Name: Mikroiniekcja zarodków danio pręgowanego w celu analizy funkcji genów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: Poznaj technikę mikroiniekcji mRNA lub morfolino do zarodków Danio rerio na etapie jednokomórkowym. Ta metoda umożliwia badanie funkcji genów poprzez manipulację ekspresji w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wyrażamy wdzięczność członkom laboratorium Mably oraz Narie Storer za pomoc techniczną, a także American Heart Association (NCRP Scientist Development Grant 0635363N) oraz National Heart, Lung, and Blood Institute (Grant SCCOR RFA HL02-027) za sfinansowanie badań.

Część 1: Produkcja i zbiór jaj
<ol>
<li>W noc poprzedzającą iniekcję umieść ryby w zbiornikach hodowlanych z zainstalowanymi przegrodami. Aby zwiększyć całkowitą produkcję ikry, ryby można ustawić w stosunku dwóch samic na jednego samca, jeśli jest to pożądane.</li>
<li>Następnego ranka, po zapaleniu świateł w pomieszczeniu, wyjmij przegrody z kilku zbiorników i pozwól na około 20 minut niezakłóconego kopulowania.</li>
<li>Za pomocą sitka zbierz ikrę z klatek hodowlanych i wypłucz ją wodą do ikry. Przelej ikrę do szalki Petriego z wodą do ikry i usuń niezapłodnione jaja oraz zanieczyszczenia za pomocą pipety transferowej. Ryby można ponownie pogrupować w większych zbiornikach, aby uzyskać kolejne porcje ikry do iniekcji. Dostosuj czas zbioru ikry tak, aby uzyskać maksymalną liczbę jaj, nie dopuszczając jednak do przejścia stadium jednej komórki.</li>
<li>Umieść szkiełko przedmiotowe w odwróconej pokrywie szalki Petriego o średnicy 100mm. Za pomocą pipety transferowej ustaw jaja wzdłuż krawędzi szkiełka, tworząc jedną kolumnę. Usuń nadmiar wody do ikry ze szkiełka, dociskając chusteczkę Kimwipe do strony przeciwległej do jaj. (Rysunek 1A)</li>
</ol>
Część 2: Wyciąganie, ładowanie i przygotowanie igły
<ol>
<li>Za pomocą wyciągarki do mikropipet wyciągnij kapilarę szklaną o średnicy zewnętrznej 1,0 mm w dwie igły i przechowuj je w szalce Petriego o średnicy 150 mm, kładąc na rampach z masy plastycznej (silly putty). Igły można wyciągnąć z wyprzedzeniem.</li>
<li>Napełnij igłę od tyłu 3 μL materiału do iniekcji, używając pipety do mikrodoładowywania (microloader). Potrząsaj bolusem w kierunku końcówki igły, aż pozostanie mało lub żadnych pęcherzyków powietrza.</li>
<li>Włącz źródło sprężonego powietrza i mikroinjektor. Włóż igłę do mikroinjektora i upewnij się, że jest szczelnie osadzona w obudowie. Sprawdź, czy mikromanipulator znajduje się w odpowiedniej pozycji, aby umożliwić szeroki zakres ruchu i regulacji. Przesuń końcówkę igły w pole widzenia mikroskopu, wysoko nad stolikiem, i ustaw ostrość na najcieńszym odcinku końcówki. Używając ostrych pęset, odetnij igłę w miejscu, które pozostawi ją wystarczająco wąską, aby przebić chorion i żółtko, ale wciąż zdolną do dostarczania kropli o stałej wielkości. Do