Stymulacja potencjałów synaptycznych w złączach nerwowo-mięśniowych Drosophila za pośrednictwem kanalorodopsyny 2

Procedura ta rozpoczyna się od hodowli muszek owocowych. Larwy trzeciego stadium o odpowiednim genotypie hoduje się na pożywce zawierającej all-trans-retinol. Każda larwa zostaje unieruchomiona szpilkami za głowę i ogon.

Następnie ułożono FLA płasko. Mózg oraz nerwy tylne zostały przecięte, aby zatrzymać rytmiczną aktywność motoryczną. W następnej kolejności niebieskie źródło światła LED z jednostką sterującą zostało dostrojone i skupione na preparacie.

Na koniec należy użyć ostrej elektrody, aby przebić mięsień szósty. Następnie podaje się impulsy światła za pomocą źródła napięcia. Witam, jestem Nicholas Marstein z laboratorium dr Leslie Griffith z Katedry Biologii na Uniwersytecie Brandeis.

Witajcie, jestem Stefan Pulver z laboratorium Griffitha. Dzisiaj przedstawimy procedurę wywoływania potencjałów synaptycznych przy braku kanałów root absent two w złączu nerwowo-mięśniowym larwy drosophila. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania fizjologii synaptycznej u drosophila.

Używamy go również do nauczania studentów fizjologii synaptycznej oraz w ramach zajęć laboratoryjnych. Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć ten protokół, należy utrzymywać linie muszek UAS channel redsin two oraz 3 7, 1 gal four w osobnych butelkach zawierających standardowe pożywkę dla muszek.

Zbierz dziewice z linii 3 7, 1 gal i czterech linii much oraz samce z dwóch linii UAS channel redsin. Następnie przygotuj pożywkę dla much wymieszaną z 1 mM all-trans-retinolem (ATR). Aby to zrobić, rozpuść zwykłą pożywkę dla much w kuchence mikrofalowej przez około jedną minutę.

Po stopieniu należy pozwolić pożywce ostygnąć przez około 30 do 60 sekund, a następnie dodać 100 µL 100 mM a TR w 100% etanolu na każde 10 mL pożywki dla muszek. Gdy fiolki zawierające pożywkę z a TR będą gotowe, należy umieścić w każdej z nich zebrane samce i samice. Fiolki należy umieścić w ciemnym miejscu w temperaturze od 22 do 25 °C, aby umożliwić muszkom kopulację i zniesienie jaj, a następnie odczekać cztery do pięciu dni, aż pojawią się larwy trzeciego stadium.

Na tym etapie można zutylizować dorosłe muchy. Jesteśmy teraz gotowi do przygotowania zestawu do elektrofizjologii. Do źródła światła LED o barwie niebieskiej z radiatorem przymocuj okular dowolnego mikroskopu sekcyjnego.

Za pomocą trzpienia i zacisku przymocuj podstawę magnetyczną do okularu oraz źródła światła LED. Umieść podstawę magnetyczną na stole pneumatycznym zestawu do elektrofizjologii. Następnie podłącz źródło światła do obwodu sterującego, a obwód sterujący do zewnętrznego źródła napięcia.

Wykorzystujemy wyjście napięciowe z systemu akwizycji danych elektrofizjologicznych PowerLab firmy AD Instruments. Po podłączeniu do źródła napięcia, podajemy impulsy od 1 do 5 V do obwodu sterującego, aby aktywować niebieskie światło, a następnie regulujemy podstawę magnetyczną oraz źródło światła, aż wiązka niebieskiego światła zostanie skupiona na obszarze, w którym zostanie przeprowadzona sekcja larwy. Po dokonaniu odpowiednich regulacji możemy przejść do sekcji larwy.

Aby rozpocząć sekcję, umieść sześć szpilek o grubości 0,1 mm w dnie naczynia wyłożonego agarosem. Wyjmij larwy trzeciego stadium gwiazdowego z pożywki i umieść je w dowolnej plastikowej szalce Petriego. Przepłucz larwy solą fizjologiczną, aby usunąć przyklejone do nich resztki pożywki.

