Analiza ekspresji genów w morskich społecznościach mikrobiologicznych przy użyciu transkryptomiki środowiskowej

Procedura ta rozpoczyna się od pozyskania morskiej biomasy mikrobiologicznej z próbek wody poprzez wstępną filtrację przez pięć i trzy filtry mikrometryczne, a następnie zebranie na filtrze 0,22 mikrometra. Całkowite RNA jest następnie ekstrahowane z organizmów zatrzymanych na filtrze 0,22 mikrometra. Nasz RNA jest usuwany z całkowitego RNA przez selektywną degradację enzymatyczną i subtraktywną hybrydyzację wzbogaconą Mr.N jest amplifikowany liniowo poprzez ogon poliA i transkrypcję in vitro.

Amplifikowany antysensowny RNA jest następnie przekształcany w dwuniciowy CD NA za pomocą losowego heksameru. Powstała płyta CD NA może być sklonowana i zsekwencjonowana lub bezpośrednio zsekwencjonowana pirotechniką. Cześć, nazywam się Rachel Persky i pracuję w laboratorium dr Marianne Moran na Wydziale Nauk o Morzu Uniwersytetu Georgia.

Dzisiaj pokażemy Ci procedurę badania ekspresji genów w próbkach środowiskowych. Korzystanie z metatranskryptomiki środowiskowej. Scott Gifford pokaże Ci, jak przetwarzać próbki środowiskowe do zbierania RNA.

Pokażę ci, jak wyekstrahować RNA z próbek i Johanna RINs. AON zademonstruje usuwanie RNA. Następnie Maria Kosta przejdzie przez etapy amplifikacji RNA i syntezy CD NA.

Więc zacznijmy. Aby rozpocząć zbieranie środowiskowego RNA, ustawiamy system linii filtrującej, umieszczając jeden koniec rurki w wodzie na żądanej głębokości w celu pobrania próbki, a drugi koniec podłączamy do filtra o dużej objętości o dużej objętości i trzech mikrometrów, umieszczając pompę między dwoma końcami rurki. Filtr trzymikrometryczny jest następnie podłączany do wieży filtracyjnej o średnicy 0,22 mikrometra, a odpływ jest kierowany z wieży o średnicy 0,22 mikrometra do ładunku z podziałką.

Przepuść kilka litrów wody przez system, aby spłukać. Po zakończeniu wyjmij rurkę z wody podczas pracy pompy, aby usunąć pozostałą wodę z linii. Następnie za pomocą kleszczy umieść filtr 0,22 mikrometra na wieży filtra i zamknij go.

Umieść koniec żyłki z powrotem w wodzie i włącz pompę. Pozwól, aby powietrze zostało usunięte z obu filtrów i monitoruj objętość wody przefiltrowanej za pomocą na gąsie. Po przefiltrowaniu żądanej objętości wyjmij przewód z wody i usuń pozostałą wodę z systemu.

Jak tylko filtr wyschnie, szybko zdejmij górną płytę filtracyjną i złóż bibułę filtracyjną. Umieść filtr w opakowaniu wirowym i zamroź błyskawicznie w ciekłym azocie. Zanim rozpoczniemy eksperyment, należy zauważyć, że ponieważ RNA są wszechobecne, a mRNA szybko ulegają degradacji, należy przestrzegać standardowych środków ostrożności podczas pracy w środowisku wolnym od rybonukleazy, w tym powierzchni roboczych i pipet.

Mając to na uwadze, podczas obchodzenia się z jakimikolwiek materiałami używanymi w tej procedurze należy nosić czyste rękawice. A próbki powinny być przetwarzane w jak najkrótszym czasie. Aby rozpocząć całkowitą ekstrakcję RNA z filtra 0,22 mikrometra, przygotowujemy probówki z kulkami, dodając osiem mililitrów buforu RLT z dodatkiem beta meto etanolu do 50-mililitrowej stożkowej probówki.

Następnie dodaje się od jednego do dwóch mililitrów kulek RNA z mobilnego zestawu do ekstrakcji gleby. Szybko wyjmij zamrożony filtr z zamrażarki i trzymaj go w opakowaniu świata. Rozbij go młotkiem.