obliczenia objętości każdej iniekcji można wykorzystać kroplę oleju mineralnego na mikrometrze. W przypadku iniekcji do oleju, kropla o średnicy 0,1 mm zawiera 500 pL materiału do iniekcji (rycina 1B); zazwyczaj stosuje się objętości iniekcji rzędu 500 pL lub 1 nL. Naciskaj pedał nożny i monitoruj wielkość kropli, przycinając igłę i dostosowując ciśnienie wstrzykiwania w razie potrzeby. Idealne objętości iniekcji powinny wypełniać około 10% objętości jaja. Jakość końcówki igły ma kluczowe znaczenie zarówno dla łatwości iniekcji, jak i dla jakości oraz powtarzalności wyników.</li>
</ol>
Część 3: Iniekcja
<ol>
<li>Upewnij się, że embriony nie rozwinęły się poza stadium czterech komórek. Idealnie, gdy embriony znajdują się w stadium jednej komórki.</li>
<li>Opuść igłę w stronę kolumny jaj, przytrzymując naczynie drugą ręką.</li>
<li>Przebij powierzchnię chorionu i wprowadź igłę do żółtka jednym płynnym ruchem, obserwując, czy nie dochodzi do zmiażdżenia lub rozerwania pęcherzyka żółtkowego. Wstrzyknij materiał do żółtka (rycina 1C). Unikaj wstrzykiwania pęcherzyków powietrza lub rozciągania żółtka, ponieważ oba te czynniki mogą być śmiertelne dla embrionu. Postępując wzdłuż linii, dostosuj ciśnienie w razie potrzeby, aby utrzymać stałą wielkość kropli, a za pomocą końcówki pipety usuń jaja, które wyglądają na niezapłodnione lub zostały zniszczone podczas procesu wstrzykiwania.</li>
<li>Po zakończeniu obróbki kolumny jaj, użyj delikatnego strumienia wody z jaj, aby przenieść wstrzyknięte jaja do czystej szalki Petriego. Powtórz w razie potrzeby. Zachowaj kilka niewstrzykniętych embrionów jako kontrolę. Pod koniec pierwszego dnia usuń martwe embriony i zapisz liczbę wstrzykniętych embrionów. Okresowo wymieniaj wodę z jaj w naczyniu, aby zmniejszyć ryzyko infekcji.</li>
</ol>
Część 4: Reprezentatywne wyniki
W zależności od tego, co jest wstrzykiwane, zarodki mogą wykazywać niższą przeżywalność niż ich niepoddane iniekcji rodzeństwo. Na szczęście możliwe jest łatwe wstrzyknięcie ogromnej liczby zarodków, więc rzadko stanowi to problem. Naturalne jest, że morfanty wykazują nieco opóźniony rozwój.
Aby zilustrować wyniki mikroiniekcji, zastosowaliśmy ten protokół do manipulacji poziomami białka Heart of Glass (Heg). Heg jest białkiem transbłonowym niezbędnym do prawidłowego rozwoju serca. W przypadku jego braku zarodki rozwijają serca z olbrzymimi drogami dopływowymi i komorami1. Wstrzyknięto dwa wcześniej nieopisane morfolino przeciwko heg, heg_e3i3_egfr1 oraz heg_e4i4_egfr2, w stężeniu 500 μM. W 2. dniu po zapłodnieniu nieiniekcyjne rodzeństwo kontrolne wygląda prawidłowo, zgodnie z oczekiwaniami (rycina 2A i B). Zarodki wstrzyknięte z heg_e3i3_egfr1 wykazują obrzęk mózgu (rycina 2C). Chociaż serca większości tych morfantów mają zmienioną morfologię, ich komory mają prawidłową wielkość (rycina 2D). Zarodki wstrzyknięte z heg_e4i4_egfr2 wykazują zmienne wady serca. Niektóre wyglądają prawidłowo, podczas gdy inne mają duże drogi dopływowe i umiarkowanie powiększone przedsionki (rycina 2E i F). Mutant heg, jak zgłoszono wcześniej1, posiada ogromnie powiększoną drogę dopływową i przedsionek (rycina 2G i H).
