Name: Monitorowanie hormonów roślinnych podczas reakcji na stres (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-15T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Poznaj metodę ekstrakcji parowej i analizy GC/MS do jednoczesnego oznaczania hormonów roślinnych w małych próbkach tkankowych. Technika ta umożliwia badaczom monitorowanie zmian hormonalnych w odpowiedzi na stres.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<ol>
<li>W pierwszej kolejności należy przygotować fiolki z nakrętką o pojemności 2ml do ekstrakcji: do fiolki dodaje się 400ul buforu do ekstrakcji (1-propanol:H2O:stężony HCl 2:1:0,002 obj./obj./obj.) oraz 10 μl odpowiedniego standardu wewnętrznego (10ng/μl). Próbkę zamraża się w ciekłym azocie, a następnie dodaje kulki ceramiczne.</li>
<li>Materiał roślinny (od 50 do 200mg) dodaje się, gdy fiolki wciąż znajdują się w ciekłym azocie. Należy pamiętać, że masę dodanego materiału roślinnego należy oszacować przed dalszą obróbką, aby umożliwić późniejszą dokładną kwantyfikację opartą na masie świeżej.</li>
<li>Należy upewnić się, że cały ciekły azot odparował przed szczelnym zamknięciem fiolki nakrętką. Należy pamiętać, że nakrętka musi posiadać uszczelkę gumową, aby zapobiec wyciekom rozpuszczalników, a tym samym ekstrahowanych związków podczas homogenizacji.</li>
<li>Tkankę homogenizuje się w homogenizatorze kulkowym FastPrep lub Precellys przy prędkości 6000 (dla Precellys) przez 30 s.</li>
<li>Fiolki wyjmuje się z homogenizatora pojedynczo, ostrożnie otwiera nakrętki i do każdej próbki dodaje 1ml dichlorometanu. Fiolki ponownie szczelnie zamyka się i ponownie homogenizuje przez 10-15 s przy prędkości 6000 (Precellys).</li>
<li>Fiolki przenosi się do wirówki stołowej i oddziela fazę organiczną od fazy wodnej przy 10.000xg przez 60 s.</li>
<li>Po rozdzieleniu faz dolną zieloną warstwę (faza organiczna, zawiera hormony i standardy wewnętrzne) przenosi się z poszczególnych fiolek do czystej szklanej fiolki o pojemności 4ml. Należy unikać przenoszenia wody (faza górna). Alternatywnie, zamiast dichlorometanu można użyć octanu etylu. W takim przypadku faza octanu etylu będzie warstwą górną (zieloną), co ułatwi jej usunięcie i przeniesienie do nowej szklanej fiolki 4ml. Podobnie jak wcześniej, należy unikać przenoszenia wody.</li>
<li>Rozpuszczalnik odparowuje się strumieniem powietrza przez manifold przez około 10-25 min (zależnie od próbki); za pomocą pojedynczej końcówki doprowadzającej powietrze należy (ostrożnie) sprawdzić, czy próbki są suche. Nie należy nadmiernie wysuszać próbek, ponieważ może to spowodować straty związków.</li>
<li>Po wysuszeniu próbek można rozpocząć metylację związków zawierających kwasy karboksylowe. Najpierw do każdej fiolki dodaje się 100 μl mieszaniny dietylu eteru i metanolu (9:1 obj./obj.), a następnie 4μl 2M roztworu trimetylosililodiazometanu (w heksanie, Sigma Aldrich). Fiolki natychmiast zamyka się nakrętką z silikonową septą z wkładką teflonową. Próbkę delikatnie wstrząsa się i inkubuje w RT przez 25 do 30 min.</li>
<li>Po zakończeniu kroku 9 należy włączyć blok grzejny i ustawić pożądaną temperaturę zbierania. Lotność zmetylowanych związków zależy od ich wielkości, ale także od innych, bardziej polarnych grup, takich jak =O, -OH i -NH. Dla estrów metylowych kwasu jasmionowego i kwasu salicylowego wystarczająca jest temperatura zbierania około 80°C, podczas gdy inne związki, np. kwasy tłuszczowe C18, koniugaty kwasu jasmionowego z aminokwasami, koronatyna oraz ester metylowy kwasu 12-okso-fitodienoicznego, wymagają temperatury między 180 a 200°C do efektywnej lotnienia.</li>
<li>Po 30-minutowej inkubacji reakcję metylacji należy przerwać, aby uniknąć niepożądanych reakcji wtórnych. Odbywa się to poprzez dodanie 4 μl 2M roztworu kwasu octowego (w heksanie) do każdej fiolki. Po zamknięciu fiolek nakrętkami i krótkim mieszaniu w wortexie, próbki inkubuje się przez kolejne 30 min.</li>
