Name: Monitorowanie hormonów roślinnych podczas reakcji na stres (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-15T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji parowej i analizy GC/MS do jednoczesnego oznaczania hormonów roślinnych w małych próbkach tkankowych. Technika ta umożliwia badaczom monitorowanie zmian hormonalnych w odpowiedzi na stres.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol>
<li>W pierwszej kolejności należy przygotować fiolki z nakrętką o pojemności 2ml do ekstrakcji: do fiolki dodaje się 400ul buforu do ekstrakcji (1-propanol:H2O:stężony HCl 2:1:0,002 obj./obj./obj.) oraz 10 μl odpowiedniego standardu wewnętrznego (10ng/μl). Próbkę zamraża się w ciekłym azocie, a następnie dodaje kulki ceramiczne.</li>
<li>Materiał roślinny (od 50 do 200mg) dodaje się, gdy fiolki wciąż znajdują się w ciekłym azocie. Należy pamiętać, że masę dodanego materiału roślinnego należy oszacować przed dalszą obróbką, aby umożliwić późniejszą dokładną kwantyfikację opartą na masie świeżej.</li>
<li>Należy upewnić się, że cały ciekły azot odparował przed szczelnym zamknięciem fiolki nakrętką. Należy pamiętać, że nakrętka musi posiadać uszczelkę gumową, aby zapobiec wyciekom rozpuszczalników, a tym samym ekstrahowanych związków podczas homogenizacji.</li>
<li>Tkankę homogenizuje się w homogenizatorze kulkowym FastPrep lub Precellys przy prędkości 6000 (dla Precellys) przez 30 s.</li>
<li>Fiolki wyjmuje się z homogenizatora pojedynczo, ostrożnie otwiera nakrętki i do każdej próbki dodaje 1ml dichlorometanu. Fiolki ponownie szczelnie zamyka się i ponownie homogenizuje przez 10-15 s przy prędkości 6000 (Precellys).</li>
<li>Fiolki przenosi się do wirówki stołowej i oddziela fazę organiczną od fazy wodnej przy 10.000xg przez 60 s.</li>
<li>Po rozdzieleniu faz dolną zieloną warstwę (faza organiczna, zawiera hormony i standardy wewnętrzne) przenosi się z poszczególnych fiolek do czystej szklanej fiolki o pojemności 4ml. Należy unikać przenoszenia wody (faza górna). Alternatywnie, zamiast dichlorometanu można użyć octanu etylu. W takim przypadku faza octanu etylu będzie warstwą górną (zieloną), co ułatwi jej usunięcie i przeniesienie do nowej szklanej fiolki 4ml. Podobnie jak wcześniej, należy unikać przenoszenia wody.</li>
<li>Rozpuszczalnik odparowuje się strumieniem powietrza przez manifold przez około 10-25 min (zależnie od próbki); za pomocą pojedynczej końcówki doprowadzającej powietrze należy (ostrożnie) sprawdzić, czy próbki są suche. Nie należy nadmiernie wysuszać próbek, ponieważ może to spowodować straty związków.</li>
<li>Po wysuszeniu próbek można rozpocząć metylację związków zawierających kwasy karboksylowe. Najpierw do każdej fiolki dodaje się 100 μl mieszaniny dietylu eteru i metanolu (9:1 obj./obj.), a następnie 4μl 2M roztworu trimetylosililodiazometanu (w heksanie, Sigma Aldrich). Fiolki natychmiast zamyka się nakrętką z silikonową septą z wkładką teflonową. Próbkę delikatnie wstrząsa się i inkubuje w RT przez 25 do 30 min.</li>
<li>Po zakończeniu kroku 9 należy włączyć blok grzejny i ustawić pożądaną temperaturę zbierania. Lotność zmetylowanych związków zależy od ich wielkości, ale także od innych, bardziej polarnych grup, takich jak =O, -OH i -NH. Dla estrów metylowych kwasu jasmionowego i kwasu salicylowego wystarczająca jest temperatura zbierania około 80°C, podczas gdy inne związki, np. kwasy tłuszczowe C18, koniugaty kwasu jasmionowego z aminokwasami, koronatyna oraz ester metylowy kwasu 12-okso-fitodienoicznego, wymagają temperatury między 180 a 200°C do efektywnej lotnienia.</li>
<li>Po 30-minutowej inkubacji reakcję metylacji należy przerwać, aby uniknąć niepożądanych reakcji wtórnych. Odbywa się to poprzez dodanie 4 μl 2M roztworu kwasu octowego (w heksanie) do każdej fiolki. Po zamknięciu fiolek nakrętkami i krótkim mieszaniu w wortexie, próbki inkubuje się przez kolejne 30 min.</li>