Wstrzykiwaliśmy również zarodki typu dzikiego z mRNA o stężeniu 400 ng/μL, przetranskrybowanym z pełnowymiarowego cDNA heg. Podczas gdy kontrole niewstrzyknięte rozwijają się prawidłowo (rycina 3A i B), zarodki wstrzyknięte z mRNA heg wykazują spektrum fenotypów, od wyglądu typu dzikiego po ciężką cyklopię, skrócenie głównej osi ciała, nekrozę głowy i ciała oraz wady linii pośrodkowej (rycina 3C i D).
<img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%201%20FINAL.png" alt="Metoda mikroiniekcji zarodków rybki zebrafish; obraz mikroskopowy A: rząd zarodków, B: skala linijki, C: pojedynczy zarodek." data-altupdatedat="1787630408000">
Rysunek 1.  Embriony przeznaczone do iniekcji są ustawione wzdłuż szkiełka przedmiotowego w szalce Petriego (A).  Objętość iniekcji określa się poprzez wstrzyknięcie do oleju mineralnego umieszczonego na mikrometrze.  Objętość iniekcji 500 pL, powszechnie stosowana, ma średnicę 0,1 mm (B).  Bezpośrednio po iniekcji morpholino lub mRNA jest widoczne jako punktowa plamka w żółtku (C).
<img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%202%20FINAL.png" alt="Etapy rozwoju embrionalnego danio pręgowanego przedstawione na obrazach mikroskopowych, z wyróżnieniem formowania się żółtka i oka." data-altupdatedat="1787630408000">
Rysunek 2.  W 2. dniu po zapłodnieniu embriony niepoddane wstrzyknięciu nie wykazują żadnych widocznych wad (A) ani fenotypu serca (B).  Embriony po wstrzyknięciu morpholino heg_e3i3_egfr1 wykazują obrzęk mózgu (C, strzałka), ale komory serca mają prawidłowe rozmiary (D).  Niektóre embriony po wstrzyknięciu morpholino heg_e4i4_egfr2 mają powiększone drogi dopływowe i przedsionki (E,F).  Mutanty heg mają silnie powiększone drogi dopływowe i przedsionki (G,H).  (A), (C), (E) i (G) to obrazy DIC 4x; (B), (D), (F) i (H) to obrazy DIC 20x. a=przedsionek, i t=droga dopływowa.
<img src="/files/ftp_upload/1115/Figure%203%20FINAL.png" alt="Etapy rozwoju zarodka danio pręgowanego, obraz mikroskopowy, z zaznaczonymi fazami wzrostu i cechami anatomicznymi." data-altupdatedat="1787630408000">
Rycina 3. W 24. godzinie po zapłodnieniu nieiniekcyjne embriony mają długie, proste ciało bez oznak martwicy lub wad linii środkowej (A) oraz dwa wyraźnie zarysowane oczy z rurką neuralną pomiędzy nimi (B). W przeciwieństwie do nich, niektóre embriony po iniekcji mRNA heg wykazują skrócenie osi ciała, martwicę, zniekształcone somity (C) oraz cyklopię (D). Zdjęcia (A) i (C) wykonano przy 4-krotnym powiększeniu w technice DIC; zdjęcia (B) i (D) wykonano przy 20-krotnym powiększeniu w technice DIC.