<li>Filtry używane do tej ekstrakcji z fazy gazowej są wykonane ręcznie i w przedstawionej formie nie są dostępne komercyjnie. Składają się one z zewnętrznej rurki teflonowej (o długości około 7-8 cm), do której z jednej strony wsuwa się dopasowaną rurkę szklaną o długości około 4 cm. Z drugiej strony rurki teflonowej do wnętrza wsuwa się stalową siatkę, aż dotrze ona do wewnętrznej rurki szklanej, a na nią dodaje się około 20-30mg adsorbenta (SuperQ 80/100 (wycofany z produkcji) lub HayeSep® Q80/100). Wsuwa się kolejną stalową siatkę, a na koniec do rurki teflonowej wsuwa się końcówkę szklaną, ostrożnie dociskając stalową siatkę do adsorbenta. Szczegółowe zdjęcie filtra przedstawiono na rysunku 1. <img src="/files/ftp_upload/1127/1127fig1.jpg" alt="Schemat układu chromatografii gazowej; pokazuje filtr z rurką teflonową, wkładką szklaną, obojętną siatką i adsorbentem HayesSep do rozdzielania związków." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1.</li>
<li>Podczas czasu inkubacji z kroku 11 filtry do zbierania zmetylowanych, a tym samym lotnych hormonów roślinnych, należy przemyć najpierw 200ul metanolu, a następnie dwukrotnie 200ul dichlorometanu. Pozostały w filtrach rozpuszczalnik odparowuje się strumieniem powietrza. Filtry mogą być teraz użyte do wychwytywania lotnych hormonów poprzez ekstrakcję z fazy gazowej.</li>
<li>Po 30 minutach inkubacji septy gumowe nakrętek fiolek 4ml przecina się skalpelem. Aby zebrać hormony roślinne metodą ekstrakcji z fazy gazowej, oczyszczone filtry podłącza się do poszczególnych linii próżniowych przy przepływie około 800ml/min. Filtry wprowadza się następnie do fiolki przez przecięte septy. Wprowadza się również małą końcówkę pipety, która pełni rolę wlotu powietrza. Podczas tej początkowej części procedury fiolki z włożonymi filtrami muszą być trzymane w pozycji pionowej, aby żadna ciecz wewnątrz fiolki nie miała kontaktu z końcówką filtra, co zanieczyszczyłoby filtr, a w konsekwencji także układ GC/MS. Fiolki trzyma się ręcznie, aż cała ciecz odparuje przez filtr. Następnie fiolki z przymocowanymi filtrami umieszcza się na bloku grzejnym i zbiera odparowane termicznie związki przez 3 min. Główne komponenty systemu oraz konfiguracja przedstawione są na rysunku 1. Po tym końcowym etapie ekstrakcji z fazy gazowej fiolki z wciąż przymocowanymi filtrami umieszcza się na statywie i pozostawia do ostygnięcia.</li>
<li>Gdy filtry ponownie osiągną temperaturę pokojową, eluouje się je 150ml dichlorometanu do fiolki GC o pojemności 1,5 ml z wkładką. Po wydmuchaniu pozostałego rozpuszczalnika z filtra, fiolki zamyka się i analizuje za pomocą GC/MS.</li>
</ol>
Do analizy należy użyć chromatografu gazowego wyposażonego w injektor split/splitless (tryb splitless 250°C, objętość wtrysku 1μL) połączonego ze spektrometrem mas pracującym w trybie jonizacji chemicznej (CI). Związki są rozdzielane na kolumnie HP-1MS (30m x 0.25mm x 0.25μm) utrzymywanej w temperaturze 40°C przez 1min po wtrysku, a następnie temperatura jest programowana w tempie 15°C/min do 250°C (przez 10min), z helem jako gazem nośnym (stały przepływ 0.7ml/min). Do analizy opartej na MS można zastosować zarówno spektrometr mas z analizatorem kwadrupolowym (np. Agilent HP5973), jak i z pułapką jonową (np. Varian Saturn 2200). Jako gaz CI można wykorzystać izobutan (dostarczany w butlach) lub metanol (wykorzystuje się opary z rezerwuaru z cieczą), jednak w każdym przypadku należy sprawdzić fragmenty reakcji jonizacji przed utworzeniem programów zliczanego jonu wybranego (SIC). W systemie Varian GC 3900/Saturn MS 2200 z metanolem jako reagentem CI zastosowaliśmy następujący program: 5.00-11.30min jony (M+1)+ 153-158 (salicylan metylu 153, salicylan metylowy 2H5); 11.30-13.30min jony (M+1)+ 207-228 (jasmonian metylu 207 i 225, dihydrojasmonian metylu 209 i 227); 13.30-16.30min jony (M+1)+ 237-300 (kwas abscisowy metylowy 261, kwas abscisowy metylowy 2H6 267 (kwas abscisowy generuje głównie jony [M-H2O+1]+)). Wszystkie związki należy zidentyfikować poprzez porównanie z autentycznymi, dostępnymi komercyjnie wzorcami. Ilościowe oznaczenie JA, SA i ABA wykonuje się poprzez korelację pola powierzchni piku (jonów ekstrahowanych) z polem powierzchni piku (jonów ekstrahowanych) odpowiedniego standardu wewnętrznego, w odniesieniu do masy świeżej użytego materiału roślinnego.

