Śledzenie lokomocji w wysokiej rozdzielczości u dorosłych Drosophila melanogaster
February 20th, 2009
Badanie złożonych zachowań lokomotorycznych u Drosophila melanogaster zależy od zdolności do ilościowego określenia zmian w ruchu danej muchy. W tym artykule pokazano, jak to zrobić za pomocą systemu śledzenia w wysokiej rozdzielczości.
W teście śledzenia wideo muchy muszą zostać załadowane do kwadratowej komory obserwacyjnej bez użycia znieczulenia. Aby to zrobić, mały lejek musi być wyrównany z otworami na w komorze, aby wbić muchy do komory. Za pomocą tego lejka uszczelniają następnie otwory komory, a impuls powietrza jest podawany przez otwory wentylacyjne w celu zainicjowania lokomocji.
Kamera wideo zawieszona ponad komorą, rejestruje tą lokomocję i wysyła ją do komputera, gdzie śledzone są i analizowane ścieżki much. Cześć, nazywam się Justin Slawson i pracuję w Griffith Lab na Wydziale Biologii Uniwersytetu Brandeis. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę śledzenia lokomocji w wysokiej rozdzielczości.
Zamierzamy użyć tej procedury w naszym laboratorium do badania zachowania lokomotywy u dorosłych muszek. Więc zacznijmy. Aby rozpocząć eksperyment, hoduj muchy i butelki zawierające standardowe pożywki bez drożdży.
Ten protokół wymaga dużej liczby much, więc krzyżówki muszą być odpowiednio ustawione. Muchy powinny być hodowane w 12-godzinnym cyklu jasnej ciemności w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Zbierz muchy od jednego do trzech dni po Aus, użyj dyfuzora dwutlenku węgla, aby posortować muchy do probówek zawierających pożywkę wolną od drożdży, sortuj 10 samców na probówkę.
Odczekaj co najmniej dzień lub dwa po użyciu dwutlenku węgla przed uruchomieniem eksperymentów behawioralnych. Po zebraniu i posortowaniu much można je uruchomić w systemie śledzenia wideo. Eksperymenty ze śledzeniem wideo są wykonywane w pomieszczeniu, w którym utrzymuje się stałą temperaturę 25 stopni Celsjusza przy wilgotności 70%.
Aby nagrać muchy w ruchu, musisz zawiesić cyfrową kamerę wideo nad obszarem, który ma być nagrywany. Gdy kamera jest skierowana w dół, zawieszamy kamerę nad lightboxem, ponieważ nasze oprogramowanie śledzące jest oparte na kontraście. Następnie za pomocą przeciwpożarowego podłącz kamerę do komputera.
Używamy oprogramowania, Windows Movie Maker, aby nagrać wideo bezpośrednio na komputer. Ponieważ impulsy powietrza będą podawane w tym protokole, w pomieszczeniu musi znajdować się źródło przepływu powietrza. Gumowa rurka łączy źródło powietrza z filtrem węglowym w celu filtracji powietrza.
Gumowa rurka łączy również drugą stronę filtra węglowego z kolbą Erlenmeyera za pomocą wydrążonego gumowego korka. Kolbę należy napełnić około pół cala wody, która nawilży powietrze. Kolba powinna mieć również małą broń boczną, która powinna być podłączona do zaworu w kształcie litery Ys za pomocą większej ilości gumowych rurek.
Jedna gałąź zaworu Y łączy się z przepływomierzem, podczas gdy druga gałąź łączy się z kwadratową komorą lokomocji. Ta kwadratowa komora lokomocyjna oparta jest na projekcie z Wolf Etal 2002 z dodatkiem małych tacek zrzutowych, aby zapobiec lataniu much w komorze przed podłączeniem komory do systemu śledzenia, pamiętaj, aby użyć 70% etanolu do sterylizacji wszystkich elementów komory. Przed użyciem pozwól komponentom na jazdę.
Teraz, gdy system śledzenia jest gotowy, możemy dostarczyć muchy do komory lokomocyjnej, aby dostarczyć muchy do komory. Wykręć, które normalnie utrzymują małą górną część komory z pleksiglasu. Następnie ustaw górną część pleksi tak, aby otwór na znajdował się bezpośrednio nad komorą wewnętrzną.
Znieczulenie much bezpośrednio przed przeprowadzeniem. Test behawioralny może potencjalnie pogorszyć wydajność. Aby uniknąć znieczulenia, użyj lejka z małym wylotem, aby delikatnie wbić muchy do komory.
