Monitorowanie hormonów roślinnych podczas odpowiedzi na stres

Procedura ta rozpoczyna się od homogenizacji materiału roślinnego przy użyciu kulek ceramicznych i następującej po niej ekstrakcji dichlorometanem w celu uzyskania fazy organicznej. Po wirowaniu próbki są suszone na powietrzu i przygotowywane do ekstrakcji w fazie gazowej. Po elucji z filtrów ekstrakcji w fazie gazowej można przystąpić do analizy hormonów roślinnych z wykorzystaniem spektrometrii mas i chromatografii gazowej.

Witajcie, jestem Marie Engelberg z laboratorium JU Engelberg w Katedrze Biologii na Uniwersytecie Teksańskim tutaj w San Antonio, a ja jestem Ju Engelberg. Dzisiaj zaprezentujemy prostą procedurę jednoczesnego oznaczania ilościowego ważnych hormonów roślinnych. Metody tej używamy rutynowo do monitorowania zmian stężeń tych hormonów w roślinach poddanych działaniu owadów.

Możemy również monitorować zmiany w składzie kwasów tłuszczowych. Przejdźmy zatem do pracy. Do ekstrakcji należy najpierw przygotować dwie fiolki z nakrętką o pojemności 2 ml.

Aby to zrobić, należy dodać do fiolki 400 µL roztworu do ekstrakcji oraz 10 µL odpowiedniego standardu wewnętrznego o stężeniu 10 ng/µL. Następnie fiolki należy zamrozić w ciekłym azocie. Po zamrożeniu do fiolek należy dodać kulki ceramiczne.

Gdy fiolki wciąż znajdują się w ciekłym azocie, należy dodać od 50 do 200 mg materiału roślinnego. Należy pamiętać, że masę dodanego materiału roślinnego trzeba oszacować przed dalszą obróbką, aby umożliwić dokładną kwantyfikację w późniejszym etapie, która opiera się na masie świeżej.

Należy upewnić się, że zakrętka posiada gumową uszczelkę, aby zapobiec wyciekom rozpuszczalników i ekstraktów podczas homogenizacji. Homogenizować tkankę w młynku kulkowym Fast Prep lub PSU. W przypadku młynka PSU ustawić prędkość 6 000 i homogenizować przez 30 sekund.

Po homogenizacji kolejno wyjmuj probówki z homogenizatora i ostrożnie otwórz nakrętkę, aby dodać 1 mL dichlorometanu do każdej próbki, następnie szczelnie zamknij probówki i homogenizuj przez 10 do 15 s przy 6 000 rpm. Po homogenizacji przenieś probówki do wirówki nakładkowej i oddziel fazę organiczną od fazy wodnej przy 10 000 ×g przez 60 s. Po rozdzieleniu faz przenieś dolną zieloną warstwę z poszczególnych probówek do czystej szklanej probówki o pojemności 4 mL.

Jest to faza organiczna zawierająca hormony i standardy wewnętrzne. Należy unikać przenoszenia wody lub fazy górnej; rozpuszczalnik należy odparować strumieniem powietrza za pomocą manifoldu przez około 10 do 25 minut. Czas ten zależy od próbki.

Za pomocą pojedynczej końcówki z przepływem powietrza należy ostrożnie sprawdzić, czy próbki są suche. Należy uważać, aby nie przesuszyć próbek, ponieważ może to doprowadzić do utraty związków. Po wysuszeniu próbek można rozpocząć metylację związków zawierających kwasy karboksylowe w analizowanych próbkach.

Najpierw do każdej fiolki należy dodać 100 µL mieszaniny eteru dietylowego i metanolu w stosunku objętościowym 9:1. Następnie należy dodać 4 µL 2 M roztworu diazometanu w heksanie. Fiolki należy natychmiast zamknąć za pomocą nakrętki z otworem wyposażonej w silikonową septę z powłoką teflonową, delikatnie wstrząsnąć i inkubować w temperaturze pokojowej przez 25 do 30 minut.

Włącz blok grzewczy i ustaw go na pożądaną temperaturę zbierania. Lotność związków zmetylowanych będzie się różnić w zależności od ich wielkości i liczby grup polarnych. Temperatury mogą mieścić się w zakresie od 80 do 200 °C. Po 30 minutowej inkubacji przerwij reakcję metylacji, dodając do każdej fiolki 4 µL 2 M roztworu kwasu octowego w heksanie.

Przystępuje się do tego kroku, aby uniknąć niepożądanej reakcji wtórnej. Filtry stosowane do ekstrakcji w fazie gazowej są wykonane ręcznie. Powstają one z rurek teflonowych.

