Name: Rodopsyna kanałowa2 Stymulacja potencjałów synaptycznych w połączeniach nerwowo-mięśniowych Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-16T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę stymulacji potencjałów synaptycznych w połączeniach nerwowo-mięśniowych Drosophila przy użyciu światła niebieskiego i kanału rodopsynowego. Technika ta stanowi prostą alternatywę dla elektrod ssących w badaniach fizjologii synaptycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty National Institutes of Health RO1GM-33205 oraz MH-067284 przyznane L.C. Griffith oraz przez letnie stypendium badawcze dla studentów Uniwersytetu Brandeis przyznane N. J. Hornstein. Wstępne eksperymenty dla tej techniki zostały przeprowadzone w Marine Biological Laboratory w ramach letniego kursu Neural Systems and Behavior w 2008 roku (grant NIMH: R25 MH059472) w Woods Hole, MA.

Część 1: Opieka nad zwierzętami i krzyżówki genetyczne
<ol>
<li>Utrzymywać linie muszek UAS-ChR2 oraz OK371-GAL4 w oddzielnych butelkach zawierających standardową pożywkę dla muszek 8.</li>
<li> zebrać dziewice z linii OK371-GAL4 oraz samce z linii UAS-ChR2.</li>
<li>Przenieść samce i samice do fiolki zawierającej standardową pożywkę dla muszek zmieszaną z 1 mM all-trans retinalu (ATR). Pożywkę z ATR należy przygotować, najpierw roztopiąc zwykłą pożywkę dla muszek w mikrofalówce przez ok. 1 minutę. Po roztopieniu odstawić do ostygnięcia na około 30 sekund do jednej minuty, a następnie dodać 100 μl 100 mM ATR w 100% ETOH na każde 10 ml pożywki. Fiolki umieścić na lodzie, a następnie przechowywać w ciemnym miejscu w temperaturze 4°C.</li>
<li>Pozostawić muszki do kopulacji i składania jaj w ciemnym miejscu w temperaturze 22-25°C.</li>
<li>Odczekać 3-4 dni, aż pojawią się larwy trzeciego stadium; w tym momencie usunąć dorosłe muszki.</li>
</ol>
Część 2: Konfiguracja zestawu
<ol>
<li>Zamocuj dowolny okular mikroskopu stereoskopowego 10x (w naszym przypadku firmy Carl Zeiss Inc., www.zeiss.com, Thornwood, NY) do niebieskiego źródła światła LED z radiatorem (Thor labs, www.thorlabs.com, Newton, NJ). Przymocuj całość do podstawy magnetycznej za pomocą słupka i zacisku. Przykryj radiator ekranem uziomowanym elektrycznie, aby zredukować szumy elektryczne generowane przez źródło światła.</li>
<li>Umieść podstawę magnetyczną ze źródłem światła na stole pneumatycznym zestawu do elektrofizjologii.</li>
<li>Podłącz źródło światła do obwodu sterującego, a obwód sterujący do zewnętrznego źródła napięcia (Powerlab 4/30, ADInstruments, www.adinstruments.com, Colorado Springs, CO).</li>
<li>Podawaj impulsy 1-5 V do obwodu sterującego, aby aktywować niebieskie światło.</li>
<li>Reguluj położenie podstawy magnetycznej i źródła światła, aż wiązka niebieskiego światła zostanie skupiona na obszarze, w którym przeprowadzana będzie sekcja larwy.</li>
</ol>
Część 3: Disekcja
<ol>
<li>Wbij sześć szpilek entomologicznych 0,1 mm w dno naczynia wyłożonego sylgardem.</li>
<li>Wyjmij larwę w 3rd stadium z podłoża pożywkowego i umieść w dowolnej plastikowej płytce Petriego.</li>
<li>Opłucz larwę solą fizjologiczną, aby usunąć resztki pokarmu.</li>
<li>Umieść larwę w naczyniu do sekcji w pobliżu wbitych szpilek i wypełnij naczynie solą fizjologiczną do ½ poziomu.</li>