<ol><li>Schmelz, E. A., Engelberth, J., Tumlinson, J. H., Alborn, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+vapor+phase+extraction+in+metabolic+profiling+of+phytohormones+and+other+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">The use of vapor phase extraction in metabolic profiling of phytohormones and other metabolites.</a> Plant Journal. 39, 790-808 (2004).</li>
<li>Engelberth, J., Alborn, H. T., Schmelz, E. A., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airborne+signals+prime+plants+against+insect+herbivore+attack%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Airborne signals prime plants against insect herbivore attack.</a> PNAS. 101, 1781-1785 (2004).</li>
<li>Schmelz, E. A., Engelberth, J., Alborn, H. T., O&acute, D. onnel, Sammons, P., Toshima, M., H, J. H. T. umlinson <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+analysis+of+phytohormones%2C+phytotoxins%2C+and+volatile+organic+compounds+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Simultaneous analysis of phytohormones, phytotoxins, and volatile organic compounds in plants.</a> PNAS. 100, 10552-10557 (2003).</li>
<li>Engelberth, J., Schmelz, E. A., Alborn, H., Cardoza, Y. J., Huang, J., Tumlinson, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+Quantification+of+Jasmonic+acid+and+Salicylic+acid+by+Vapor+Phase+Extraction+and+Gas+Chromatography+-+Chemical+Ionization-Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Simultaneous Quantification of Jasmonic acid and Salicylic acid by Vapor Phase Extraction and Gas Chromatography - Chemical Ionization-Mass Spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 312, 242-250 (2003).</li>
</ol>