Następnie umieszczono larwy w naczyniu sekcyjnym obok wbitych szpilek i napełniono naczynie do połowy solą fizjologiczną. Teraz należy zorientować larwy tak, aby widoczne były dwie srebrzyste rurki biegnące wzdłuż grzbietowej powierzchni zwierzęcia. Te srebrzyste rurki to tchawki.

Wbij dużą szpilkę bezpośrednio w odwłok, pomiędzy tchawki. Przytrzymaj larwę i wbij drugą dużą szpilkę w jej głowę. Należy upewnić się, że ciało jest rozciągnięte wzdłuż podczas wbijania szpilki.

Za pomocą nożyczek wykonaj małe nacięcie w pobliżu ogona. Kontynuuj nacinanie wzdłuż ciała. Upewnij się, że końcówki nożyczek są uniesione, aby uniknąć przecięcia nerwów brzusznych i/lub mięśni ściany ciała.

Umieść cztery szpilki w czterech narożnikach ciała zwierzęcia. Następnie rozetnij środkową część ciała. Wbij szpilki w zgłębnik sekcyjny w taki sposób, aby rozłożyć zwierzę na płasko.

Następnie przypnij preparat w taki sposób, aby można było go badać za pomocą pęsety i nożyczek. Usuń narządy trawienne zwierzęcia, tchawicę oraz ciała tłuszczowe. Przepłucz preparat solą fizjologiczną.

Po wypłukaniu, zlokalizuj płaty czołowe i zwoje brzuszny preparatu za pomocą mikronozyciórek. Ostrożnie przetnij zwoje brzuszny tuż za płatami czołowymi. Po zakończeniu dyssekcji przystąp do stymulacji światłem niebieskim i rejestracji aktywności mięśni.

Aby przeprowadzić rejestrację z mięśnia, należy wyciągnąć elektrodę o oporności od 10 do 20 MΩ. Przy użyciu elektronicznego wyciągacza elektrod należy napełnić wyciągniętą elektrodę 3 M KCL. Napełnioną elektrodę należy umieścić w uchwycie do elektrod.

Teraz umieść preparat larwalny na statywie pod mikroskopem stereoskopowym. Ustaw niebieskie światło tak, aby preparowany fragment znajdował się w centrum wiązki świetlnej. Zidentyfikuj mięsień szósty (M6) w dowolnym segmencie ściany ciała larwy, a następnie za pomocą mikromanipulatora ostrożnie wprowadź elektrodę do M6 i obserwuj szybką hiperpolaryzację mięśnia.

Potencjały spoczynkowe błony powinny mieścić się w zakresie od -30 mV do -70 mV. Po prawidłowym wprowadzeniu elektrody należy podać do obwodu sterującego impulsy napięcia o czasie trwania od 20 do 100 ms. Stopniowo zwiększaj napięcie podawane do obwodu sterującego.

Obserwuj potencjały złącza pobudzającego w komórce mięśniowej. Poniżej przedstawiono reprezentacyjny wynik obrazujący potencjał złącza pobudzającego wywołany krótkimi impulsami światła. Amplituda potencjału złącza pobudzającego pokazana tutaj jest sumaryczną amplitudą z dwóch neuronów ruchowych, o których wiadomo, że ulegają aktywacji.

M sześć. Niższe natężenia lub krótszy czas trwania światła mogą odsłonić pobudzający potencjał złącza o mniejszej amplitudzie pochodzący z pojedynczego neuronu ruchowego. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić stymulację potencjałów synaptycznych za pośrednictwem kanałów rodopsyny 2 w złączu nerwowo-mięśniowym ryby oph.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o tym, by nie uszkodzić ściany ciała preparatu podczas sekcji. Należy również pamiętać, że choć preparat może być nadmiernie pobudzony bezpośrednio po sekcji, z czasem się uspokoi, co umożliwi wykonanie wysokiej jakości pomiarów. Podczas nakłuwania mięśni należy uważać, aby nie przebić pierwszej warstwy mięśni i nie wprowadzić igły do ściany ciała.

W sytuacji, gdy elektroda utknie w ścianie ciała, można czasami zarejestrować potencjały hiperpolaryzacyjne, mimo że w rzeczywistości nie znajduje się w komórce mięśniowej. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.