Analiza ekspresji genów w morskich społecznościach mikroorganizmów z wykorzystaniem transkryptomiki środowiskowej

Procedura ta rozpoczyna się od pozyskania morskiej biomasy mikrobowej z próbek wody poprzez wstępną filtrację przez filtry o rozmiarze oczek 5 i 3 µm, a następnie gromadzenie na filtrze 0,22 µm. Następnie z organizmów zatrzymanych na filtrze 0,22 µm ekstrahuje się całkowite RNA. RNA ribosomal jest usuwany z całkowitego RNA poprzez selektywną degradację enzymatyczną i hybrydyzację subtrakcyjną, a wzbogacony Mr.N jest amplifikowany liniowo poprzez dodawanie ogona polyA i transkrypcję in vitro.

Następnie amplifikowane antysensowne RNA przekształca się w dwuniciowe cDNA przy użyciu losowych heksamerów. Otrzymane cDNA można klonować i sekwencjonować lub poddać bezpośredniej pirosekwencjonowaniu. Witajcie, jestem Rachel Persky z laboratorium dr Marianne Moran na Wydziale Nauk Morskich Uniwersytetu Georgijskiego.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę badania ekspresji genów w próbkach środowiskowych z wykorzystaniem metatranskryptomiki środowiskowej. Scott Gifford pokaże Państwu, jak przygotować próbki środowiskowe do izolacji RNA.

Pokażę Państwu, jak wyizolować RNA z próbek i sprawdzić ich wartości RIN. AON zademonstruje proces usuwania RNA. Następnie Maria Kosta omówi etapy amplifikacji RNA oraz syntezy cDNA.

Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć pobieranie RNA środowiskowego, konfigurujemy system linii filtracyjnej, umieszczając jeden koniec węża w wodzie na pożądanej głębokości poboru próbek, a przeciwny koniec przyczepiając do filtra 3 µm o dużej przepustowości, umieszczając pompę pomiędzy obiema końcami węża. Filtr 3 µm jest następnie podłączony do kolumny z filtrem 0,22 µm, a odpływ jest skierowany z kolumny 0,22 µm do naczynia pomiarowego.

Przepuść przez system kilka litrów wody w celu wypłukania. Po zakończeniu usuń rurkę z wody podczas pracy pompy, aby usunąć pozostałą wodę z przewodu. Następnie, używając pęsety, umieść filtr 0,22 µm na wieży filtracyjnej i zamknij ją.

Włożyć końcówkę przewodu z powrotem do wody i uruchomić pompę. Poczekać do czasu odpowietrzenia obu filtrów i monitorować objętość przefiltrowanej wody za pomocą pomiaru na kanistrze. Po przefiltrowaniu pożądanej objętości wyjąć przewód z wody i usunąć pozostałą w układzie wodę.

Gdy tylko filtr wyschnie, szybko zdejmij górną płytkę filtra i złóż papier filtracyjny. Umieść filtr w probówce typu whirl pack i zamroź go gwałtownie w ciekłym azocie. Przed rozpoczęciem eksperymentu należy pamiętać, że ze względu na powszechną obecność RNA oraz szybką degradację mRNA, należy przestrzegać standardowych środków ostrożności dotyczących pracy w środowisku wolnym od rybonukleaz, w tym w odniesieniu do powierzchni roboczych i pipet.

Biorąc to pod uwagę, podczas pracy z wszelkimi materiałami wykorzystywanymi w tej procedurze należy nosić czyste rękawiczki. Próbki powinny być przetwarzane w jak najkrótszym czasie. Aby rozpocząć ekstrakcję całkowitego RNA z filtra 0,22 µm, przygotowujemy probówki do homogenizacji kuleczkowej, dodając 8 mL buforu RLT z dodatkiem beta-merkaptoetanolu do probówki stożkowej o pojemności 50 mL.

Następnie dodaje się od jednego do dwóch mililitrów kulek do izolacji RNA z zestawu do ekstrakcji gleby mobile power soil extraction kit. Szybko wyjmuje się zamrożony filtr z zamrażarki, pozostawiając go w opakowaniu world pack, a następnie rozbija go młotkiem.