<ol><li>Mably, J. D., Mohideen, M. P. K., Burns, C. G., Chen, J., Fishman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heart+of+glass+regulates+the+concentric+growth+of+the+heart+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">heart of glass regulates the concentric growth of the heart in zebrafish.</a> Curr. Biol. 13, 2138-2147 (2003).</li>
</ol>

Jedną z zalet modelu danio przebrany jest łatwość, z jaką można wprowadzić do zarodka lub usunąć z niego specyficzne produkty genów za pomocą mikroiniekcji. Aby dokonać powszechnej nadekspresji konkretnego białka, wstrzykuje się kodujące je mRNA do żółtka w stadium 1 komórki. W trakcie późniejszego rozwoju zarodka RNA rozprzestrzenia się w całym organizmie i podlega translacji. I odwrotnie, w celu wyeliminowania konkretnego białka stosuje się morfolino. Morfolino to syntetyczne oligonukleotydy zaprojektowane z komplementarności antysensownej do specyficznych RNA. Podobnie jak mRNA, morfolino są wstrzykiwane do żółtka w stadium 1 komórki. Wewnątrz zarodka wiążą one swoje docelowe RNA, zapobiegając translacji.
Główną modyfikacją, jaką należy wprowadzić dla każdego morpholino lub mRNA, jest stężenie wstrzykiwanego materiału. Zbyt wysokie stężenie morpholino lub mRNA może spowodować niespecyficzną toksyczność; choć każde morpholino musi zostać przetestowane empirycznie w celu określenia jego optymalnego stężenia, zazwyczaj stężenia morpholino między 200 μM a 500 μM skutecznie obniżają aktywność genu, nie powodując niespecyficznych wad. Precyzyjna wielkość otworu igły nie jest kluczowa. W określonym zakresie rozmiarów igieł można dostosować ciśnienie i czas wstrzykiwania, aby uzyskać bolus o odpowiedniej objętości.
Morfolino mają wiele zastosowań, w tym funkcjonalną analizę domen wewnątrz białka. Gdy są zaprojektowane tak, aby celować w konkretne złącza ekson-intron, morfolino zapobiegają zachodzeniu tam splicingu. Zbadaliśmy efekty działania dwóch morfolino wiążących złącza ekson-intron w pre-mRNA heg. Morfolino heg_e3i3_egfr1 wiąże złącze między eksonem 3 a intronem 3, uniemożliwiając maszynerii splicingu włączenie eksonu 3 do dojrzałych transkryptów. Morfolino heg_e4i4_egfr2 w podobny sposób usuwa ekson 4. Zarówno ekson 3, jak i 4 kodują domeny zawierające powtórzenia typu EGF. Niektóre embriony wstrzyknięte heg_e4i4_egfr2 wykazują umiarkowane fenokopiowanie mutanta; do zrozumienia roli eksonu 4 genu Heg w rozwoju serca będą wymagane dalsze eksperymenty. Co zaskakujące, embriony wstrzyknięte heg_e3i3_egfr1 wykazują obrzęk mózgu, cechę niewystępującą u mutantów heg. Może to wynikać ze zdolności morfolino do wiązania transkryptów macierzystych, które nie byłyby dotknięte w mutantach zygotycznych.

<table><tbody><tr><td>Mikrowstrzykiwacz</td><td>Narzędzie</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PLI 100</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narzędzie</td><td>Narishige International</td><td>MN 153</td><td></td></tr><tr><td>Wytciągacz mikroelektrod</td><td>Narzędzie</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P 97</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary szklane</td><td>Narzędzie</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100 F6</td><td></td></tr><tr><td>Pipety do napełniania mikroelektrod</td><td>Narzędzie</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt do igieł</td><td>Narzędzie</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>MPH310</td><td></td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja embrionów ryb danio w celu analizy funkcji genów

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

Jedną z zalet badania danio pręgowanego jest łatwość i szybkość manipulowania poziomami białek w embrionie. Morfolina, będąca syntetycznym oligonukleotydem o komplementarności antysensownej do docelowych RNA, może zostać wprowadzona do embrionu w celu obniżenia ekspresji konkretnego produktu genu. Z kolei do embrionu można dodać przetworzone mRNA, aby zwiększyć poziom produktu genu. Metodą wprowadzania mRNA lub morfoliny do embrionu jest mikroiniekcja. Mikroiniekcja jest wydajna i szybka, co pozwala na iniekcję setek embrionów na godzinę. W niniejszym filmie przedstawiono wszystkie etapy mikroiniekcji. W skrócie: jaja są zbierane natychmiast po złożeniu i ustawiane w rzędzie przy szkiełku przedmiotowym w szalce Petriego. Następnie cienka igła wypełniona materiałem do iniekcji jest podłączana do mikroiniektora oraz źródła powietrza, a ustawienia mikroiniektora są regulowane w celu uzyskania pożądanej objętości iniekcji. Na koniec igła jest wprowadzana do żółtka embrionu, a następnie wstrzykiwana jest morfolina lub mRNA.

W niniejszym filmie pokazano, w jaki sposób morpholino lub mRNA można wstrzyknąć do embrionów zebrafish w stadium jednej komórki, aby obniżyć lub zwiększyć poziom produktów konkretnych genów podczas dalszego rozwoju.