Aby zrobić lejek z małym wylotem, przymocuj niebieską końcówkę pipety P 1000 do końca lejka. Użyj nożyczek, aby odciąć sam koniec końcówki pipety, aby otwór był wystarczająco duży, aby mucha mogła przez niego przejść. Następnie weź probówkę zawierającą muchy i umieść ją do góry nogami nad lejkiem.
Następnie umieść koniec lejka w otworze na. Nie przesuwaj lejka, ponieważ może to zranić lub uszkodzić muchy. Zamiast tego delikatnie uderzaj w cały lejek komory i wszystko, aż wszystkie muchy znajdą się w komorze.
Użyj podkładki pod mysz, aby zamortyzować wstrząsy spowodowane tym uderzeniem. Gdy muchy są w środku, wyjmij lejek i umieść górną część pleksiglasu na łożach, a następnie wsuń górną część pleksiglasu na miejsce. Po prawidłowym załadowaniu much umieść komorę na wierzchu kasetonu.
Wyłącz inne światła w pomieszczeniu środowiskowym i pozwól muchom zaaklimatyzować się w komorze przez 30 minut. Po 30-minutowym okresie aklimatyzacji przystąp do testu lokomotorycznego, aby rozpocząć test. Przełącz zawór Y w układzie przepływu powietrza tak, aby powietrze przepływało tylko do przepływomierza, włącz powietrze i zwiększ powietrze do żądanej prędkości.
Będzie działać każda prędkość w zakresie od czterech do sześciu litrów na minutę. Zwykle zużywamy od pięciu do pięciu i pół litra na minutę. Po osiągnięciu żądanej prędkości powietrza należy przełączyć zawór Y tak, aby powietrze przepływało do komory lokomocyjnej.
Zmierz czas tego impulsu powietrza przez 15 sekund, a następnie nagle wyłącz powietrze, gdy wyłączasz powietrze. Przełącz aparat w tryb nagrywania. Ten krok wymaga praktyki, aby wykonać wszystko na raz.
Rejestrujemy 32. badania z szybkością 10 klatek na sekundę i co najmniej osiem prób na genotyp. Zatrzymaj nagrywanie po zakończeniu okresu próbnego i upewnij się, że film został zapisany po zakończeniu prób. Możemy przystąpić do analizy wideo, aby wykonać śledzenie ruchu filmów z testów ruchu ruchu.
W celu korzystania z tego oprogramowania korzystamy z systemu dynamicznej analizy obrazu. Konwertuj filmy do formatu pliku A VI za pomocą QuickTime 7.5 0.5. Następnie użyj funkcji automatycznego śledzenia według progu, aby śledzić muchy na podstawie kontrastu, a następnie utwórz ścieżkę od funkcji śledzenia do digitalizacji.
Ślady te następnie stosują funkcję parametrów obliczeniowych w celu wyprowadzenia chwilowych prędkości każdego lotu do pliku bazy danych. Funkcja ta pozwala również na wygładzanie danych. Używamy okna wygładzającego 5 15 60 15 5.
Gdy te informacje zostaną wyprowadzone jako plik bazy danych, otwieramy i zapisujemy pliki w programie Microsoft Excel. Pliki Excel są przetwarzane za pomocą skryptu MATLAB w celu zestawienia prędkości chwilowych i obliczenia dodatkowych parametrów niezbędnych do zrozumienia dynamiki ruchu. I struktura walki.
Oto reprezentatywny wynik tego testu. Rysunek po lewej stronie pokazuje ślady dzikich organizmów Kantona, podczas gdy rysunek po prawej pokazuje muchy zerowe dla genu dask, które zostały wygenerowane przez skrzyżowanie dwóch dużych nakładających się na siebie delecji. Jak widać w naszym paradygmacie, muchy zerowe Dask wykazują znacznie zmniejszoną lokomocję w porównaniu z Canton S, co zostało już opisane w literaturze przy użyciu innego rodzaju testu lokomotorycznego.
Właśnie pokazaliśmy, jak skonfigurować i uruchomić test śledzenia wideo lokomotywy. Wykonując tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać, aby wykonywać testy w tym samym dwu- lub trzygodzinnym oknie czasowym każdego dnia, aby uniknąć problemów z rytmem okołodobowym i zawsze najpierw uruchamiać organizmy typu dzikiego, aby upewnić się, że reakcje behawioralne mieszczą się w normalnym zakresie w danym dniu. Więc to wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł demonstruje metodę ilościowego określania zachowania lokomocyjnego u Drosophila melanogaster za pomocą systemu śledzenia wideo o wysokiej rozdzielczości. Procedura pozwala na szczegółową analizę ruchu muchy bez stosowania znieczulenia.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Analiza zachowania
- Technologia śledzenia wideo
Tło
- Drosophila melanogaster jest organizmem modelowym do badania lokomocji.
