Name: Analiza ekspresji genów w morskich społecznościach mikrobiologicznych przy użyciu transkryptomiki środowiskowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-02-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 51 s
Description: Poznaj metodę transkryptomiki środowiskowej do analizy ekspresji genów w morskich społecznościach mikrobiologicznych. Technika obejmuje izolację RNA, usuwanie rRNA, amplifikację mRNA i syntezę cDNA do sekwencjonowania.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Finansowanie zostało zapewnione z grantów fundacji The Gordon and Betty Moore Foundation oraz grantu National Science Foundation MCB-0702125.

<ol><li>Liang, P., Pardee, A. B. Science. 257 (5072), 967-967 (1992).</li>
<li>Belasco, J. G. Control of messenger RNA stability. Belasco, J. G., Brawerman, G. , Academic Press. San Diego. 3-11 (1993).</li>
<li>Poretsky, R. S., Bano, N., Buchan, A. 71 (7), 4121-4121 (2005).</li>
<li>Gelder, R. N. V., von Zastrow, M. E., Yool, A. Natl. Acad. Sci. USA. 87 (5), 1663-1663 (1990).</li>
<li>Margulies, M., Egholm, M., Altman, W. E. Nature. 437 (7057), 376-376 (2005).</li>
<li>Frias-Lopez, J., Shi, Y., Tyson, G. W. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (10), 3805-3805 (2008).</li>
<li>Poretsky, R. S., Hewson, I., Sun, S., Allen, A. E., Zehr, J. P., Moran, M. A. Environ Microbiol. 11 (6), 1358-1375 (2009).</li>
</ol>

Badanie ekspresji genów w naturalnych społecznościach mikroorganizmów stało się w ostatnich latach powszechne jako sposób na poznanie ról ekologicznych i funkcji mikroorganizmów. Analizy ekspresji genów, stosowane w połączeniu z detekcją, kwantyfikacją i charakterystyką mikroorganizmów morskich, mogą służyć do powiązania filogenezy z funkcją w naturalnych społecznościach mikrobowych. Wiele technik ukierunkowanych na ekspresję genów funkcjonalnych opiera się na specyficznych sondach lub zestawach starterów zaprojektowanyc...

<table><tbody><tr><td>Probówki z kuleczkami PowerSoil Bead Tubes</td><td>zestaw</td><td>MoBio</td><td>12866-25-PBT</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>zestaw</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNA-&lt;em&gt;free&lt;/em&gt;</td><td>zestaw</td><td>Ambion</td><td>AM1907</td><td></td></tr><tr><td>mRNA-ONLY Prokaryotic mRNA Isolation Kit</td><td>zestaw</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>MOP51010/MOP51024</td><td></td></tr><tr><td>MICROB&lt;em&gt;Express&lt;/em&gt; Bacterial mRNA Enrichment Kit</td><td>zestaw</td><td>Ambion</td><td>AM1905</td><td></td></tr><tr><td>MICROB&lt;em&gt;Enrich&lt;/em&gt; kit</td><td>zestaw</td><td>Ambion</td><td>AM1901</td><td></td></tr><tr><td>MessageAmp II-Bacteria RNA Amplification Kit</td><td>zestaw</td><td>Ambion</td><td>AM1790</td><td></td></tr><tr><td>Universal RiboClone cDNA Synthesis System</td><td>zestaw</td><td>Promega Corp.</td><td>C4360</td><td></td></tr><tr><td>Wizard DNA Clean-Up System</td><td>zestaw</td><td>Promega Corp.</td><td>A7280</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza ekspresji genów w morskich społecznościach drobnoustrojów z wykorzystaniem transkryptomiki środowiskowej

Analyzing Gene Expression from Marine Microbial Communities using Environmental Transcriptomics