Mikroiniekcja embrionów ryb danio w celu analizy funkcji genów

Jedną z zalet badania rybek zebra jest łatwość i szybkość manipulowania poziomami białek w zarodku. Morfolino, które są syntetycznymi...

Samce i samice danio pręgowanego są łączone w klatce hodowlanej, w której zapłodnione jaja opadają na dno, skąd można je łatwo zebrać. Następnie jaja są ustawiane w rzędzie przy szkiełku przedmiotowym w szalce Petriego. W kolejnym kroku przycinana jest napełniona igła do mikroiniekcji i dostosowywane są ustawienia wtrysku, tak aby objętość wstrzykiwanej bolusy miała pożąkaną wielkość zmierzoną mikrometrem.Na koniec jaja są wstrzykiwane pojedynczo jedno po drugim. Cześć, jestem Jonathan Rosen z laboratorium Johna MA w Katedrze Kardiologii w Children's Hospital Boston. A ja jestem Michael Sweeney, również z laboratorium VY.Dzisiaj zademonstrujemy, w jaki sposób można wstrzyknąć mRNA lub morpholino do embrionów danio pręgowanego. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu zbadania efektów wyciszenia lub nadekspresji produktów konkretnych genów. Zacznijmy zatem.Aby rozpocząć, w noc poprzedzającą iniekcję należy przygotować zbiorniki dla ryb oraz zbiorniki tarłowe z zamontowanymi przegrodami w celu zwiększenia całkowitej produkcji ikry. Jeśli jest to pożądane, ryby można rozmieścić w stosunku dwóch samic na jednego samca. Następnego ranka, po zapaleniu świateł w pomieszczeniu, należy wyciągnąć przegrody z kilku zbiorników i pozostawić ryby na około 20 minut niezakłóconego tarła. Za pomocą sitka należy zebrać ikrę z klatek tarłowych i wypłukać ją wodą do ikry przed przelaniem do szalki Petriego.Wykorzystując wodę z jajami, ryby można przenieść do większych zbiorników, aby uzyskać kolejne serie ikry do iniekcji. Należy dostosować czas zbierania jaj, aby uzyskać maksymalną liczbę komórek, nie dopuszczając jednocześnie do przekroczenia przez nie stadium jednej komórki. Na koniec należy umieścić szkiełko przedmiotowe w odwróconej pokrywie szalki Petriego o średnicy 100 milimetrów.Za pomocą pipety transferowej ustaw jaja wzdłuż krawędzi szkiełka, tworząc pojedynczą kolumnę, a następnie usuń nadmiar wody z jaj, dociskając chusteczkę Kim wipe do boku przeciwległego do jaj. Następnie przygotujemy igły do mikroiniekcji za pomocą wyciągarki kapilarnej. Szklaną kapilarę o średnicy zewnętrznej 1 mm wyciągniemy do dwóch igieł, które następnie przechowamy w szalce Petriego o średnicy 150 mm. Igły można przygotować z wyprzedzeniem, układając je na rampach z masy plastycznej typu silly putty.Stosujemy następujące ustawienia. Heat 6 45 pole 60 velocity 80. Szeroki koniec igły należy napełnić trzema mikrolitrami materiału do iniekcji, używając pipety mikroladowej.Potrząsaj bolusem w stronę czubka igły, aż pozostanie tylko kilka pęcherzyków powietrza lub nie będzie ich wcale. Następnie włączymy źródło powietrza i mikroinjektor. Wsuń igłę do mikroinjektora i upewnij się, że jest ona szczelnie osadzona w obudowie.Upewnij się, że mikromanipulator znajduje się w odpowiedniej pozycji, aby umożliwić szeroki zakres ruchu i regulacji. Wprowadź końcówkę igły w pole widzenia mikroskopu. Podnieś ją wysoko nad stolik i ustaw ostrość na najcieńszym obszarze końcówki.Za pomocą pary ostrych pęset należy odciąć igłę w miejscu, które pozostawi ją wystarczająco wąską, aby mogła przebić chorion i żółtko, ale wciąż zdolną do podawania kropel o stałej wielkości. Aby obliczyć objętość każdego wstrzyknięcia, należy nanieść kroplę oleju mineralnego na mikrometr, wprowadzić