<li>Filtry używane do tej ekstrakcji z fazy gazowej są wykonane ręcznie i w przedstawionej formie nie są dostępne komercyjnie. Składają się one z zewnętrznej rurki teflonowej (o długości około 7-8 cm), do której z jednej strony wsuwa się dopasowaną rurkę szklaną o długości około 4 cm. Z drugiej strony rurki teflonowej do wnętrza wsuwa się stalową siatkę, aż dotrze ona do wewnętrznej rurki szklanej, a na nią dodaje się około 20-30mg adsorbenta (SuperQ 80/100 (wycofany z produkcji) lub HayeSep® Q80/100). Wsuwa się kolejną stalową siatkę, a na koniec do rurki teflonowej wsuwa się końcówkę szklaną, ostrożnie dociskając stalową siatkę do adsorbenta. Szczegółowe zdjęcie filtra przedstawiono na rysunku 1. <img src="/files/ftp_upload/1127/1127fig1.jpg" alt="Schemat układu chromatografii gazowej; pokazuje filtr z rurką teflonową, wkładką szklaną, obojętną siatką i adsorbentem HayesSep do rozdzielania związków." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1.</li>
<li>Podczas czasu inkubacji z kroku 11 filtry do zbierania zmetylowanych, a tym samym lotnych hormonów roślinnych, należy przemyć najpierw 200ul metanolu, a następnie dwukrotnie 200ul dichlorometanu. Pozostały w filtrach rozpuszczalnik odparowuje się strumieniem powietrza. Filtry mogą być teraz użyte do wychwytywania lotnych hormonów poprzez ekstrakcję z fazy gazowej.</li>
<li>Po 30 minutach inkubacji septy gumowe nakrętek fiolek 4ml przecina się skalpelem. Aby zebrać hormony roślinne metodą ekstrakcji z fazy gazowej, oczyszczone filtry podłącza się do poszczególnych linii próżniowych przy przepływie około 800ml/min. Filtry wprowadza się następnie do fiolki przez przecięte septy. Wprowadza się również małą końcówkę pipety, która pełni rolę wlotu powietrza. Podczas tej początkowej części procedury fiolki z włożonymi filtrami muszą być trzymane w pozycji pionowej, aby żadna ciecz wewnątrz fiolki nie miała kontaktu z końcówką filtra, co zanieczyszczyłoby filtr, a w konsekwencji także układ GC/MS. Fiolki trzyma się ręcznie, aż cała ciecz odparuje przez filtr. Następnie fiolki z przymocowanymi filtrami umieszcza się na bloku grzejnym i zbiera odparowane termicznie związki przez 3 min. Główne komponenty systemu oraz konfiguracja przedstawione są na rysunku 1. Po tym końcowym etapie ekstrakcji z fazy gazowej fiolki z wciąż przymocowanymi filtrami umieszcza się na statywie i pozostawia do ostygnięcia.</li>
<li>Gdy filtry ponownie osiągną temperaturę pokojową, eluouje się je 150ml dichlorometanu do fiolki GC o pojemności 1,5 ml z wkładką. Po wydmuchaniu pozostałego rozpuszczalnika z filtra, fiolki zamyka się i analizuje za pomocą GC/MS.</li>
</ol>
Do analizy należy użyć chromatografu gazowego wyposażonego w injektor split/splitless (tryb splitless 250°C, objętość wtrysku 1μL) połączonego ze spektrometrem mas pracującym w trybie jonizacji chemicznej (CI). Związki są rozdzielane na kolumnie HP-1MS (30m x 0.25mm x 0.25μm) utrzymywanej w temperaturze 40°C przez 1min po wtrysku, a następnie temperatura jest programowana w tempie 15°C/min do 250°C (przez 10min), z helem jako gazem nośnym (stały przepływ 0.7ml/min). Do analizy opartej na MS można zastosować zarówno spektrometr mas z analizatorem kwadrupolowym (np. Agilent HP5973), jak i z pułapką jonową (np. Varian Saturn 2200). Jako gaz CI można wykorzystać izobutan (dostarczany w butlach) lub metanol (wykorzystuje się opary z rezerwuaru z cieczą), jednak w każdym przypadku należy sprawdzić fragmenty reakcji jonizacji przed utworzeniem programów zliczanego jonu wybranego (SIC). W systemie Varian GC 3900/Saturn MS 2200 z metanolem jako reagentem CI zastosowaliśmy następujący program: 5.00-11.30min jony (M+1)+ 153-158 (salicylan metylu 153, salicylan metylowy 2H5); 11.30-13.30min jony (M+1)+ 207-228 (jasmonian metylu 207 i 225, dihydrojasmonian metylu 209 i 227); 13.30-16.30min jony (M+1)+ 237-300 (kwas abscisowy metylowy 261, kwas abscisowy metylowy 2H6 267 (kwas abscisowy generuje głównie jony [M-H2O+1]+)). Wszystkie związki należy zidentyfikować poprzez porównanie z autentycznymi, dostępnymi komercyjnie wzorcami. Ilościowe oznaczenie JA, SA i ABA wykonuje się poprzez korelację pola powierzchni piku (jonów ekstrahowanych) z polem powierzchni piku (jonów ekstrahowanych) odpowiedniego standardu wewnętrznego, w odniesieniu do masy świeżej użytego materiału roślinnego.