<li>Uorientuj larwę tak, aby widoczne były dwie srebrzyste rurki (tchawice) biegnące wzdłuż grzbietowej strony zwierzęcia.</li>
<li>Wbij dużą szpilkę bezpośrednio w odwłok pomiędzy rurkami tchawic. Przytrzymaj larwę i wbij drugą dużą szpilkę w głowę, dbając o to, aby ciało było rozciągnięte wzdłuż jego osi.</li>
<li>Wykonaj niewielkie nacięcie w pobliżu odwłoka, a następnie kontynuuj je wzdłuż ciała. Upewnij się, że końcówki nożyczek są uniesione, aby nie przeciąć przypadkowo nerwów brzusznych i/lub mięśni ściany ciała.</li>
<li>Wbij cztery szpilki w czterech rogach teraz otwartej środkowej części ciała zwierzęcia. Przymocuj je do naczynia do sekcji w taki sposób, aby rozpołowić zwierzę. Napięty preparat musi być dobrze unieruchomiony.</li>
<li>Za pomocą pęsety i nożyczek usuń jelita, tchawice i ciała tłuszczowe zwierzęcia.</li>
<li>Opłucz preparat solą fizjologiczną.</li>
<li>Zlokalizuj płaty czołowe (widoczne na Rys. A) oraz zwoj brzuszny preparatu.</li>
<li>Używając mikronożyczek, ostrożnie przetnij zwoj brzuszny tuż za płatami czołowymi.</li>
</ol>
Część 4: Rejestracja aktywności mięśni i stymulacja światłem niebieskim
<ol>
<li>Wytwarz elektrodę o średnicy 10-20 μω za pomocą elektronicznego wyciągacza elektrod (Sutter Instruments).</li>
<li>Wypełnij wyciągniętą elektrodę 3 M KCl.</li>
<li>Umieść wypełnioną elektrodę w uchwycie i za pomocą mikromanipulatora skieruj końcówkę elektrody w stronę preparatu larwalnego pod mikroskopem stereoskopowym na stanowisku do elektrofizjologii.</li>
<li>Zidentyfikuj mięsień 6 (M6) w dowolnym segmencie ściany ciała (Rys. A).</li>
<li>Ostrożnie wprowadź elektrodę do M6 i obserwuj gwałtowną hiperpolaryzację. Potencjały spoczynkowe błony mięśniowej powinny mieścić się w zakresie od -30 mV do -70 mV.</li>
<li>Ustaw światło niebieskie tak, aby preparat znajdował się w centrum wiązki światła.</li>
<li>Podawaj impulsy napięcia o czasie trwania 20-100 ms do obwodu sterującego. Stopniowo zwiększaj napięcie dostarczane do obwodu sterującego. Obserwuj pobudzające potencjały złączeniowe w komórce mięśniowej (Rysunek 1B).</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Rysunek 1A przedstawia schemat układu rejestracyjnego oraz preparat z usuniętą skórą. Rysunek 1B przedstawia typowy EJP wywołany krótkimi impulsami światła. Przedstawiona amplituda EJP jest sumaryczną amplitudą z dwóch neuronów ruchowych, o których wiadomo, że oba unerwiają M6. Niższe natężenia światła aktywowały tylko jedną jednostkę ruchową (dane nie zostały przedstawione).
<img src="/files/ftp_upload/1133/figure1.png" alt="Schemat eksperymentu optogenetycznego: układ stymulacji nerwu i wykres odpowiedzi napięciowej, impuls 40 ms." width="600" height="373" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1">
Rycina 1: A) Ogólny schemat układu do rejestracji wewnątrzkomórkowej z niebieską diodą LED. Mózg (Br) zostaje usunięty, aby zahamować aktywność rytmiczną w zwoju brzusznym (VG). ChR2 jest eksprymowana w neuronach ruchowych z wykorzystaniem systemu GAL4-UAS. B) Rejestracja wewnątrzkomórkowa z mięśnia M6. 40 ms impulsy niebieskiego światła (o natężeniu 127 µW / mm2) niezawodnie wywołują duże potencjały synaptyczne (gwiazdki) w M6.