igłę do oleju i nacisnąć pedał nożny, aby wstrzyknąć kroplę roztworu do oleju. Podczas przycinania igły i ewentualnej regulacji ciśnienia wtrysku należy monitorować wielkość kropli wstrzykiwanej do oleju.Kuleczka o średnicy 0,1 mm zawiera 500 picolitrów materiału do wstrzyknięcia. Typowo stosowane objętości iniekcji to 500 picolitrów lub jeden nanolitr. Optymalne objętości iniekcji powinny wypełniać około 10% objętości jaja.Jakość końcówki igły ma kluczowe znaczenie zarówno dla łatwości iniekcji, jak i dla jakości oraz spójności wyników. Nadszedł czas na rozpoczęcie procedury iniekcji. Należy upewnić się, że embriony nie rozwinęły się poza stadium czterech komórek.W idealnym przypadku zarodek powinien znajdować się w stadium jednej komórki. Następnie, obserwując proces, należy opuścić igłę w kierunku kolumny jaj, przebić powierzchnię chorionu i jednym płynnym ruchem wprowadzić ją do żółtka. W przypadku zmiażdżenia lub przerwania worka żółtkowego, należy wstrzyknąć materiał do wnętrza żółtka.Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza i zwracać uwagę na embriony, które są widocznie uszkodzone w wyniku iniekcji w miarę postępu prac. W razie potrzeby należy dostosować ciśnienie, aby zachować stały rozmiar kropli, a za pomocą końcówki pipety usuwać jaja, które wyglądają na niezapłodnione lub zostały zniszczone podczas procesu iniekcji. Po zakończeniu obróbki kolumny jaj należy użyć łagodnego strumienia wody do jaj, aby przenieść iniektowane jaja do czystej szalki Petriego i powtórzyć czynność w razie potrzeby.Kilka nie wstrzykniętych embrionów należy zachować jako kontrolę. Później, w ciągu pierwszego dnia, należy usunąć martwe embriony i odnotować liczbę wstrzykniętych embrionów. Wodę z jajami w szalce należy okresowo wymieniać, aby zmniejszyć ryzyko infekcji.Należy pamiętać, że w zależności od rodzaju wstrzykiwanej substancji, zarodki mogą przeżywać w mniejszym stopniu niż ich niepoddani iniekcji rodzeńcy. Na szczęście łatwo jest wstrzyknąć substancję ogromnej liczbie zarodków, więc rzadko stanowi to problem. Teraz przedstawimy reprezentatywne wyniki zarówno dla iniekcji morpho, jak i mRNA.Kontrola niepoddana iniekcji w 48 godzinach po zapłodnieniu wygląda normalnie, zgodnie z oczekiwaniami. Jednakże embriony wstrzyknięte z morpho HG E three i three eeg FFR one, który wycisza izoformy HG zawierające pierwszą z dwóch powtórzeń typu EEG, wykazują obrzęk mózgu oraz iniekcję heart glass. Wprowadzenie mRNA heart glass spowodowało również wyraźny fenotyp w 24 godzinach po zapłodnieniu.Głowy kontrolne, które nie zostały poddane iniekcji, wyglądały prawidłowo. Z kolei niektóre z embrionów wstrzykniętych z M NNA wykazywały opia. Właśnie pokazaliśmy, w jaki sposób iniekcja morphos lub mRNA w stadium jednej komórki może zwiększyć lub zmniejszyć ekspresję specyficznych genów w późniejszym rozwoju. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać również o tym.Wysokie stężenie mRNA lub morpholino może prowadzić do niespecyficznej letalności embrionów w przypadku zastosowania morpholino. Każda z nich musi zostać przetestowana empirycznie, jednak zazwyczaj stężenia w zakresie od 200 do 500 mikromolarnych powodują specyficzny knockdown aktywności genu bez wywoływania ogólnej letalności. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

microinjection-of-zebrafish-embryos-to-analyze-gene-function

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroiniekcja zarodków rybki zebry w celu analizy funkcji genów