<ol><li>Schmelz, E. A., Engelberth, J., Tumlinson, J. H., Alborn, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+vapor+phase+extraction+in+metabolic+profiling+of+phytohormones+and+other+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The use of vapor phase extraction in metabolic profiling of phytohormones and other metabolites.</a> Plant Journal. 39, 790-808 (2004).</li>
<li>Engelberth, J., Alborn, H. T., Schmelz, E. A., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+signals+prime+plants+against+insect+herbivore+attack%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Airborne signals prime plants against insect herbivore attack.</a> PNAS. 101, 1781-1785 (2004).</li>
<li>Schmelz, E. A., Engelberth, J., Alborn, H. T., O&acute, D. onnel, Sammons, P., Toshima, M., H, J. H. T. umlinson <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+phytohormones%2C+phytotoxins%2C+and+volatile+organic+compounds+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of phytohormones, phytotoxins, and volatile organic compounds in plants.</a> PNAS. 100, 10552-10557 (2003).</li>
<li>Engelberth, J., Schmelz, E. A., Alborn, H., Cardoza, Y. J., Huang, J., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Quantification+of+Jasmonic+acid+and+Salicylic+acid+by+Vapor+Phase+Extraction+and+Gas+Chromatography+-+Chemical+Ionization-Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Quantification of Jasmonic acid and Salicylic acid by Vapor Phase Extraction and Gas Chromatography - Chemical Ionization-Mass Spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 312, 242-250 (2003).</li>
</ol>

