterii biorcy.
      2. Inkubacja tego roztworu pozwala na ekspresję markera oporności na ampicylinę.
   8. Komórki peletowe przez wirowanie z prędkością 6 000 obr./min przez 5 minut.
   9. Zawiesić osady komórkowe w 100 μl LB ze 100 mM cytrynianu sodu (pH 5,5). Wirować i płytkować cały roztwór dla obu reakcji na dwóch płytkach agarowych LB.
      1. Płytka LB powinna mieć 1x Amp dla transdukowanej próbki i brak Amp dla kontroli ujemnej.
      2. Zanieczyszczenie fagami P1 na tej płytce wymaga ponownego spryskania przed przygotowaniem zapasów do zamrażania.
      3. Jeśli fag nie zostanie usunięty, kultury wyhodowane z tych kolonii nie będą rosły, chyba że w obecności chelatora wapnia.
   10. Zbierz około 3-4 kolonii z obu płytek i ponownie rozprowadź smugi na dwóch płytkach agarowych LB posmarowanych 100 μl 1 M cytrynianu sodu (pH = 5,5).
       1. Płytka LB powinna mieć 1x Amp dla transdukowanej próbki i brak Amp dla kontroli ujemnej.
   11. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez noc, aby umożliwić wzrost kolonii wolnych od fagów.
   12. Zbierz kolonie z obu płytek i użyj ich do wyhodowania kultur przez noc w 5 ml LB w temperaturze 37 °C z napowietrzaniem i wytrząsaniem przy 220 obr./min.
   13. Wyizolować DNA z tych kultur za pomocą minipreparatu DNA, używając 4,5 ml całkowitej objętości hodowli.
       1. Elutować DNA za pomocą 35 μl wody wolnej od nukleaz.
       2. Zmierz wynikowe stężenie za pomocą Nanodrop. Czyste DNA wygeneruje współczynnik absorbancji (A_260/280) wynoszący około 1,8.
   14. Użyj pozostałych 0,5 ml każdej kultury, aby przygotować 1 ml bulionu glicerynowego, tworząc mieszaninę 1:1 100% glicerolu i kultury bakteryjnej.
   15. Zapasy glicerolu bakteryjnego należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

3. Analiza danych i wyniki

1. Potwierdzenie transdukcji za pomocą qPCR
   1. Przygotować dwie główne mieszaniny qPCR dla sześciu reakcji qPCR, trzy przy użyciu starterów qPCR dla genu oporności na ampicylinę, a pozostałe trzy przy użyciu starterów qPCR dla genu porządkowego (14,5 μl na reakcję): 12,5 μl mieszaniny buforowej qPCR + 1 μl startera do przodu + 1 μl startera odwrotnego.
      1. W tym eksperymencie użyliśmy miksu SYBR Green master.
      2. Startery genów porządkowych zostały zaprojektowane w celu amplifikacji segmentu DNA w genie bakteryjnym kodującym gyrazę DNA B (7).
   2. Dla każdej reakcji qPCR połącz 100 μg DNA z każdej reakcji (10,5 μl) z 14,5 μl głównej mieszanki qPCR.
   3. Za pomocą urządzenia qPCR i protokołu termocyklingu wymienionego w tabeli 1 zmierzono amplifikację pod kątem oporności na ampicylinę i genów porządkowych dla wszystkich sześciu reakcji.
   4. Wartości Cq wygenerowane przez qPCR wykorzystano do obliczenia znormalizowanej skuteczności transdukcji genu oporności na ampicylinę (ryc. 3), potwierdzając pomyślną transdukcję genu oporności na ampicylinę.
      1. Wartość Cq lub wartość kwantyfikacji cyklu próbki jest najwcześniejszym numerem cyklu PCR, przy którym wykryto sygnał przekraczający próg tła. Niskie wartości Cq odpowiadają większej liczbie sekwencji docelowej i na odwrót.
      2. Znormalizowaną wydajność transdukcji genu w próbce można obliczyć przy użyciu tych wartości Cq, odejmując wartość genu porządkowego od wartości genu docelowego, generując wartość ΔCq, którą można wykorzystać do obliczenia znormalizowanej wydajności transdukcji przez 2^(-ΔCq).

	Temperatura	Czas
Denaturacja	94 °C	2 min
40 cykli:
Denaturacja	94 °C	15 sekund
Wyżarzanie, wydłużanie i fluorescencja odczytu	60 °C lub 5 °C poniżej najniższego startera Tm	1 min

Tabela 1: Protokół termocyklingu qPCR