Dodaj rozbity filtr do przygotowanej 50-mililitrowej stożkowej probówki i uszczelnij pokrywkę probówki wirem perfum lub taśmy laboratoryjnej na 10 minut. Następnie odwirować probówkę o pojemności 50 mililitrów przy 5 000 obr./min przez jedną minutę. W temperaturze pokojowej usuń jak najwięcej lizatu i przenieś go do 15-mililitrowej probówki przed ponownym odwirowaniem przez pięć minut.

Przy 5 000 razy G supernatant jest następnie przenoszony do nowej 50-mililitrowej probówki, a do lizatu dodaje się jedną objętość 100% etanolu. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 mililitrów przeciągnij lizat przez igłę o rozmiarze od 18 do 21 i przepuść go z powrotem około pięć razy. Kolejne etapy ekstrakcji należy użyć KaiGen R i easy mini kit zgodnie z instrukcjami producenta, nakładając lizat do dostarczonej kolumny za pomocą kolektora próżniowego lub wielokrotnego wirowania.

Określić ilościowo całkowite spektro RNA fotometrycznie. Po określeniu całkowitej wydajności RNA, zgodnie z instrukcją producenta używamy zestawu Ambien turbo DNA free w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń DNA. Teraz, gdy ekstrakcja RNA została zakończona, zamierzam przekazać całkowite RNA Johannie, która wykona pierwszy i drugi etap usuwania RRNA.

Dzięki, Rachel. Aby rozpocząć usuwanie RRNA, delikatnie wymieszaj i krótko odwiruj mRNA tylko 10 razy bufor reakcyjny przed użyciem w sterylnej probówce o pojemności 0,5 mililitra wolnej od RNA, połącz odpowiednie objętości 10-krotnego inhibitora RNA buforu reakcyjnego, całkowitej próbki RNA i egzonukleazy terminatora. Zgodnie z protokołem epicentrum inkubuj reakcję w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 60 minut w termocyklerze z podgrzewaną pokrywką lub łaźnią wodną.

Następnie zakończ reakcję wytrącaniem fenolu i etanolu Najpierw dodając wodę wolną od RNA do całkowitej objętości 200 mikrolitrów, a następnie dodając jedną objętość roztworu chloroformu fenolowego jeden do jednego do jednego do wirówki mRNA. Zbierz fazę wodną, a następnie wytrącić stuprocentowym etanolem i zaatakować. Jest to potencjalny punkt zatrzymania.

RNA może być przechowywane w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza, dopóki nie będzie się gotowym do użycia próbki w dalszych zastosowaniach. Po zakończeniu pierwszego wzbogacania mRNA użyjemy zestawów do wzbogacania i ekspresji drobnoustrojów Ambien zgodnie z instrukcjami producenta, aby usunąć wszelkie resztki RRNA z naszej próbki. Aby ułatwić usunięcie eukariotycznego RRNA, użyjemy zestawu wzbogacającego drobnoustroje.

Wszystkie objętości są określane na podstawie instrukcji producenta. Aby rozpocząć pipetowanie, 300 mikrolitrów buforu wiążącego w probówce o pojemności 1,5 mililitra. Dodaj od pięciu do 100 mikrogramów całkowitego RNA w maksymalnej objętości 30 mikrolitrów i wiruj.

Delikatnie dodaj dwa mikrolitry mieszanki oligonugoligogramów wychwytujących na pięć mikrogramów RNA w buforze wiążącym i delikatnie postukaj w probówkę. Krótko odkręć mieszaninę. Denaturuj mieszaninę w temperaturze 70 stopni Celsjusza przez 10 minut, a następnie klęcz w temperaturze 37 stopni Celsjusza na godzinę.

Podczas tej inkubacji przygotuj kulki oligo mag, myjąc je raz w wodzie wolnej od nukleaz, a raz w buforze wiążącym i wychwytując kulki na stojaku magnetycznym między płukaniami. Przechowuj koraliki na lodzie i podgrzej je do temperatury pokojowej. Pięć minut przed użyciem podgrzej roztwór myjący do 37 stopni Celsjusza w bloku grzewczym.