Przedstawiona tutaj metoda okazała się niezawodna dla szerokiego spektrum związków sygnałowych roślin, pod warunkiem, że wielkość i charakter chemiczny związku nie uniemożliwiają jego ekstrakcji, metylacji i odparowania. Ponadto opisana w niniejszym opracowaniu procedura metylacji nie jest jedynym sposobem derywatyzacji. Sylilacja i acetylacja stanowią alternatywne metody, których protokoły można łatwo znaleźć w sieci.
Jeśli spektrometr mas nie umożliwia monitorowania pojedynczych jonów, zakre...

monitorowanie hormonów roślinnych podczas odpowiedzi na stres

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Hormony roślinne i powiązane z nimi związki sygnałowe odgrywają istotną rolę w regulacji reakcji roślin na różnorodne bodźce i stresy środowiskowe. Do najpoważniejszych stresów należą żerowanie owadów, infekcje patogenami oraz stres suszy. W przypadku każdego z tych stresów znany jest konkretny zestaw hormonów i/lub ich kombinacji, które precyzyjnie dostrajają odpowiedzi organizmu, zapewniając tym samym przetrwanie rośliny. Głównymi hormonami zaangażowanymi w regulację tych reakcji są kwas jasmonowy (JA), kwas salicylowy (SA) oraz kwas abscysynowy (ABA). Aby lepiej zrozumieć rolę poszczególnych hormonów, a także ich potencjalne interakcje podczas tych odpowiedzi, konieczne jest monitorowanie zmian w ich zawartości zarówno w czasie, jak i w przestrzeni. W celu łatwego, czułego i powtarzalnego oznaczania ilościowego tych i innych związków sygnałowych opracowaliśmy metodę opartą na ekstrakcji w fazie gazowej i analizie za pomocą chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrią mas (GC/MS) (1, 2, 3, 4). Po ekstrakcji tych związków z tkanki roślinnej za pomocą kwaśnego wodnego 1-propanolu zmieszanego z dichlorometanem, związki zawierające kwasy karboksylowe są metylowane, odparowywane pod wpływem ciepła i zbierane na absorbencie polimerowym. Po elucji do fiolki z próbką anality są rozdzielane metodą chromatografii gazowej i wykrywane za pomocą spektrometrii mas z jonizacją chemiczną. Zastosowanie odpowiednich standardów wewnętrznych pozwala następnie na prostą kwantyfikację poprzez odniesienie powierzchni piku anality do powierzchni piku standardu wewnętrznego.

Przedstawiono prostą metodę umożliwiającą szybką ekstrakcję i analizę wielu hormonów roślinnych z niewielkich próbek tkanek. Procedura wykorzystuje ekstrakcję w fazie gazowej jako jedyny etap oczyszczania. Próbki analizuje się za pomocą GC/MS z jonizacją chemiczną, która generuje głównie jony (M+1)+.

Monitorowanie hormonów roślinnych podczas odpowiedzi na stres

Hormony roślinne i powiązane z nimi związki sygnałowe odgrywają istotną rolę w regulacji reakcji roślin na różne bodźce i stresy środowiskowe. ...

