Mikroiniekcja mRNA i oligonukleotydów antysensownych morfolino w zarodkach danio pręgowanego.

Procedura ta rozpoczyna się od przygotowania morfo i transkrybowanego in vitro mRNA czapu. Mikropipeta jest napełniana przez zasysanie roztworu zawierającego morfo, a następnie objętość wstrzyknięcia jest kalibrowana za pomocą mikrometru na jedną komórkę. Zarodki danio pręgowanego są następnie pobierane i umieszczane w komorze do mikroiniekcji w celu mikroiniekcji żółtka.

Roztwór roboczy wstrzykuje się do żółtka tuż pod komórką, a ruchy cytoplazmatyczne są wykorzystywane do przenoszenia roztworu do mikroiniekcji komórek. Po wstrzyknięciach wstrzyknąć roztwór do cytoplazmy komórki. Inkubować zarodki w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza w trzech pożywkach E i oceniać pod kątem fenotypów będących przedmiotem zainteresowania na kolejnych etapach.

Cześć, jestem Shiloh Yuen z laboratorium, syn dr Sashy i pracuję na Wydziale Genetyki w Yale University School of Medicine. Dzisiaj zademonstrujemy solidną technikę mikroiniekcji do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA i knockdownem genów morpho oligonukleotydów u danio pręgowanego. Wykorzystujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania roli rzęski S w torbielowatych chorobach nerek.

Więc zacznijmy. Jednym z potężnych podejść do badań nad funkcją genów jest mikroiniekcja in vitro transkrybowanego RNA z czapeczką w zarodki danio pręgowanego. W tej demonstracji dokonamy mikroiniekcji transkryptu oznaczonego EGFP i użyjemy żywej ekspresji GFP z całego zarodka jako widocznego odczytu dla udanego wstrzyknięcia.

Najpierw przeprowadzimy reakcję transkrypcji RNA kap in vitro na interesującym Cię transkryptze. W naszym laboratorium rutynowo wprowadzamy A-C-D-N-A do wektora PC dwa plus i przeprowadzamy reakcję syntezy in vitro dużych ilości ograniczonego RNA przy użyciu zestawu M message M machine SP six. Następnie oczyścimy próbkę RNA, przepuszczając ją przez zestaw RN easy mini lub przez ekstrakcję chloroformu fenolowego i wytrącanie izopropanolu.

Dokładnie określ stężenie preparatu RNA i przechowuj go w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do momentu uzyskania gotowości do użycia w dniu wstrzyknięcia. Lekko rozmrozić próbkę RNA, wirować i krótko odwirować. Teraz przygotuj roztwór roboczy ze sterylną wodą i końcowym stężeniem od 0,025 do 0,05% czerwieni fenolowej, czerwień fenolowa służy jako widoczny marker do wstrzykiwania roztworu do zarodka.

Tutaj przygotujemy roztwór roboczy 100 nanogramów na mikrolitr mRNA EGFP z 0,05% czerwienią fenolową. Na koniec trzymaj próbkę roboczą na lodzie i przywróć zapas RNA do minus 80 stopni Celsjusza. Przystąp do przygotowania morpho, gdy będzie ono gotowe do wstrzyknięcia tej próbki.

Oligonukleotydy antysensowne Morino są szeroko stosowane do modyfikowania ekspresji genów poprzez blokowanie translacji docelowego białka lub modyfikację prem NA. Splicing morphos u ryb danio pręgowanego służy jako potężne narzędzie genetyki odwrotnej poprzez osłabienie funkcji genów. Tutaj będziemy mikrowstrzykiwać oligo morfu ukierunkowany na miejsce inicjacji translacyjnej pkd dwa. Rutynowo używamy 300 M oligo morfologicznego, specjalnie zaprojektowanego dla interesującego nas genu uzyskanego z gene tools LLC.

Następnie dodajemy 100 mikrolitrów sterylnej wody, aby uzyskać trzymilimolowy roztwór podstawowy, a następnie porcjujemy roztwór i przechowujemy w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza, aż będzie gotowy do użycia w dniu wstrzyknięcia. Podgrzewamy roztwór morino w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie natychmiast schładzamy roztwór na lodzie i krótko wirujemy, ten krok denaturuje wszelkie struktury drugorzędowe w oligo i zapewnia, że roztwór jest całkowicie rozpuszczony.

Następnie przygotujemy roztwór roboczy, rozcieńczając roztwór Morpho w sterylnej wodzie i uzyskamy końcowe stężenie od 0,025 do 0,05% czerwieni pinalnej. W tej demonstracji będziemy przygotowywać roztwór roboczy 0,5 milimolowego PKD dwa morino z 0,05% czerwienią fenolową. Roztwór roboczy należy przechowywać w temperaturze pokojowej i przystąpić do napełniania mikropipetami, gdy będzie on gotowy do wstrzyknięcia tej próbki.

Aby rozpocząć, będziemy musieli wyprodukować mikropipety, które będą używane do wstrzykiwań. Odbywa się to poprzez podgrzewanie i wyciąganie kapilar ze szkła krzemianowego BOS w urządzeniu polarnym z mikropipetami. Po wyciągnięciu igieł trzyma się je na szalce Petriego na niewielkiej ilości gliny lub taśmy klejącej.

Następnie przygotujemy płytki z komory mikroiniekcyjnej, wlewając 1,5% aros do jednej XE trzech średnich płytek uformowanych z klinowymi korytkami. Będzie to łatwa metoda przetrzymywania zarodków podczas wstrzyknięcia. Płyty komory agro są następnie pozostawiane do zestalenia się i przechowywane w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą gotowe do użycia.