Analogicznie do metagenomiki, transkryptomika środowiskowa (metatranskryptomika) pozwala na uzyskiwanie i sekwencjonowanie środowiskowych cząsteczek mRNA z asocjacji mikrobiologicznej bez wcześniejszej wiedzy o tym, które geny mogą być ekspresowane przez tę społeczność. Dzięki temu zapewnia najbardziej obiektywne spojrzenie na ekspresję genów w społecznościach mikroorganizmówin situ. Protokoły transkryptomiki środowiskowej są technicznie trudne, ponieważ mRNA prokariotyczne zazwyczaj nie posiadają ogonów poli(A), które ułatwiają izolację wiadomości eukariotycznych.1i z powodu stosunkowo krótkich okresów półtrwania mRNA2. Ponadto, mRNA występują w całkowitych ekstraktach RNA w znacznie mniejszej ilości niż rRNA, przez co sygnał pochodzący od rRNA często przytłacza sygnały mRNA. Jednakże, ostatnio opracowano techniki pozwalające pokonać niektóre z tych trudności. Opisano procedurę analizy transkryptomów środowiskowych polegającą na tworzeniu bibliotek klonowych z wykorzystaniem losowych starterów do odwrotnej transkrypcji i amplifikacji środowiskowych mRNA, która okazała się skuteczna w dwóch różnych środowiskach naturalnych, jednak wyniki były obciążone ze względu na wybór losowych starterów użytych do inicjacji syntezy cDNA3. Postępy w zakresie liniowej amplifikacji mRNA eliminują potrzebę stosowania losowych starterów w kroku amplifikacji i pozwalają na użycie mniejszej ilości materiału wyjściowego, skracając czas pobierania i przetwarzania próbek oraz minimalizując tym samym degradację RNA4.In vitrometody transkrypcji służące amplifikacji mRNA polegają na poliadenylowaniu mRNA oraz wprowadzaniu promotora T7 na koniec 3' transkryptu. Amplifikowany RNA (aRNA) może następnie zostać przekształcony w dwuniciowy kwas cDNA przy użyciu losowych heksamery i bezpośrednio sekwencjonowany metodą pirosekwencjonowania5. Pierwsze zastosowanie tej metody na Stanii ALOHA wykazało jej przydatność w charakteryzowaniu ekspresji genów w społecznościach mikrobiologicznych6.

Przedstawiamy metodę generowania cDNA z mRNA pochodzącego ze środowiska. W ujęciu ogólnym, najpierw pobiera się całkowity RNA ze środowiska, selektywnie usuwa rRNA, selektywnie amplifikuje mRNA, a następnie sekwencjonuje cDNA zsyntetyzowane z wzbogaconej puli mRNA. Odzyskane sekwencje można poddać adnotacji przy użyciu standardowych technik bioinformatycznych w celu identyfikacji ekspresyjnych genów.

Analiza ekspresji genów w morskich społecznościach drobnoustrojów z wykorzystaniem transkryptomiki środowiskowej

Podobnie jak metagenomika, środowiskowa transkryptomika (metatranskryptomika) polega na wyizolowaniu i zsekwencjonowaniu środowiskowych cząsteczek mRNA z zespołu mikroorganizmów...

Procedura ta rozpoczyna się od pozyskania morskiej biomasy mikrobiologicznej z próbek wody poprzez wstępną filtrację przez filtry o rozmiarze pięciu i trzech mikrometrów, a następnie zbieranie na filtrze 0,22 mikrometra. Następnie z organizmów zatrzymanych na filtrze 0,22 mikrometra ekstrahuje się całkowite RNA. RNA rybosomalne jest usuwane z całkowitego RNA poprzez selektywną degradację enzymatyczną i hybrydyzację subtrakcyjną, a wzbogacony Mr.N jest amplyfikowany liniowo za pomocą dodawania ogona polyA i transkrypcji in vitro.Wzmocniony antysensowny RNA jest następnie konwertowany w dwuniciowe cDNA przy użyciu losowych heksamerów. Otrzymane cDNA może zostać sklonowane i zsekwencjonowane lub poddane bezpośredniemu pirosekwencjonowaniu. Cześć, jestem Rachel Persky z laboratorium dr Marianne Moran z Katedry Nauk Morskich Uniwersytetu Georgijskiego.Dzisiaj przedstawimy procedurę analizy ekspresji genów w próbkach środowiskowych z wykorzystaniem środowiskowej metatranskryptomiki. Scott Gifford pokaże, jak przygotować próbki środowiskowe do izolacji RNA.Pokażę Państwu, jak wyizolować RNA z próbek i wyznaczyć wartości RIN. AON zaprezentuje proces usuwania RNA. Następnie Maria Kosta omów

analyzing-gene-expression-from-marine-microbial-communities-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza ekspresji genów z morskich społeczności mikroorganizmów z wykorzystaniem ekologicznej transkryptomiki

Analiza ekspresji genów bakteryjnych z wykorzystaniem mikromacierzy

Opisano konstrukcję biblioteki fosmidów z genomowego DNA środowiskowego, wyizolowanego z pionowego kontinuum głębokości sezonowo hipoksycznego fiordu. Powstała biblioteka klonów zostaje przeniesiona do płytek 384-dołkowych i zarchiwizowana w celu późniejszego sekwencjonowania oraz przesiewania funkcjonalnego przy użyciu zautomatyzowanego systemu wybierania kolonii.