Przenieś rozdrobniony filtr do przygotowanej probówki stożkowej o pojemności 50 ml, a następnie uszczelnij pokrywkę probówki parafinią lub taśmą laboratoryjną i mieszaj w wstrząsarce typu vortex przez 10 minut. Następnie odwiruj probówkę o pojemności 50 ml przy 5 000 RPM przez jedną minutę. W temperaturze pokojowej odessij jak największą ilość lizatu i przenieś go do probówki o pojemności 15 ml, po czym ponownie odwiruj przez pięć minut.

Przy 5 000 ×g nadsącz przenosi się do nowej probówki o pojemności 50 ml, a do lizatu dodaje jedną objętość 100% etanolu. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml należy zaciągnąć lizat przez igłę o rozmiarze od 18 do 21 G i wypuścić go z powrotem około pięciu razy. W kolejnych etapach ekstrakcji należy zastosować zestaw KaiGen R and easy mini zgodnie z instrukcjami producenta, aplikując lizat na dostarczoną kolumnę za pomocą kolektora próżniowego lub poprzez wielokrotne wirowanie.

Ilościowo określ całkowitą zawartość RNA spektrofotometrycznie. Po wyznaczeniu wydajności całkowitego RNA, używamy zestawu Ambien turbo DNA free zgodnie z instrukcją producenta, aby usunąć ewentualne zanieczyszczenia DNA. Po zakończeniu ekstrakcji RNA przekazuję całkowite RNA Johannie, która przeprowadzi pierwszy i drugi etap usuwania rRNA.

Dziękuję, Rachel. Aby rozpocząć usuwanie rRNA, delikatnie wymieszaj i krótko odwiruj 10-krotny bufor reakcyjny przed użyciem. W sterylnej, wolnej od RNazy probówce o pojemności 0,5 ml połącz odpowiednie objętości 10-krotnego buforu reakcyjnego, inhibitora RNA, próbki całkowitego RNA oraz egzonukleazy terminator. Zgodnie z protokołem Epicentre, inkubuj reakcję w temperaturze 30 °C przez 60 minut w termocyklerze z grzaną pokrywą lub w kąpieli wodnej.

Następnie należy przerwać reakcję poprzez precypitację fenolowo-etanolową, najpierw dodając do mRNA wodę wolną od RNaz do uzyskania całkowitej objętości 200 µL, a następnie dodając jedną objętość roztworu fenol chloroform w stosunku 1:1 do probówki z mRNA i wirując ją w wirówce. Należy zebrać fazę wodną, a następnie przeprowadzić precypitację przy użyciu 100% etanolu i soli. Jest to potencjalny punkt przerwania pracy.

RNA można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu wykorzystania próbki w dalszych analizach. Po zakończeniu pierwszej etapu wzbogacania mRNA, użyjemy zestawów Ambien microbe enrich oraz microbe express zgodnie z instrukcją producenta, aby usunąć z próbki pozostałości rRNA. W celu ułatwienia usuwania eukariotycznego rRNA wykorzystamy zestaw microbe enrich.

Wszystkie objętości należy ustalić zgodnie z instrukcjami producenta. Na początek należy pipetować 300 µL buforu wiążącego do probówki o pojemności 1,5 ml. Dodać od 5 do 100 µg całkowitego RNA w maksymalnej objętości 30 µL i wymieszać na wortexie.

Delikatnie dodaj 2 µL mieszaniny oligonukleotydów przechwytujących dla 5 µg RNA do buforu wiążącego i lekko stuknij probówką. Krótko odwiruj mieszaninę. Denaturuj mieszaninę w temperaturze 70 °C przez 10 minut, a następnie inkubuj w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę.

Podczas inkubacji przygotować magnetyczne kulki z oligonukleotydami, przemywając je raz wodą wolną od nukleaz oraz raz buforem wiążącym, przy czym pomiędzy poszczególnymi etapami przemywania kulki należy unieruchomić na statywie magnetycznym. Kulki przechowywać w lodzie, a następnie ogrzać do temperatury pokojowej. Na pięć minut przed użyciem podgrzać roztwór piorący do 37 °C w bloku grzewczym.

