Rodopsyna kanałowa2 Stymulacja potencjałów synaptycznych w połączeniach nerwowo-mięśniowych Drosophila
March 16th, 2009
Ta procedura wykorzystuje aktywowany niebieskim światłem kanał glonów i narzędzia do ekspresji genetycznej specyficznej dla komórki, aby wywołać potencjały synaptyczne za pomocą impulsów świetlnych na złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) u larw Drosophila. Technika ta jest niedrogą i łatwą w użyciu alternatywą dla stymulacji elektrodami ssącymi w badaniach fizjologii synaptycznej w laboratoriach badawczych i dydaktycznych.
Ta procedura rozpoczyna się od uprawy drosophila. Po trzecie, larwy z odpowiednim genotypem na żywności zawierającej cały trans retinol. Każdy robak jest przypięty głową i ogonem.
Następnie FLA flat. Mózg i nerwy tylne są następnie przecinane, aby zatrzymać rytmiczną aktywność motoryczną. Następnie niebieskie źródło światła LED ze skrzynką sterującą jest regulowane i skupiane na preparacji.
Na koniec użyj ostrej elektrody, aby przebić mięsień szósty. Następnie dostarczaj impulsy świetlne ze źródłem napięcia. Cześć, nazywam się Nicholas Marstein i pracuję w laboratorium dr Leslie Griffith na Wydziale Biologii Uniwersytetu Brandeis.
Cześć, nazywam się Stefan Pulver i również pracuję w Griffith Lab. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę wywoływania potencjałów synaptycznych z nieobecnym korzeniem kanałowym dwóch na złączu nerwowo-mięśniowym larwy Drosophila. Używamy tej procedury w naszym laboratorium do badania fizjologii synaptycznej i drosophila.
Używamy go również do nauczania studentów fizjologii synaptycznej i nauczania laboratoriów. Więc zacznijmy. Aby rozpocząć korzystanie z tego protokołu, utrzymuj kanał UAS czerwony w dwóch i w porządku, 3 7, 1 gal cztery linie muchowe w oddzielnych butelkach zawierających standardowe podłoże muchowe.
Zbieraj dziewice z, okej, 3 7, 1 gal, czterech linek muchowych i samców z kanału UAS redsin. Dwie linie. Następnie przygotuj pożywkę muchową, która jest zmieszana z jednym milimolem, całym trans retinolem lub TR.To zrób to, rozpuść zwykłe podłoże muchowe w kuchence mikrofalowej przez około minutę.
Po stopieniu pozostaw pożywkę do ostygnięcia przez około 30 do 60 sekund, a następnie dodaj 100 mikrolitrów 100 milimolów TR w 100% etanolu na każde 10 mililitrów pożywki muchowej. Gdy fiolki zawierające pożywkę TR są gotowe, umieścić zebrane samce i samice w każdej fiolce. Umieść fiolki w ciemnym miejscu w temperaturze od 22 do 25 stopni Celsjusza, aby muchy mogły się połączyć w pary i złożyć jaja, poczekać od czterech do pięciu dni, aż pojawią się larwy trzeciej w gwiaździstej gwiazdie.
W tym momencie możesz pozbyć się dorosłych much. Jesteśmy teraz gotowi do przystąpienia do montażu stanowiska do elektrofizjologii. Przymocuj dowolny okular lunety sekcyjnej do niebieskiego źródła światła LED z radiatorem.
Użyj słupka i zacisku, aby przymocować podstawę magnetyczną do okularu i źródła światła LED. Umieść podstawę magnetyczną na stole powietrznym stanowiska do elektrofizjologii. Następnie podłącz źródło światła do obwodu sterującego, a następnie podłącz obwód sterujący do zewnętrznego źródła napięcia.
Korzystamy z napięcia wyjściowego z systemu akwizycji danych elektrofizjologicznych laboratorium energetycznego wykonanego przez przyrządy reklamowe. Po podłączeniu do źródła napięcia należy podać od jednego do pięciu impulsów woltowych do obwodu sterującego, aby aktywować niebieskie światło, wyregulować podstawę magnetyczną i źródło światła, aż wiązka niebieskiego światła skupi się na obszarze, który ma być zajęty przez rozwarstwienie larwy. Po dokonaniu odpowiednich regulacji jesteśmy gotowi przejść do sekcji larw.
Aby rozpocząć sekcję, umieść sześć 0,1 milimetrowych szpilek w podłodze naczynia wyłożonego sogrem. Usuń jedną trzecią larw gwiazd z podłoża spożywczego i umieść ją na dowolnej plastikowej szalce Petriego. Opłucz larwy solą fizjologiczną, aby usunąć wszelkie pokarmy, które są przyczepione do larw.