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Obumierające komórki są usuwane z tkanek nabłonkowych poprzez skoordynowany skurcz komórek sąsiednich, bez naruszania funkcji barierowej. Przejrzystość optyczna rozwijających się rybek danio przymrużonych stanowi doskonały system do wizualizacji procesu ekstruzji w żywych nabłonkach. W niniejszej pracy opisujemy metody indukcji i obrazowania ekstruzji w naskórku larw rybek danio przymrużonych z rozdzielczością komórkową.

Obrazowanie na żywo ekstruzji komórek z naskórka rozwijającego się danio pręgowanego

Ten film opisuje technikę mikroiniekcji zarodka w celu dostarczenia związków do woreczka z żółtkiem danio pręgowanego.

Mikroiniekcja zarodka: technika dostarczania związku do żółtka danio pręgowanego

W tym artykule demonstrujemy metodę manipulowania ekspresją genów w komórkach komorowych dorosłego kresomózgowia danio pręgowanego za pomocą antysensownych oligonukleotydów morfolino. Przedstawiamy tę metodę jako skuteczny i szybki protokół, który można wykorzystać do badań funkcjonalnych w mózgu dorosłego kręgowca.

Mikromanipulacja ekspresją genów w mózgu dorosłego danio pręgowanego za pomocą mikroiniekcji oligonukleotydów morfolino do komory mózgowej

Danio pręgowany, mała tropikalna ryba, stała się popularnym modelem do badania funkcji genów podczas rozwoju i choroby kręgowców. Czasową i przestrzenną ekspresję genów docelowych można określić za pomocą hybrydyzacji in situ. Nasz ulepszony protokół pozwala na wykrywanie mało obfitych transkryptów z niskim niespecyficznym sygnałem tła.

Hybrydyzacja in situ w pełnej rozdzielczości w zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania ekspresji i funkcji genów

Danio pręgowany jest doskonałym modelem do badań genetycznych i rozwojowych. Implantacja kulek jest cenną techniką manipulacji tkankami, którą można wykorzystać do badania mechanizmów rozwojowych poprzez wprowadzanie zmian w lokalnych środowiskach komórkowych. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przeprowadzić implantację mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego.

Implantacja mikrogranulek w zarodku danio pręgowanego

RASopatie to wielosystemowe zespoły genetyczne wywołane hiperaktywacją szlaku RAS-MAPUK. Potencjalnie patogenne warianty oczekujące na walidację pojawiają się nieustannie, podczas gdy słabe dowody przedkliniczne ograniczają terapię. Tutaj opisujemy nasz protokół in vivo polegający na testowaniu i krzyżowej weryfikacji poziomów aktywacji ERK związanych z RASopatią oraz jego modulacji farmakologicznej podczas embrigenezy za pomocą obrazowania FRET na żywo u danio danio młodego typu Teen-reporter.

Efektywny protokół oceny modulacji aktywności ERK w wczesnych modelach zespołu Noonana u danio danio za pomocą mikroskopii na żywo FRET i immunofluorescencji

W tym filmie Nijole Jasinskiene prezentuje metodologię wykorzystywaną do tworzenia transgenicznych komarów Aedes aegypti, które są wektorami gorączki Denga. Przedstawione zostają techniki prawidłowego przygotowania igieł do mikroiniekcji, wysuszania embrionów oraz przeprowadzania mikroiniekcji.

Mikroiniekcja zarodków A. aegypti w celu uzyskania transgenicznych komarów

Poznaj technikę mikroiniekcji mRNA lub morfolino do zarodków Danio rerio na etapie jednokomórkowym. Ta metoda umożliwia badanie funkcji genów poprzez manipulację ekspresji w biologii rozwoju.

Mikroiniekcja embrionów ryb danio w celu analizy funkcji genów

Przeglądaj więcej filmów