Aby rozpocząć napełnianie mikropipety. Przetnij dystalną końcówkę za pomocą kleszczy lub chirurgicznej żyletki, aby utworzyć otwór, który jest widoczny tylko pod mikroskopem preparacyjnym w 50-krotnym powiększeniu. Następnie umieść dwa mikrolitry roztworu roboczego.

Jako kroplę na szkiełko nakrywkowe, przymocuj tylną część mikropipety do pięciomililitrowej strzykawki wyposażonej w rurkę na igle podskórnej i lekko zanurz dystalną końcówkę mikropipety w kropli roztworu roboczego. Uważaj, aby nie ułamać końcówki mikropipety. Zasysać roztwór roboczy przez dystalny koniec mikropipety, pociągając za tłok strzykawki.

Następnie skalibrujemy objętość iniekcji mikropipety. Umieść kroplę oleju mineralnego na szkiełku mikrometrycznym i włącz zasilanie i dopływ powietrza do aparatu mikroinżektora z impulsem ciśnieniowym. Następnie przymocuj mikropipetę do uchwytu mikropipety aparatu do mikroiniekcji.

Mikrowtryskiwacz jest regulowany ciśnieniem, a wyładowania są aktywowane poprzez naciśnięcie pedału nożnego pod mikroskopem preparacyjnym. Przetestuj objętość wtrysku za pomocą mikrowtryskiwacza, aby umieścić kroplę roztworu roboczego na oleju mikrometrycznym. Zmierz średnicę kropli, gdy unosi się ona jako kula na wierzchu oleju.

Dostosuj czas trwania wstrzyknięcia i ciśnienie wstrzyknięcia, aby dokładnie skalibrować objętość wstrzyknięcia. Ten krok pomaga w odtwarzalności eksperymentu z mikroiniekcją. W tej demonstracji wszystkie mikroiniekcje zostaną wykonane przy średnicy kropli 0,15 milimetra.

Na koniec, po skalibrowaniu objętości wstrzyknięcia, użyj pokrętła blokady na mikrowtryskiwaczu, aby zapobiec tylnemu napełnianiu i wyciekowi mikropipety. Teraz nadszedł czas, aby przygotować zarodki danio pręgowanego. Danio pręgowany losowo łączy się w pary, w ciągu pierwszych kilku godzin każdego ranka, aby rozpocząć przygotowanie, zbiera zarodki na etapie jednej komórki i umieszcza je w jednym pożywce XE trzy.

Za pomocą trzymililitrowej pipety transferowej ułóż zarodki wzdłuż klinowatych koryt w płytkach komory mikroiniekcyjnej. Usuń podłoże tak, aby zarodki były płytkie, zanurzone i nie zalane. Ten krok pomaga w umieszczeniu zarodków na dnie koryt, a także w penetracji korionu przez mikropipetę.

Teraz zaczniemy zastrzyki. Najpierw będziemy manipulować zarodkami za pomocą mikropipety tak, aby cytoplazma zarodka w jednym stadium komórkowym była widoczna pod mikroskopem preparacyjnym. Należy uważać, aby nie złamać końcówki mikropipety, nie przebić mikropipetą do korionu, a następnie do żółtka w celu wstrzyknięcia do zarodka.

W tej demonstracji najpierw dokonamy mikroiniekcji do żółtka bezpośrednio pod komórką i pozwolimy, aby cytoplazmatyczne i dyfuzyjne wprowadziły roztwór roboczy do komórki. Przepływ ten jest widoczny dzięki czerwieni fenolowej dodanej do roztworu roboczego. Ponieważ jest to zarodek jednokomórkowy, można go wstrzykiwać z ręki lub za pomocą manipulatora.

Zademonstrujemy również bezpośrednią iniekcję do cytoplazmy komórki. Bezpośrednia mikroiniekcja do komórki jest bardziej niezawodna, ale czasochłonna, ponieważ wymagana jest odpowiednia orientacja zarodka i technika mikroiniekcji. Ponieważ błona komórkowa jest bardziej rygorystyczna niż błona żółtkowa, często szybciej jest wprowadzić się do mikropipety przez żółtko, aby dotrzeć do komórki.

Cytoplazma orientująca słup zwierzęcy w kierunku dna koryta i pracująca pewnymi rękami może pomóc w tej metodzie wstrzykiwania. Po mikroiniekcji umieść zarodki na szalce Petriego z pożywką E 3 i inkubuj je w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza dla prawidłowego rozwoju. Przez kilka następnych godzin i dni rozwoju zarodka obserwuj zarodki pod kątem interesujących Cię fenotypów.

Aby zweryfikować powodzenie mikroiniekcji, będziemy monitorować ekspresję GFP w rozwijających się zarodkach, począwszy od stadium tarczy, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej całego zarodka in vivo, ekspresja konstruktu jest najsilniejsza we wczesnych etapach rozwoju embrionalnego i często zmniejsza się podczas rozwoju. W miarę wstrzykiwania RNA z czapeczką ulega stopniowej degradacji i zależy od stabilności wyrażonego białka. Opierając się na wcześniej opublikowanych wynikach, spodziewamy się, że morfina PKD two będzie naśladować krzywiznę osi grzbietowej ciała, jaką stwierdzono u dwóch zmutowanych PKD danio pręgowanego i prezentować torbiele nerek około dwóch do trzech dni po zapłodnieniu.

Właśnie pokazaliśmy Ci solidną technikę mikroiniekcji do przeprowadzania badań nadekspresji mRNA i knockdownu genów morfooligonukleotydów u danio pręgowanego podczas wykonywania tej procedury, pamiętaj, że to ważne. Wstrzykiwać pewną ręką. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.