Przedstawiona tutaj metoda okazała się niezawodna dla szerokiego spektrum związków sygnałowych roślin, pod warunkiem, że wielkość i charakter chemiczny związku nie uniemożliwiają jego ekstrakcji, metylacji i odparowania. Ponadto opisana w niniejszym opracowaniu procedura metylacji nie jest jedynym sposobem derywatyzacji. Sylilacja i acetylacja stanowią alternatywne metody, których protokoły można łatwo znaleźć w sieci.
Jeśli spektrometr mas nie umożliwia monitorowania pojedynczych jonów, zakre...

monitorowanie hormonów roślinnych podczas odpowiedzi na stres

Monitoring Plant Hormones During Stress Responses

Hormony roślinne i powiązane z nimi związki sygnałowe odgrywają istotną rolę w regulacji reakcji roślin na różnorodne bodźce i stresy środowiskowe. Do najpoważniejszych stresów należą żerowanie owadów, infekcje patogenami oraz stres suszy. W przypadku każdego z tych stresów znany jest konkretny zestaw hormonów i/lub ich kombinacji, które precyzyjnie dostrajają odpowiedzi organizmu, zapewniając tym samym przetrwanie rośliny. Głównymi hormonami zaangażowanymi w regulację tych reakcji są kwas jasmonowy (JA), kwas salicylowy (SA) oraz kwas abscysynowy (ABA). Aby lepiej zrozumieć rolę poszczególnych hormonów, a także ich potencjalne interakcje podczas tych odpowiedzi, konieczne jest monitorowanie zmian w ich zawartości zarówno w czasie, jak i w przestrzeni. W celu łatwego, czułego i powtarzalnego oznaczania ilościowego tych i innych związków sygnałowych opracowaliśmy metodę opartą na ekstrakcji w fazie gazowej i analizie za pomocą chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrią mas (GC/MS) (1, 2, 3, 4). Po ekstrakcji tych związków z tkanki roślinnej za pomocą kwaśnego wodnego 1-propanolu zmieszanego z dichlorometanem, związki zawierające kwasy karboksylowe są metylowane, odparowywane pod wpływem ciepła i zbierane na absorbencie polimerowym. Po elucji do fiolki z próbką anality są rozdzielane metodą chromatografii gazowej i wykrywane za pomocą spektrometrii mas z jonizacją chemiczną. Zastosowanie odpowiednich standardów wewnętrznych pozwala następnie na prostą kwantyfikację poprzez odniesienie powierzchni piku anality do powierzchni piku standardu wewnętrznego.

Przedstawiono prostą metodę umożliwiającą szybką ekstrakcję i analizę wielu hormonów roślinnych z niewielkich próbek tkanek. Procedura wykorzystuje ekstrakcję w fazie gazowej jako jedyny etap oczyszczania. Próbki analizuje się za pomocą GC/MS z jonizacją chemiczną, która generuje głównie jony (M+1)+.

Monitorowanie hormonów roślinnych podczas odpowiedzi na stres

Hormony roślinne i powiązane z nimi związki sygnałowe odgrywają istotną rolę w regulacji reakcji roślin na różne bodźce i stresy środowiskowe. ...

Procedura ta rozpoczyna się od homogenizacji materiału roślinnego przy użyciu kulek ceramicznych i następującej po niej ekstrakcji dichlorometanem w celu uzyskania fazy organicznej. Po wirowaniu próbki są suszone na powietrzu i przygotowywane do ekstrakcji w fazie gazowej. Po elucji z filtrów ekstrakcji w fazie gazowej można przystąpić do analizy hormonów roślinnych z wykorzystaniem spektrometrii mas i chromatografii gazowej.Witajcie, jestem Marie Engelberg z laboratorium JU Engelberg w Katedrze Biologii na Uniwersytecie Teksańskim tutaj w San Antonio, a ja jestem Ju Engelberg. Dzisiaj zaprezentujemy prostą procedurę jednoczesnego oznaczania ilościowego ważnych hormonów roślinnych. Metody tej używamy rutynowo do monitorowania zmian stężeń tych hormonów w roślinach poddanych działaniu owadów.Możemy również monitorować zmiany w składzie kwasów tłuszczowych. Przejdźmy zatem do pracy. Do ekstrakcji należy najpierw przygotować dwie fiolki z nakrętką o pojemności 2 ml.Aby to zrobić, należy dodać do fiolki 400 µL roztworu do ekstrakcji oraz 10 µL odpowiedniego standardu wewnętrznego o stężeniu 10 ng/µL. Następnie fiolki należy zamrozić w ciekłym azocie. Po zamrożeniu do fiolek należy doda

monitoring-plant-hormones-during-stress-responses

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Monitoring roślin Hormony podczas reakcji na stres

Ca2+ reguluje różnorodne procesy biologiczne w roślinach. W tym miejscu przedstawiamy podejścia do monitorowania przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2 + wywołanych stresem abiotycznym w komórkach i tkankach rzodkiewnika przy użyciu genetycznie kodowanych wskaźników Ca2 + Aequorin lub Case12.

