Mikroiniekcja embrionów ryb danio w celu analizy funkcji genów

Samce i samice danio pręgowanego są łączone w klatce hodowlanej, w której zapłodnione jaja opadają na dno, skąd można je łatwo zebrać. Następnie jaja są ustawiane w rzędzie przy szkiełku przedmiotowym w szalce Petriego. W kolejnym kroku przycinana jest napełniona igła do mikroiniekcji i dostosowywane są ustawienia wtrysku, tak aby objętość wstrzykiwanej bolusy miała pożąkaną wielkość zmierzoną mikrometrem.

Na koniec jaja są wstrzykiwane pojedynczo jedno po drugim. Cześć, jestem Jonathan Rosen z laboratorium Johna MA w Katedrze Kardiologii w Children's Hospital Boston. A ja jestem Michael Sweeney, również z laboratorium VY.

Dzisiaj zademonstrujemy, w jaki sposób można wstrzyknąć mRNA lub morpholino do embrionów danio pręgowanego. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu zbadania efektów wyciszenia lub nadekspresji produktów konkretnych genów. Zacznijmy zatem.

Aby rozpocząć, w noc poprzedzającą iniekcję należy przygotować zbiorniki dla ryb oraz zbiorniki tarłowe z zamontowanymi przegrodami w celu zwiększenia całkowitej produkcji ikry. Jeśli jest to pożądane, ryby można rozmieścić w stosunku dwóch samic na jednego samca. Następnego ranka, po zapaleniu świateł w pomieszczeniu, należy wyciągnąć przegrody z kilku zbiorników i pozostawić ryby na około 20 minut niezakłóconego tarła. Za pomocą sitka należy zebrać ikrę z klatek tarłowych i wypłukać ją wodą do ikry przed przelaniem do szalki Petriego.

Wykorzystując wodę z jajami, ryby można przenieść do większych zbiorników, aby uzyskać kolejne serie ikry do iniekcji. Należy dostosować czas zbierania jaj, aby uzyskać maksymalną liczbę komórek, nie dopuszczając jednocześnie do przekroczenia przez nie stadium jednej komórki. Na koniec należy umieścić szkiełko przedmiotowe w odwróconej pokrywie szalki Petriego o średnicy 100 milimetrów.

Za pomocą pipety transferowej ustaw jaja wzdłuż krawędzi szkiełka, tworząc pojedynczą kolumnę, a następnie usuń nadmiar wody z jaj, dociskając chusteczkę Kim wipe do boku przeciwległego do jaj. Następnie przygotujemy igły do mikroiniekcji za pomocą wyciągarki kapilarnej. Szklaną kapilarę o średnicy zewnętrznej 1 mm wyciągniemy do dwóch igieł, które następnie przechowamy w szalce Petriego o średnicy 150 mm. Igły można przygotować z wyprzedzeniem, układając je na rampach z masy plastycznej typu silly putty.

Stosujemy następujące ustawienia. Heat 6 45 pole 60 velocity 80. Szeroki koniec igły należy napełnić trzema mikrolitrami materiału do iniekcji, używając pipety mikroladowej.

Potrząsaj bolusem w stronę czubka igły, aż pozostanie tylko kilka pęcherzyków powietrza lub nie będzie ich wcale. Następnie włączymy źródło powietrza i mikroinjektor. Wsuń igłę do mikroinjektora i upewnij się, że jest ona szczelnie osadzona w obudowie.

Upewnij się, że mikromanipulator znajduje się w odpowiedniej pozycji, aby umożliwić szeroki zakres ruchu i regulacji. Wprowadź końcówkę igły w pole widzenia mikroskopu. Podnieś ją wysoko nad stolik i ustaw ostrość na najcieńszym obszarze końcówki.