<ol><li>Keshishian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545(1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35(2007).</li>
<li>Lagow, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+a+hydrophobic+layer+by+a+point+mutation+in+syntaxin+1A+regulates+the+rate+of+synaptic+vesicle+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Modification of a hydrophobic layer by a point mutation in syntaxin 1A regulates the rate of synaptic vesicle fusion.</a> PLoS Biol. 5 (4), e72(2007).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activation+of+channelrhodopsin-2+in+excitable+cells+of+Caenorhabditis+elegans+triggers+rapid+behavioral+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light activation of channelrhodopsin-2 in excitable cells of Caenorhabditis elegans triggers rapid behavioral responses.</a> Curr Biol. 15 (24), 2279(2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940(2003).</li>
<li>Schroll, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-induced+activation+of+distinct+modulatory+neurons+triggers+appetitive+or+aversive+learning+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-induced activation of distinct modulatory neurons triggers appetitive or aversive learning in Drosophila larvae.</a> Curr Biol. 16 (17), 1741(2006).</li>
<li>Lin, D. M., Auld, V. J., Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+neuronal+cell+ablation+in+the+Drosophila+embryo%3A+pathfinding+by+follower+growth+cones+in+the+absence+of+pioneers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Targeted neuronal cell ablation in the Drosophila embryo: pathfinding by follower growth cones in the absence of pioneers.</a> Neuron. 14 (4), 707(1995).</li>
<li>Ralph Greenspan, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRalph+Greenspan%2C++%22Fly+Pushing%3A+The+Theory+and+Practice+of+Drosophila+Genetics%2C+2nd+ed%22">Fly Pushing: The Theory and Practice of Drosophila Genetics, 2nd ed</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2004).</li>
</ol>

Nie mamy żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Kluczowe etapy obejmują zarówno wstępną sekcję, jak i wprowadzenie do komórek mięśniowych. Jeśli podczas wstępnej sekcji dojdzie do przecięcia nerwów lub uszkodzenia mięśnia, kontynuowanie dalszej części eksperymentu jest utrudnione. Podczas sekcji należy zachować szczególną ostrożność i kierować nożyczki sekcyjne tak bardzo w górę, jak to możliwe, podczas nacięcia grzbietowego. W drugim kluczowym kroku, czyli wprowadzaniu do komórki mięśniowej, należy obserwować hiperpolaryzację przekraczającą ~30 mV. Wartości powyżej -...

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>4019862</td><td>&lt;a href="http://www.ellsworth.com" target="_blank"&gt;www.ellsworth.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Pins Minutens</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10</td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Płytka do sekcji</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fishersci.com" target="_blank"&gt;www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Wzmacniacz wewnątrzkomórkowy i głowica Neuroprobe</td><td>A-M Systems</td><td>680100</td><td>&lt;a href="http://www.a-msystems.com" target="_blank"&gt;www.a-msystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com/products/hardware/corporate/product/ML866/" target="_blank"&gt;System akwizycji danych Powerlab 4/30&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> ADInstruments</a></td><td></td><td>&lt;a href="http://www.adinstruments.com" target="_blank"&gt;www.adinstruments.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Stymulator Grass</td><td>Grass Technologies</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.grasstechnologies.com" target="_blank"&gt;www.grasstechnologies.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Komputer stacjonarny</td><td>Dell</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.dell.com" target="_blank"&gt;www.dell.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Mikroskop do sekcji</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Źródło światła</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>41446-062</td><td>&lt;a href="http://www.dolan-jenner.com" target="_blank"&gt;www.dolan-jenner.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Pożywka dla muszek</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>All-Trans-Retinal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>116-31-4</td><td>&lt;a href="http://www.sigmaaldrich.com" target="_blank"&gt;www.sigmaaldrich.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;OK-371 Gal4&lt;/em&gt; Muszki</td><td>Bloomington Stock center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;UAS-ChR2&lt;/em&gt; Muszki</td><td>Fiala lab, Griffith lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Układ sterujący LED</td><td>Zbudowany w Griffith lab</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.ledsupply.com" target="_blank"&gt;http://www.ledsupply.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;&lt;a href="http://www.futureelectronics.com" target="_blank"&gt;http://www.futureelectronics.com&lt;/a&gt;&lt;br/&gt;Składa się z: &lt;br/&gt;1. Przetwornica Buck Puck 200 mA&lt;br/&gt;2. Niebieska dioda LED&lt;br/&gt;3. Przewód izolowany&lt;br/&gt;4. Płytka stykowa&lt;br/&gt;</td></tr><tr><td>Radiator LED</td><td>Thorlabs Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.thorlabs.com/" target="_blank"&gt;http://www.thorlabs.com/&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Stół pneumatyczny</td><td>TMC</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html" target="_blank"&gt;http://www.techmfg.com/products/accessories/intro3.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>Zbudowana w Griffith lab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator Leica Leitz M</td><td>Leica Microsystems</td><td>ACS01</td><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com" target="_blank"&gt;www.leica-microsystems.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Uchwyt do elektrod</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.axon.com" target="_blank"&gt;www.axon.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Szkło borokrzemowe</td><td>FHC, Inc.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.fh-co.com/p14-15.pdf" target="_blank"&gt;www.fh-co.com/p14-15.pdf&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Wytwornica elektrod</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.sutter.com" target="_blank"&gt;www.sutter.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna HL 3.1 z 0.8mM Ca2+</td><td></td><td></td><td>Skład (mM):&lt;br/&gt; NaCl:70 KCl:5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;: 0.8&lt;br/&gt; MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;:4 Sucroza:115&lt;br/&gt;NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;: 10 Trehaloza: 5 HEPES</td></tr><tr><td>Narzędzia do mikrosekcji</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>&lt;a href="http://www.finescience.com" target="_blank"&gt;www.finescience.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