Pomiar przestrzennych i czasowych sygnałów Ca2+ u rzodkiewnika

Istnieje potrzeba nieinwazyjnej oceny stresu. W artykule opisano prosty protokół wykorzystujący obrazowanie termiczne do wykrywania znaczącej reakcji temperatury okolicy oczu u dzikich sikorek modraszkich na łagodny ostry stresor.

Obrazowanie termowizyjne do nieinwazyjnego badania stresu u nieskrępowanych ptaków

Tutaj opisujemy nową metodę badania importu białek do izolowanych chloroplastów pod wpływem stresu. Metoda jest szybka i prosta i może być stosowana do badania konsekwencji różnych warunków stresowych dla importu białka chloroplastowego i odpowiednich mechanizmów regulacyjnych.

Analiza importu białek do chloroplastów wyizolowanych z roślin zestresowanych

Prosty, wszechstronny i tani system hydroponiczny in vitro został pomyślnie zoptymalizowany, umożliwiając eksperymenty na dużą skalę w sterylnych warunkach. System ten ułatwia stosowanie substancji chemicznych w roztworze i ich efektywne wchłanianie przez korzenie do badań molekularnych, biochemicznych i fizjologicznych.

Elastyczny, niedrogi system hydroponiczny do oceny reakcji roślin na małe cząsteczki w sterylnych warunkach

Celem tego artykułu jest zidentyfikowanie zmian w poziomie stresu po wizycie w trzech różnych miejscach i opisanie metod stosowanych do identyfikacji poziomów stresu na podstawie pomiarów kortyzolu w ślinie, α-amylazy i psychologicznego narzędzia do samoopisu.

Pomiar poziomu stresu biofizycznego i psychicznego po wizycie w trzech miejscach o różnym poziomie natury

Tutaj charakteryzujemy komórkowe reakcje na stres proteotoksyczny u nicieni C. elegans, mierząc aktywację fluorescencyjnych reporterów transkrypcyjnych i oceniając wrażliwość na stres fizjologiczny.

Pomiary fizjologicznych reakcji na stres u C. elegans

Zaprojektowaliśmy protokół fenotypowania oparty na obrazach, aby określić morfologiczne i fizjologiczne reakcje na pojedyncze i skojarzone zabiegi upałów, suszy i podlewania. Podejście to umożliwiło identyfikację wczesnych, późnych i regeneracyjnych reakcji na poziomie całego zakładu, w szczególności części nadziemnych, a także podkreśliło konieczność stosowania wielu czujników obrazowania.

Wysokoprzepustowe fenotypowanie oparte na obrazie w celu określenia morfologicznych i fizjologicznych odpowiedzi na pojedyncze i połączone stresy u ziemniaka

Przedstawiony tutaj protokół obejmuje profilowanie polisomalne w celu wyizolowania translatomów, mRNA związanych z rybosomami, do niepolisomalnych i polisomalnych RNA z Arabidopsis poprzez wirowanie w gradicynacji gęstości sacharozy. Metoda ta demonstruje wydajność translacji Arabidopsis poddanego stresowi cieplnemu.

Test wydajności translacji przy użyciu profili polisomowych pod wpływem stresu cieplnego

Protokół ten opisuje podejście o wysokiej przepustowości do oceny wycieku jonów roślinnych, aktywności peroksydazy oraz produkcji kalloz w tej samej próbce.

Ocena odpowiedzi liści na metabolity drugorzędne mikroorganizmów przy użyciu formatu o wysokiej przepustowości

Molekularne podstawy przestrzennie specyficznych odpowiedzi fitochromów są badane z wykorzystaniem roślin transgenicznych wykazujących deficyty fitochromów specyficzne dla tkanek i organów. W celu zidentyfikowania genów zaangażowanych w przestrzennie specyficzne odpowiedzi fitochromów stosuje się izolację konkretnych komórek wykazujących indukowane wyczerpanie chromoforu fitochromu za pomocą sortowania komórek aktywowane fluorescencją (FACS), a następnie analizy mikromacierzy.

Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Poznaj metodę ekstrakcji parowej i analizy GC/MS do jednoczesnego oznaczania hormonów roślinnych w małych próbkach tkankowych. Technika ta umożliwia badaczom monitorowanie zmian hormonalnych w odpowiedzi na stres.

Monitorowanie hormonów roślinnych podczas odpowiedzi na stres

Przeglądaj więcej filmów