- Ilościowe określenie ruchu jest istotne dla zrozumienia złożonych zachowań.
- Systemy śledzenia o wysokiej rozdzielczości poprawiają dokładność analizy ruchu.
- To badanie dostarcza protokołu dla badaczy w tej dziedzinie.
Cel badania
- Demonstracja metody śledzenia lokomocji muchy.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu dla badaczy.
- Ułatwienie badania złożonych zachowań lokomocyjnych u Drosophila.
Stosowane metody
- Muchy są umieszczane w kwadratowej komorze obserwacyjnej bez znieczulenia.
- Lejki służą do wprowadzenie much do komory.
- Śruby uszczelniają otwory komory, a pulsy powietrza inicjują ruch.
- Kamera wideo rejestruje ruch do analizy.
Główne wyniki
- System śledzenia skutecznie rejestruje ruch muchy.
- Ścieżki ruchu są śledzone i analizowane przez komputer.
- Metoda pozwala na ilościowe określenie zachowania lokomocyjnego.
- Wyniki mogą być wykorzystane do badania różnych aspektów zachowania u much.
Wnioski
- System śledzenia o wysokiej rozdzielczości jest skuteczny w badaniu lokomocji Drosophila.
- Ta metoda może ulepszyć badania w dziedzinie neuronauki behawioralnej.
- Dalsze zastosowania mogą obejmować badanie wpływu modyfikacji genetycznych na ruch.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Quantifying locomotor behavior in model organisms enables mechanistic de-risking of neuropharmacological targets by linking genetic perturbations to functional phenotypes. This high-resolution video tracking approach supports target validation through reproducible, quantitative phenotyping in Drosophila, a genetically tractable system for early discovery. The method enhances predictive confidence in lead identification by providing real-time, anesthesia-free behavioral readouts that reflect neuronal circuit function.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring locomotor output as a functional readout of neuronal activity.
- Operational Value: Supports biological de-risking through anesthesia-free, real-time quantification of movement parameters such as speed, acceleration, and bout structure.
- Strategic Value: Facilitates phenotypic screening of genetic models to clarify pathway involvement and prioritize targets with strong behavioral correlates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, contrast-based video tracking with 10 msec temporal resolution for high-content locomotor phenotyping.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility via controlled environmental conditions (25°C, 70% humidity) and standardized air pulse initiation.
- Strategic Value: Generates quantitative outputs (average speed, max speed, time in motion) suitable for automated analysis and cross-genotype comparison.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights by linking locomotor deficits to genetic modifications, such as Dask null phenotypes.
- Operational Value: Enables continuity from discovery through preclinical validation using consistent behavioral endpoints across studies.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by offering mechanistically interpretable, quantifiable behavioral data.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by transforming genetic or pharmacological manipulations into quantifiable locomotor phenotypes, supporting hypothesis testing and lead optimization.
- Discovery Biology: Enables pathway clarification and target validation by correlating genetic lesions with changes in locomotor dynamics.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized chamber setup, air pulse delivery, and contrast-based tracking software.
- Analytics: Outputs instantaneous speed, acceleration, and bout structure data for statistical comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by providing a scalable, reproducible phenotyping platform for neurobehavioral assessment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable capability for screening genetic models, pharmacological compounds, or environmental stressors in Drosophila-based discovery pipelines.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in behavioral phenotypes through high-resolution, real-time tracking.
- Operational Value: Enhances standardization and reproducibility via controlled environmental parameters and automated trajectory analysis.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by supplying objective, quantitative locomotor data that reduces reliance on subjective scoring.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on behavioral effect size and reproducibility across genetic backgrounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, behavioral assay design, and video-based motion tracking software.
- Dependent on imaging infrastructure including a contrast-sensitive camera, light box, and airflow delivery system for pulse initiation.
- Necessitates cross-team standardization of environmental controls (temperature, humidity, light cycle) and acclimation protocols.
- Involves adaptation considerations when extending to different chamber sizes, fly densities, or genetic backgrounds affecting motility.
- Limited by the need for manual fly loading via funnel and air pulse timing, which requires operator training for consistency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:44
Introduction
1:06
Feeding and management of flies
1:54
Setting up the tracking system in a controlled environment
3:46
Delivering flies to the locomotion chamber
5:25
Running the Locomotor Assay
6:29
Analysis of Videos
7:57
Representative Results
8:35
Conclusion