Za pomocą pary ostrych pęset należy odciąć igłę w miejscu, które pozostawi ją wystarczająco wąską, aby mogła przebić chorion i żółtko, ale wciąż zdolną do podawania kropel o stałej wielkości. Aby obliczyć objętość każdego wstrzyknięcia, należy nanieść kroplę oleju mineralnego na mikrometr, wprowadzić igłę do oleju i nacisnąć pedał nożny, aby wstrzyknąć kroplę roztworu do oleju. Podczas przycinania igły i ewentualnej regulacji ciśnienia wtrysku należy monitorować wielkość kropli wstrzykiwanej do oleju.

Kuleczka o średnicy 0,1 mm zawiera 500 picolitrów materiału do wstrzyknięcia. Typowo stosowane objętości iniekcji to 500 picolitrów lub jeden nanolitr. Optymalne objętości iniekcji powinny wypełniać około 10% objętości jaja.

Jakość końcówki igły ma kluczowe znaczenie zarówno dla łatwości iniekcji, jak i dla jakości oraz spójności wyników. Nadszedł czas na rozpoczęcie procedury iniekcji. Należy upewnić się, że embriony nie rozwinęły się poza stadium czterech komórek.

W idealnym przypadku zarodek powinien znajdować się w stadium jednej komórki. Następnie, obserwując proces, należy opuścić igłę w kierunku kolumny jaj, przebić powierzchnię chorionu i jednym płynnym ruchem wprowadzić ją do żółtka. W przypadku zmiażdżenia lub przerwania worka żółtkowego, należy wstrzyknąć materiał do wnętrza żółtka.

Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza i zwracać uwagę na embriony, które są widocznie uszkodzone w wyniku iniekcji w miarę postępu prac. W razie potrzeby należy dostosować ciśnienie, aby zachować stały rozmiar kropli, a za pomocą końcówki pipety usuwać jaja, które wyglądają na niezapłodnione lub zostały zniszczone podczas procesu iniekcji. Po zakończeniu obróbki kolumny jaj należy użyć łagodnego strumienia wody do jaj, aby przenieść iniektowane jaja do czystej szalki Petriego i powtórzyć czynność w razie potrzeby.

Kilka nie wstrzykniętych embrionów należy zachować jako kontrolę. Później, w ciągu pierwszego dnia, należy usunąć martwe embriony i odnotować liczbę wstrzykniętych embrionów. Wodę z jajami w szalce należy okresowo wymieniać, aby zmniejszyć ryzyko infekcji.

Należy pamiętać, że w zależności od rodzaju wstrzykiwanej substancji, zarodki mogą przeżywać w mniejszym stopniu niż ich niepoddani iniekcji rodzeńcy. Na szczęście łatwo jest wstrzyknąć substancję ogromnej liczbie zarodków, więc rzadko stanowi to problem. Teraz przedstawimy reprezentatywne wyniki zarówno dla iniekcji morpho, jak i mRNA.

Kontrola niepoddana iniekcji w 48 godzinach po zapłodnieniu wygląda normalnie, zgodnie z oczekiwaniami. Jednakże embriony wstrzyknięte z morpho HG E three i three eeg FFR one, który wycisza izoformy HG zawierające pierwszą z dwóch powtórzeń typu EEG, wykazują obrzęk mózgu oraz iniekcję heart glass. Wprowadzenie mRNA heart glass spowodowało również wyraźny fenotyp w 24 godzinach po zapłodnieniu.

Głowy kontrolne, które nie zostały poddane iniekcji, wyglądały prawidłowo. Z kolei niektóre z embrionów wstrzykniętych z M NNA wykazywały opia. Właśnie pokazaliśmy, w jaki sposób iniekcja morphos lub mRNA w stadium jednej komórki może zwiększyć lub zmniejszyć ekspresję specyficznych genów w późniejszym rozwoju. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać również o tym.

Wysokie stężenie mRNA lub morpholino może prowadzić do niespecyficznej letalności embrionów w przypadku zastosowania morpholino. Każda z nich musi zostać przetestowana empirycznie, jednak zazwyczaj stężenia w zakresie od 200 do 500 mikromolarnych powodują specyficzny knockdown aktywności genu bez wywoływania ogólnej letalności. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.