Dodaj mieszaninę oligonukleotydów do wychwytu RNA do przemytych magnetycznych kulek z oligonukleotydami, delikatnie wymieszaj probówkę i odwiruj. Krótko inkubuj mieszaninę w temperaturze 37°C przez 15 minut. Umieść probówkę w statywie magnetycznym i odczekaj około trzech minut przed odessaniem nadnadłożu zawierającego mRNA, a następnie przenieś je do probówki zbiorczej w lodzie.

Następnie do uchwyconych kulek należy dodać 100 µL uprzednio ogrzanego roztworu płuczącego. Delikatnie wymieszać kuleczki w vorteksie i zebrać nadsącz. Przenieść ten nadsącz zawierający mRNA do probówki zbiorczej umieszczonej w lodzie.

Umieścić probówkę zbiorczą w lodzie podczas przygotowywań do usunięcia prokarjotycznego RRNA przy użyciu zestawu ambi microbe express, który posłuży do usunięcia resztkowego RRNA prokarjotycznego. Użyć analizatora Bioanalyzer lub Experion w celu sprawdzenia kontaminacji RRNA oraz jakości MR.NA. Jest to potencjalny punkt przerwania procedury.

RNA można przechowywać w temperaturze -80°C. Po usunięciu rRNA wykorzystamy zestaw Ambien message AMP two bacteria zgodnie z instrukcją producenta w celu amplifikacji mRNA. Skoro mamy już czystą próbkę mRNA, przekazuję eksperyment Marii, która przeprowadzi Państwa przez proces amplifikacji mRNA i syntezy cDNA.

Dziękuję, Hannah. Zanim rozpoczniemy amplifikację mRNA, oblicz objętości każdego składnika mieszanin master mix z zestawu Ambien message AMP two bacteria online. Następnie rozpoczynamy poliadenylację RNA matrycowego, umieszczając do 1000 nanogramów całkowitego RNA w sterylnej, wolnej od RNA probówce do wirówki. Użyj 6,5 mikrolitrów próbki i nie dodawaj wody wolnej od RNA do pierwszego buforu, aby zsyntetyzować RNA poprzez transkrypcję in vitro.

Zaleca się stosowanie pieca do hybrydyzacji lub inkubatora ze względu na jednolitość temperatury. Ponieważ niezwykle ważne jest, aby wewnątrz probówek nie tworzyła się kondensacja, zdecydowanie zalecamy 14-godzinną inkubację reakcji transkrypcji in vitro. Aby zmaksymalizować wydajność RNA i uzyskać najwyższą wydajność A RNA, należy przeprowadzić IBT w końcowej objętości reakcji 40 µL; A RNA należy przechowywać w temperaturze -80 °C w aliquotach o objętości około 10 µL.

Po amplifikacji RNA należy przystąpić do syntezy cDNA (komplementarnego DNA). Do syntezy cDNA z RNA wykorzystuje się zestaw Promega universal ribot Clone cDNA synthesis system. Zestaw zawiera instrukcje dotyczące konwersji 2 µg RNA na cDNA. Zalecamy użycie od 6 do 10 µg RNA i odpowiednie przeskalowanie reakcji.

Oczyść cDNA za pomocą wytrącania etanolem lub zestawu promega wizard DNA cleanup. Zgodnie z instrukcjami producenta, przechowuj próbki w temperaturze -80 °C. Dwuniciowe cDNA można w tym momencie poddać bezpośredniemu sekwencjonowaniu. Z 10 litrów wody morskiej wyekstrahowaliśmy około 10 µg środowiskowego RNA, które namnożyliśmy 20-krotnie. Poprzez konwersję namnożonego mRNA do dwuniciowego cDNA uzyskano ilości materiału wystarczające do sekwencjonowania i analizy transkryptów środowiskowych. Właśnie pokazaliśmy, jak oceniać ekspresję genów w morskich społecznościach mikrobiologicznych, wykorzystując środowiskową metatranskryptomikę.

Należy zawsze pamiętać, że podczas wykonywania tej procedury mRNA ulega szybkiej degradacji, a RNA występuje powszechnie w środowisku. Dlatego należy przestrzegać standardowych środków ostrożności obowiązujących w środowisku wolnym od rybonukleaz i przetwarzać próbki tak szybko, jak to możliwe. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.