Następnie umieść larwy w naczyniu preparacyjnym w pobliżu wyciągniętych szpilek i napełnij naczynie do połowy solą fizjologiczną. Teraz ustaw larwy tak, aby zobaczyć dwie srebrzyste rurki biegnące wzdłuż grzbietowej powierzchni zwierzęcia. Te srebrzyste rurki to tchawica.
Włóż dużą szpilkę bezpośrednio do ogona między rurkami dotchawiczy. Przytrzymaj larwy i umieść drugą dużą szpilkę w jego głowie. Pamiętaj, aby rozciągnąć korpus wzdłuż podczas wkładania kołka.
Użyj nożyczek, aby zrobić małe nacięcie w pobliżu ogona. Kontynuuj nacięcie wzdłuż ciała. Upewnij się, że końcówki nożyczek są uniesione, aby uniknąć przecięcia nerwów brzusznych i/lub mięśni ściany ciała.
Umieść cztery szpilki na czterech rogach zwierząt. Teraz otwórz środek. Umieść szpilki w naczyniu sekcyjnym tak, aby filetować zwierzę.
Przypnij również preparat tak, aby był nauczany za pomocą kleszczy i nożyczek. Usuń ciało, narządy trawienne, tchawicę i ciała tłuszczowe. Opłucz preparat solą fizjologiczną.
Po spłukaniu zlokalizuj płaty czołowe i zwój brzuszny preparatu za pomocą mikronożyczek. Ostrożnie przeciąć zwój brzuszny tuż za płatami czołowymi. Po zakończeniu sekcji przystąp do stymulacji światłem niebieskim i nagrywania mięśni.
Aby wykonać zapis mięśni, pociągnij elektrodę rezystancyjną o impedancji od 10 do 20 megaomów. Za pomocą elektronicznego ściągacza elektrod napełnij wyciągniętą elektrodę trzema molowymi KCL. Umieść napełnioną elektrodę w uchwycie elektrody.
Teraz umieść preparat larwalny pod mikroskopem preparacyjnym na platformie. Dostosuj niebieskie światło tak, aby wypreparowany preparat był wyśrodkowany w wiązce światła. Zidentyfikuj mięsień szósty lub M szósty w dowolnym segmencie ściany ciała larwy za pomocą mikromanipulatora, ostrożnie włóż elektrodę do mięśnia M sześć i obserwuj szybką hiperpolaryzację mięśnia.
Spoczynkowe potencjały błonowe powinny wynosić od minus 30 miliwoltów do minus 70 miliwoltów. Po prawidłowym włożeniu elektrody podaj od 20 do 100 milisekundowych impulsów napięciowych do obwodu sterującego. Stopniowo zwiększaj napięcie dostarczane do obwodu sterującego.
Obserwuj potencjały połączeń exci w komórce mięśniowej. Oto reprezentatywny wynik, który pokazuje potencjał złącza exci wywołany przez krótkie impulsy świetlne. Pokazana tutaj amplituda potencjału złącza exci jest zsumowaną amplitudą z dwóch neuronów ruchowych, o których wiadomo, że jedzą.
M sześć. Niższe natężenia lub krótsze czasy świecenia mogą ujawnić potencjał połączenia pobudzającego o mniejszej amplitudzie z pojedynczego neuronu ruchowego. Właśnie pokazaliśmy, jak wykonać drogę kanałową bez dwóch zapośredniczonych stymulacji potencjałów synaptycznych w połączeniu nerwowo-mięśniowym oph.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie uszkodzić ściany ciała preparatu podczas sekcji. Ważne jest również, aby pamiętać, że chociaż prep może być nadmiernie podekscytowany po sekcji, z czasem uspokoi się i pozwoli na dobre nagrania. Podczas wbijania mięśni należy uważać, aby nie zejść poniżej pierwszej warstwy mięśni w ścianę ciała.
Kiedy elektroda jest wbita w ścianę ciała. Czasami można uzyskać hiperspolaryzowane potencjały, ale nie być w rzeczywistości w komórce mięśniowej. Więc to wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ta procedura wykorzystuje kanał alg aktywowany niebieskim światłem i narzędzia ekspresji genów specyficznych dla komórek, aby wywołać potencjały synaptyczne impulsami światła na złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) w larwach Drosophila. Technika ta jest niedrogi i łatwym w użyciu alternatywą dla stymulacji elektrodą ssącą w badaniach fizjologii synaps w laboratoriach badawczych i dydaktycznych.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Fizjologia synaps
- Ekspresja genów
Tło
- Larwy Drosophila są powszechnie używane w badaniach neuronauk.