Tworzenie środowiskowej biblioteki genomicznej z dużymi insertami

Przedstawiono metodę ekstrakcji metabolitów z planktonicznych społeczności drobnoustrojów. Pobieranie próbek całej społeczności realizowane jest poprzez filtrację na specjalnie przygotowanych filtrach. Po liofilizacji ekstrahowane są metabolity rozpuszczalne w wodzie. Podejście to umożliwia zastosowanie metabolomiki środowiskowej w badaniach trans-omicznych naturalnych lub eksperymentalnych społeczności drobnoustrojów.

Koncentracja metabolitów z planktonicznych zbiorowisk o niskiej gęstości do metabolomiki środowiskowej z wykorzystaniem spektroskopii magnetycznego rezonansu jądrowego

Scharakteryzowanie społeczności mikrobiologicznej było od dawna celem w mikrobiologii środowiskowej. Metody sekwencjonowania nowej generacji pozwalają obecnie na scharakteryzowanie społeczności drobnoustrojów na niespotykanej dotąd głębokości przy minimalnych kosztach i nakładzie pracy. Szczegółowo opisujemy tutaj nasze podejście do sekwencjonowania bakteryjnych genów rybosomalnego RNA 16S za pomocą sekwenatora laboratoryjnego.

Sekwencjonowanie nowej generacji amplikonów genu rybosomalnego RNA 16S

Tutaj prezentujemy kompleksowy protokół do oceny dostępności organicznych i nieorganicznych składników odżywczych oraz obfitości i struktury społeczności mikroorganizmów i wirusów w odległych środowiskach morskich.

Odkrywanie niewidzialnych graczy w oceanie - przewodnik terenowy po chemii wody i mikrobiologii morskiej

Ten manuskrypt opisuje użycie najnowocześniejszej technologii dostarczanej przez mikromacierze DNA. Mikromacierze zapewniają przegląd zmian transkryptomicznych u bakterii powstałych w określonych warunkach. Ponadto podkreślamy łatwość, z jaką można analizować duże ilości danych za pomocą wygodnych, opracowanych przez nas pakietów oprogramowania.

Szybki i niezawodny proces analizy transkryptomu bakteryjnego Studium przypadku: Zależna od seryny regulacja genów w Streptococcus pneumoniae

Ten protokół służy do ekstrakcji i koncentracji białka i DNA z biomasy mikrobiologicznej zebranej z wody morskiej, a następnie do generowania peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy proteomicznej opartej na tandemowej spektrometrii mas.

Przebieg metaproteomiki mikrobiologicznej organizmów wodnych: od komórek do peptydów tryptycznych odpowiednich do analizy opartej na tandemowej spektrometrii mas

Opracowaliśmy protokół, który jest szybki, czuły i powtarzalny do profilowania ekspresji genów patogenów podczas infekcji.

Profilowanie ekspresji genów zakażonych drobnoustrojów za pomocą cyfrowej platformy kodów kreskowych

Dostępny jest protokół do ilościowego oznaczania genów bakteryjnych 16S rRNA i transkryptów z osadów przybrzeżnych za pomocą PCR w czasie rzeczywistym. Metodologia obejmuje jednoczesną ekstrakcję DNA i RNA; przygotowanie RNA wolnego od DNA; oraz kwantyfikacja genu 16S rRNA i transkryptu za pomocą RT-q-PCR, w tym konstrukcja krzywej standardowej.

Jednoczesna ekstrakcja DNA-RNA z osadów przybrzeżnych i kwantyfikacja genów i transkryptów 16S rRNA metodą Real-time PCR

Tutaj prezentujemy protokół do zbadania wpływu szczelinowania hydraulicznego na pobliskie strumienie, analizując ich wodne i osadowe zbiorowiska mikroorganizmów.

Ocena wpływu szczelinowania hydraulicznego na strumienie przy użyciu mikrobiologicznych sygnatur molekularnych

Protokół wykrywa kluczowe geny obiegu metanu na mokradłach przybrzeżnych południowego Teksasu i wizualizuje ich rozmieszczenie przestrzenne, aby lepiej zrozumieć regulację metanu i jego wpływ na środowisko w tych dynamicznych ekosystemach.

Wizualizacja dynamiki mikroorganizmów obiegu metanu na przybrzeżnych terenach podmokłych

Poznaj metodę transkryptomiki środowiskowej do analizy ekspresji genów w morskich społecznościach mikrobiologicznych. Technika obejmuje izolację RNA, usuwanie rRNA, amplifikację mRNA i syntezę cDNA do sekwencjonowania.

Analiza ekspresji genów w morskich społecznościach drobnoustrojów z wykorzystaniem transkryptomiki środowiskowej

Przeglądaj więcej filmów