Procedura ta rozpoczyna się od homogenizacji materiału roślinnego przy użyciu kulek ceramicznych i następującej po niej ekstrakcji dichlorometanem w celu uzyskania fazy organicznej. Po wirowaniu próbki są suszone na powietrzu i przygotowywane do ekstrakcji w fazie gazowej. Po elucji z filtrów ekstrakcji w fazie gazowej można przystąpić do analizy hormonów roślinnych z wykorzystaniem spektrometrii mas i chromatografii gazowej.Witajcie, jestem Marie Engelberg z laboratorium JU Engelberg w Katedrze Biologii na Uniwersytecie Teksańskim tutaj w San Antonio, a ja jestem Ju Engelberg. Dzisiaj zaprezentujemy prostą procedurę jednoczesnego oznaczania ilościowego ważnych hormonów roślinnych. Metody tej używamy rutynowo do monitorowania zmian stężeń tych hormonów w roślinach poddanych działaniu owadów.Możemy również monitorować zmiany w składzie kwasów tłuszczowych. Przejdźmy zatem do pracy. Do ekstrakcji należy najpierw przygotować dwie fiolki z nakrętką o pojemności 2 ml.Aby to zrobić, należy dodać do fiolki 400 µL roztworu do ekstrakcji oraz 10 µL odpowiedniego standardu wewnętrznego o stężeniu 10 ng/µL. Następnie fiolki należy zamrozić w ciekłym azocie. Po zamrożeniu do fiolek należy dodać kulki ceramiczne.Gdy fiolki wciąż znajdują się w ciekłym azocie, należy dodać od 50 do 200 mg materiału roślinnego. Należy pamiętać, że masę dodanego materiału roślinnego trzeba oszacować przed dalszą obróbką, aby umożliwić dokładną kwantyfikację w późniejszym etapie, która opiera się na masie świeżej.Należy upewnić się, że zakrętka posiada gumową uszczelkę, aby zapobiec wyciekom rozpuszczalników i ekstraktów podczas homogenizacji. Homogenizować tkankę w młynku kulkowym Fast Prep lub PSU. W przypadku młynka PSU ustawić prędkość 6 000 i homogenizować przez 30 sekund.Po homogenizacji kolejno wyjmuj probówki z homogenizatora i ostrożnie otwórz nakrętkę, aby dodać 1 mL dichlorometanu do każdej próbki, następnie szczelnie zamknij probówki i homogenizuj przez 10 do 15 s przy 6 000 rpm. Po homogenizacji przenieś probówki do wirówki nakładkowej i oddziel fazę organiczną od fazy wodnej przy 10 000 ×g przez 60 s. Po rozdzieleniu faz przenieś dolną zieloną warstwę z poszczególnych probówek do czystej szklanej probówki o pojemności 4 mL.Jest to faza organiczna zawierająca hormony i standardy wewnętrzne. Należy unikać przenoszenia wody lub fazy górnej; rozpuszczalnik należy odparować strumieniem powietrza za pomocą manifoldu przez około 10 do 25 minut. Czas ten zależy od próbki.Za pomocą pojedynczej końcówki z przepływem powietrza należy ostrożnie sprawdzić, czy próbki są suche. Należy uważać, aby nie przesuszyć próbek, ponieważ może to doprowadzić do utraty związków. Po wysuszeniu próbek można rozpocząć metylację związków zawierających kwasy karboksylowe w analizowanych próbkach.Najpierw do każdej fiolki należy dodać 100 µL mieszaniny eteru dietylowego i metanolu w stosunku objętościowym 9:1. Następnie należy dodać 4 µL 2 M roztworu diazometanu w heksanie. Fiolki należy natychmiast zamknąć za pomocą nakrętki z otworem wyposażonej w silikonową septę z powłoką teflonową, delikatnie wstrząsnąć i inkubować w temperaturze pokojowej przez 25 do 30 minut.Włącz blok grzewczy i ustaw go na pożądaną temperaturę zbierania. Lotność związków zmetylowanych będzie się różnić w zależności od ich wielkości i liczby grup polarnych. Temperatury mogą mieścić się w zakresie od 80 do 200 °C. Po 30 minutowej inkubacji przerwij reakcję metylacji, dodając do każdej fiolki 4 µL 2 M roztworu kwasu octowego w heksanie.Przystępuje się do tego kroku, aby uniknąć niepożądanej reakcji wtórnej. Filtry stosowane do ekstrakcji w fazie gazowej są wykonane ręcznie. Powstają one z rurek teflonowych.Z jednej strony wkłada się dopasowaną szklaną rurkę o długości około czterech centymetrów. Widoczne są dwa krążki z siatki ze stali nierdzewnej, które utrzymują około 20 do 30 mg