- Kanałami aktywowanymi światłem zapewnia się nieinwazyjną metodę badania aktywności synaptycznej.
- Tradycyjne metody, takie jak stymulacja elektrodą ssącą, mogą być skomplikowane i drogie.
- Celem tej procedury jest uproszczenie procesu wywoływania potencjałów synaptycznych.
Cel badania
- Opracowanie metody badania fizjologii synaps za pomocą stymulacji światłem.
- Zaoferowanie dostępnej alternatywy do celów edukacyjnych i badawczych.
- Zgłębienie zrozumienia mechanizmów synaptycznych w złączu nerwowo-mięśniowym.
Stosowane metody
- Hodowla larw Drosophila na określonym pokarmie.
- Układanie larw w celu przygotowania do stymulacji.
- Przekrojenie mózgu i nerwów tylnych w celu zatrzymania aktywności motorycznej.
- Użycie niebieskiego źródła światła LED do wywoływania potencjałów synaptycznych.
Główne wyniki
- Udane wywołanie potencjałów synaptycznych za pomocą impulsów światła.
- Demonstracja skuteczności niebieskiego kanału aktywowanego algami.
- Walidacja metody jako niezawodnej alternatywy dla tradycyjnych technik.
- Możliwość szerszych zastosowań w badaniach fizjologii synaps.
Wnioski
- Metoda aktywowania światłem jest skuteczna w badaniu fizjologii złącza nerwowo-mięśniowego.
- To podejście może ułatwić badania i nauczanie w dziedzinie neuronauki.
- Przyszłe badania mogą zgłębiać dodatkowe zastosowania tej techniki.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables non-invasive, light-based stimulation of synaptic activity in a genetically tractable model, reducing technical barriers in neurophysiology workflows. It supports reproducible data generation for target validation in early discovery, particularly where manual electrode manipulation limits throughput or training efficiency. The approach enhances predictive confidence by providing a standardized, scalable alternative to suction electrode stimulation in Drosophila neuromuscular junction studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of synaptic transmission mechanisms through precise, light-controlled neuronal activation.
- Operational Value: Reduces reliance on technically demanding suction electrode manipulation, improving assay consistency across users.
- Strategic Value: Supports high-fidelity phenotypic screening of genetic or pharmacological modifiers of synaptic function.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable excitatory junctional potentials (EJPs) as a direct readout of neuromuscular transmission efficacy.
- Operational Value: Enables standardized stimulation parameters via blue LED pulse control, improving inter-experiment reproducibility.
- Strategic Value: Facilitates assay miniaturization and adaptation for compound screening in Drosophila-based neurotoxicity or neurotherapeutic screens.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system for studying conserved synaptic pathways with genetic accessibility.
- Operational Value: Allows longitudinal tracking of synaptic phenotypes in larval models with minimal preparation variability.
- Strategic Value: Supports mechanistic de-risking of targets involved in neuromuscular transmission or neurotransmitter release.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows as a stimulation modality for assessing synaptic function prior to lead optimization stages.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of neuronal excitability and synaptic vesicle release mechanisms via controlled light pulses.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable EJP amplitudes suitable for evaluating genetic or chemical perturbations.
- Analytics: Produces continuous voltage trace outputs enabling amplitude, rise time, and frequency analysis of synaptic events.
- Translational Research: Connects to conserved synaptic mechanisms relevant to human neuromuscular disorders through genetic orthology.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable stimulation platform adaptable across multiple larval genotypes and experimental conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing measurement variability from electrode placement artifacts.
- Operational Value: Improves lab throughput and training efficiency in teaching and research settings through simplified stimulation setup.
- Strategic Value: Lowers technical barriers to synaptic physiology assays, enabling broader team access and cross-functional collaboration.
- Portfolio Impact: Supports go/no-go decisions in target prioritization by providing reliable, high-fidelity synaptic readouts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila genetics, electrophysiology, and optical stimulation systems.
- Needs blue LED light source, voltage control circuit, and saline-based electrophysiology rig.
- Demands standardization of retinal feeding, larval staging, and dissection protocols across users.
- Limited to superficial muscle targets due to light penetration constraints in intact preparations.
- Dependent on functional ChR2 expression and co-factor (all-trans retinal) availability in motor neurons.