Z jednej strony wkłada się dopasowaną szklaną rurkę o długości około czterech centymetrów. Widoczne są dwa krążki z siatki ze stali nierdzewnej, które utrzymują około 20 do 30 mg adsorbentu. Filtry, które zostaną użyte do zbierania zmetylowanych i lotnych hormonów roślinnych, należy przemyć 200 µL metanolu.

Następnie filtry należy przemyć dwukrotnie 200 µL dichlorometanu. Pozostały na filtrach rozpuszczalnik należy odparować na powietrzu. Filtry można teraz wykorzystać do wychwytywania lotnych hormonów za pomocą ekstrakcji w fazie gazowej.

Po 30 minutach inkubacji próbek, gumowe septa nakrętek fiolek o pojemności czterech mililitrów zostają przecięte skalpelem. W tym momencie ekstrahowany materiał jest gotowy do pobrania hormonów roślinnych metodą ekstrakcji z fazy gazowej. Oczyszczone filtry są podłączone do poszczególnych linii próżniowych przy przepływie wynoszącym około 800 mililitrów na minutę.

Następnie filtry wprowadza się do fiolki przez nacięte septa. Wprowadzana jest również końcówka małej pipety, która pełni rolę wlotu powietrza. Podczas tej początkowej części procedury fiolki z włożonymi filtrami muszą być utrzymywane w pozycji pionowej, aby zapobiec kontaktowi cieczy znajdującej się w fiolce z końcówką filtra, co doprowadziłoby do jego zanieczyszczenia.

Następnie w układzie GC-MS fiolki trzyma się w ręku, aż cały płyn odparuje przez filtr. Potem fiolki z przymocowanymi filtrami umieszcza się na bloku grzejnym, a odparowane w wyniku ogrzewania związki zbiera się przez trzy minuty. Po tym końcowym etapie ekstrakcji z fazy gazowej, fiolki z wciąż przymocowanymi filtrami należy umieścić na statywie i pozostawić do ostygnięcia.

Przygotować fiolki do GC o pojemności 1,5 ml z wkładkami, gdy filtry osiągną temperaturę pokojową. Do fiolek wprowadzić pętlą 150 µL dichlorometanu. Po wydmuchaniu pozostałego rozpuszczalnika z filtra, fiolki należy zamknąć nakrętkami; są one teraz gotowe do analizy metodą chromatografii gazowej sprzężonej z spektrometrią mas.

Do analizy należy użyć chromatografu gazowego wyposażonego w injektor z podziałem przepływu, połączonego ze spektrometrem mas pracującym w trybie jonizacji chemicznej; po wtryśnięciu związki są rozdzielane na kolumnie HP-1 MS utrzymywanej w temperaturze 40°C przez jedną minutę. Temperaturę programuje się ze wzrostem 15°C na minutę do 250°C i utrzymuje przez 10 minut, stosując hel jako gaz nośny przy stałym przepływie 0,7 ml/min. W analizie opartej na MS w charakterze gazu CI można zastosować zarówno spektrometr mas z analizatorem czteropolowym, jak i pułapkę jonową.

Można zastosować izobutan lub metanol. Należy jednak w każdym przypadku sprawdzić fragmenty reakcji jonizacji przed utworzeniem wybranych programów zliczania jonów. W naszych badaniach wykorzystujemy system chromatografii gazowej variant GC 3, 900 połączony ze spektrometrem mas Saturn MS 2200 oraz metanol jako odczynnik CI.

Opis programu znajduje się w naszym protokole pisemnym. Należy upewnić się, że wszystkie związki zostały zidentyfikowane poprzez porównanie z autentycznymi standardami dostępnymi w handlu. Ilościowe oznaczenie JA SA i A BA przeprowadza się poprzez korelację pola powierzchni piku jonów wyodrębnionych z polem powierzchni piku jonów wyodrębnionych odpowiadającego standardu wewnętrznego; obliczenia opierają się również na masie świeżej użytego materiału roślinnego.

Po wyodrębnieniu danych z plików GCM S i przeprowadzeniu obliczeń stwierdzono, że etilen wywołał znaczne nagromadzenie kwasu salicylowego, kwasu jasmonowego oraz kwasu abscysynowego w porównaniu z niepoddanymi działaniu kontrolami. Dane dla każdego hormonu zostały pobrane z jednego przebiegu i wykazują zdolność tej metody do multipleksowej analizy hormonów. Przedstawiliśmy prostą, a jednocześnie skuteczną procedurę ekstrakcji i oznaczania ilościowego ważnych hormonów roślinnych oraz innych związków sygnałowych.

Jest to proste w wykonaniu, a większość zaprezentowanych narzędzi można łatwo przygotować ze standardowych materiałów laboratoryjnych. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.