adsorbentu. Filtry, które zostaną użyte do zbierania zmetylowanych i lotnych hormonów roślinnych, należy przemyć 200 µL metanolu.Następnie filtry należy przemyć dwukrotnie 200 µL dichlorometanu. Pozostały na filtrach rozpuszczalnik należy odparować na powietrzu. Filtry można teraz wykorzystać do wychwytywania lotnych hormonów za pomocą ekstrakcji w fazie gazowej.Po 30 minutach inkubacji próbek, gumowe septa nakrętek fiolek o pojemności czterech mililitrów zostają przecięte skalpelem. W tym momencie ekstrahowany materiał jest gotowy do pobrania hormonów roślinnych metodą ekstrakcji z fazy gazowej. Oczyszczone filtry są podłączone do poszczególnych linii próżniowych przy przepływie wynoszącym około 800 mililitrów na minutę.Następnie filtry wprowadza się do fiolki przez nacięte septa. Wprowadzana jest również końcówka małej pipety, która pełni rolę wlotu powietrza. Podczas tej początkowej części procedury fiolki z włożonymi filtrami muszą być utrzymywane w pozycji pionowej, aby zapobiec kontaktowi cieczy znajdującej się w fiolce z końcówką filtra, co doprowadziłoby do jego zanieczyszczenia.Następnie w układzie GC-MS fiolki trzyma się w ręku, aż cały płyn odparuje przez filtr. Potem fiolki z przymocowanymi filtrami umieszcza się na bloku grzejnym, a odparowane w wyniku ogrzewania związki zbiera się przez trzy minuty. Po tym końcowym etapie ekstrakcji z fazy gazowej, fiolki z wciąż przymocowanymi filtrami należy umieścić na statywie i pozostawić do ostygnięcia.Przygotować fiolki do GC o pojemności 1,5 ml z wkładkami, gdy filtry osiągną temperaturę pokojową. Do fiolek wprowadzić pętlą 150 µL dichlorometanu. Po wydmuchaniu pozostałego rozpuszczalnika z filtra, fiolki należy zamknąć nakrętkami; są one teraz gotowe do analizy metodą chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrią mas.Do analizy należy użyć chromatografu gazowego wyposażonego w injektor z podziałem przepływu, połączonego ze spektrometrem mas pracującym w trybie jonizacji chemicznej; po wtryśnięciu związki są rozdzielane na kolumnie HP-1 MS utrzymywanej w temperaturze 40°C przez jedną minutę. Temperaturę programuje się ze wzrostem 15°C na minutę do 250°C i utrzymuje przez 10 minut, stosując hel jako gaz nośny przy stałym przepływie 0,7 ml/min. W analizie opartej na MS w charakterze gazu CI można zastosować zarówno spektrometr mas z analizatorem czteropolowym, jak i pułapkę jonową.Można zastosować izobutan lub metanol. Należy jednak w każdym przypadku sprawdzić fragmenty reakcji jonizacji przed utworzeniem wybranych programów zliczania jonów. W naszych badaniach wykorzystujemy system chromatografii gazowej variant GC 3, 900 połączony ze spektrometrem mas Saturn MS 2200 oraz metanol jako odczynnik CI.Opis programu znajduje się w naszym protokole pisemnym. Należy upewnić się, że wszystkie związki zostały zidentyfikowane poprzez porównanie z autentycznymi standardami dostępnymi w handlu. Ilościowe oznaczenie JA SA i A BA przeprowadza się poprzez korelację pola powierzchni piku jonów wyodrębnionych z polem powierzchni piku jonów wyodrębnionych odpowiadającego standardu wewnętrznego; obliczenia opierają się również na masie świeżej użytego materiału roślinnego.Po wyodrębnieniu danych z plików GCM S i przeprowadzeniu obliczeń stwierdzono, że etilen wywołał znaczne nagromadzenie kwasu salicylowego, kwasu jasmonowego oraz kwasu abscysynowego w porównaniu z niepoddanymi działaniu kontrolami. Dane dla każdego hormonu zostały pobrane z jednego przebiegu i wykazują zdolność tej metody do multipleksowej analizy hormonów. Przedstawiliśmy prostą, a jednocześnie skuteczną procedurę ekstrakcji i oznaczania ilościowego ważnych hormonów roślinnych oraz innych związków sygnałowych.Jest to proste w wykonaniu, a większość zaprezentowanych narzędzi można łatwo przygotować ze standardowych materiałów laboratoryjnych. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