Dodaj mieszankę oligonów wychwytujących RNA do umytych kulek oligo mag, delikatnie zakop rurkę i odwiruj. Krótko inkubuj mieszankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut. Umieść probówkę w stojaku magnetycznym i odczekaj około trzech minut przed zasysaniem mRNA zawierającego supernatant, a następnie przeniesieniem go do probówki zbiorczej na lodzie.

Następnie dodaj 100 mikrolitrów wstępnie podgrzanego roztworu myjącego do przechwyconych kulek. I delikatnie wiruj chwytaj koraliki i odzyskuj supernatanta głupca. Ten supernatant z Mr.NA się w probówce zbiorczej na lodzie.

Umieść probówkę zbiorczą na lodzie, przygotowując się do usunięcia prokariotycznego RRNA za pomocą zestawu ambi microbe express, którego użyjemy do usunięcia resztkowego prokariotycznego RRNA. Użyj bioanalizatora lub Experion, aby sprawdzić, czy nie ma zanieczyszczenia RRNA i MR. Jakość NA. Jest to potencjalny punkt zatrzymania.

RNA może być przechowywane w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Po usunięciu RRNA użyjemy zestawu Ambien message AMP two bacteria kit zgodnie z instrukcjami producenta, aby amplifikować nasze mRNA. Teraz, gdy mamy już czystą próbkę mRNA, przekażę eksperyment Marii, która przeprowadzi Was przez proces amplifikacji mRNA i syntezy CDNA.

Dziękuję, Hannah. Zanim rozpoczniemy amplifikację mRNA, oblicz objętości każdego składnika wiadomości Ambien AMP dwóch mieszanek głównych zestawu bakterii online, rozpoczynamy poliadenylację matrycy RNA, umieszczając do 1000 nanogramów całkowitego RNA w sterylnej probówce micro fuge wolnej od RNA. Użyj 6,5 mikrolitra próbki i bez wody wolnej od RNA w pierwszym buforze, aby zsyntetyzować RNA poprzez transkrypcję in vitro.

Zaleca się stosowanie pieca do hybrydyzacji lub inkubatora ze względu na ich jednolitą temperaturę. A ponieważ niezwykle ważne jest, aby w probówkach nie tworzyła się kondensacja, zdecydowanie zalecamy 14-godzinną inkubację reakcji transkrypcji in vitro. Aby zmaksymalizować wydajność RNA w celu uzyskania najwyższej wydajności RNA, należy przeprowadzić IBT w końcowej objętości reakcji o objętości 40 mikrolitrów, przechowywać RNA w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza w kwatach około 10 mikrolitrów.

Po amplifikacji RNA nadszedł czas na syntezę komplementarnego lub CDNA. Uniwersalny klon ribota Promega. Zestaw systemu syntezy CDNA służy do syntezy CD NA z a NA. Zestaw zawiera instrukcje dotyczące konwersji dwóch mikrogramów, NA na CD NA. Zalecamy wprowadzenie od sześciu do 10 mikrogramów NA i odpowiednie skalowanie reakcji.

Wyczyść płytę CD NA za pomocą wytrącania etanolu lub systemu oczyszczania DNA promega wizard. Zgodnie z instrukcjami producenta, przechowuj próbki w temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza dwuniciowe CDNA można w tym momencie bezpośrednio zsekwencjonować z 10 litrów wody morskiej, wyekstrahowaliśmy około 10 mikrogramów środowiskowego RNA i amplifikowaliśmy 20-krotnie poprzez konwersję amplifikowanego MR. NA do dwuniciowych CDNA wygenerowano wystarczające ilości materiału do sekwencjonowania i analizy transkryptów środowiskowych. Właśnie pokazaliśmy, jak ocenić ekspresję genów w zbiorowiskach drobnoustrojów morskich za pomocą metatranskryptomiki środowiskowej.

Zawsze pamiętaj, że podczas wykonywania tej procedury mRNA ulega szybkiej degradacji, a RNA są wszechobecne. Dlatego należy podjąć standardowe środki ostrożności podczas pracy w środowisku wolnym od jądra żebrowego i przetwarzać próbki tak szybko, jak to możliwe. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.