monitoring-plant-hormones-during-stress-responses

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Monitoring roślin Hormony podczas reakcji na stres

Ca2+ reguluje różnorodne procesy biologiczne w roślinach. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do monitorowania przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2 + wywołanych stresem abiotycznym w komórkach i tkankach rzodkiewnika przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 + Aequorin lub Case12.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika

Istnieje potrzeba nieinwazyjnej oceny stresu. W artykule opisano prosty protokół wykorzystujący obrazowanie termiczne do wykrywania znaczącej reakcji temperatury okolicy oczu u dzikich sikorek modraszkich na łagodny ostry stresor.

Obrazowanie termowizyjne do nieinwazyjnego badania stresu u nieskrępowanych ptaków

Tutaj opisujemy nową metodę badania importu białek do izolowanych chloroplastów pod wpływem stresu. Metoda jest szybka i prosta i może być stosowana do badania konsekwencji różnych warunków stresowych dla importu białka chloroplastowego i odpowiednich mechanizmów regulacyjnych.

Analiza importu białek do chloroplastów wyizolowanych z roślin zestresowanych

Prosty, wszechstronny i tani system hydroponiczny in vitro został pomyślnie zoptymalizowany, umożliwiając eksperymenty na dużą skalę w sterylnych warunkach. System ten ułatwia stosowanie substancji chemicznych w roztworze i ich efektywne wchłanianie przez korzenie do badań molekularnych, biochemicznych i fizjologicznych.

Elastyczny, niedrogi system hydroponiczny do oceny reakcji roślin na małe cząsteczki w sterylnych warunkach

Celem tego artykułu jest zidentyfikowanie zmian w poziomie stresu po wizycie w trzech różnych miejscach i opisanie metod stosowanych do identyfikacji poziomów stresu na podstawie pomiarów kortyzolu w ślinie, α-amylazy i psychologicznego narzędzia do samoopisu.

Pomiar poziomu stresu biofizycznego i psychicznego po wizycie w trzech miejscach o różnym poziomie natury

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Zaprojektowaliśmy protokół fenotypowania oparty na obrazach, aby określić morfologiczne i fizjologiczne reakcje na pojedyncze i skojarzone zabiegi upałów, suszy i podlewania. Podejście to umożliwiło identyfikację wczesnych, późnych i regeneracyjnych reakcji na poziomie całego zakładu, w szczególności części nadziemnych, a także podkreśliło konieczność stosowania wielu czujników obrazowania.

Wysokoprzepustowe fenotypowanie oparte na obrazie w celu określenia morfologicznych i fizjologicznych odpowiedzi na pojedyncze i połączone stresy u ziemniaka

Przedstawiony tutaj protokół obejmuje profilowanie polisomalne w celu wyizolowania translatomów, mRNA związanych z rybosomami, do niepolisomalnych i polisomalnych RNA z Arabidopsis poprzez wirowanie w gradicynacji gęstości sacharozy. Metoda ta demonstruje wydajność translacji Arabidopsis poddanego stresowi cieplnemu.

Test wydajności translacji przy użyciu profili polisomowych pod wpływem stresu cieplnego

Protokół ten opisuje podejście o wysokiej przepustowości do oceny wycieku jonów roślinnych, aktywności peroksydazy oraz produkcji kalloz w tej samej próbce.

Ocena odpowiedzi liści na metabolity drugorzędne mikroorganizmów przy użyciu formatu o wysokiej przepustowości

Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.

Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Poznaj metodę ekstrakcji parowej i analizy GC/MS do jednoczesnego oznaczania hormonów roślinnych w małych próbkach tkankowych. Technika ta umożliwia badaczom monitorowanie zmian hormonalnych w odpowiedzi na stres.

Monitorowanie hormonów roślinnych podczas odpowiedzi na stres

Przeglądaj więcej filmów