stymulacja potencjałów synaptycznych w złączach nerwowo-mięśniowych drosophila za pośrednictwem kanalorodopsyny 2

Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions

TheDrosophilapreparat nerwowo-mięśniowy larwy okazał się użytecznym narzędziem do badania fizjologii synaptycznej1,2,3Obecnie jedynym dostępnym sposobem wywoływania pobudzeniowych potencjałów złączeniowych (EJP) w tej preparacji jest zastosowanie elektrod ssących. Zarówno w laboratoriach badawczych, jak i dydaktycznych, studenci często mają trudności z manewrowaniem i manipulowaniem tego typu elektrodami stymulującymi. W niniejszej pracy pokazujemy, jak zdalnie stymulować potencjały synaptyczne w larwalnym NMJ bez użycia elektrod ssących. Poprzez ekspresję channelrhodopsin2 (ChR2)4,5,6 w Drosophilaneurony ruchowe przy użyciuGAL4-UAS system 7or wprowadzając niewielkie zmiany w podstawowym zestawie do elektrofizjologii, zdołaliśmy niezawodnie wywoływać EJP za pomocą impulsów niebieskiego światła. Technika ta może być szczególnie użyteczna w laboratoriach dydaktycznych z zakresu neurofizjologii, gdzie czas praktyki studentów z aparaturą oraz dostępne zasoby są ograniczone.

W niniejszej procedurze wykorzystano aktywowany niebieskim światłem kanał glonowy oraz narzędzia do specyficznej dla komórek ekspresji genetycznej w celu wywołania potencjałów synaptycznych za pomocą impulsów świetlnych w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) u larw Drosophila. Technika ta stanowi niedrogą i łatwą w użyciu alternatywę dla stymulacji elektrodami ssącymi w badaniach nad fizjologią synaptyczną w laboratoriach badawczych i dydaktycznych.

Stymulacja potencjałów synaptycznych w złączach nerwowo-mięśniowych Drosophila za pośrednictwem kanalorodopsyny 2

Preparat nerwowo-mięśniowy larwy Drosophila okazał się użytecznym narzędziem do badania fizjologii synaptycznej1,2,3. Obecnie jedynym dostępnym sposobem...

Procedura ta rozpoczyna się od hodowli muszek owocowych. Larwy trzeciego stadium o odpowiednim genotypie hoduje się na pożywce zawierającej all-trans-retinol. Każda larwa zostaje unieruchomiona szpilkami za głowę i ogon.Następnie ułożono FLA płasko. Mózg oraz nerwy tylne zostały przecięte, aby zatrzymać rytmiczną aktywność motoryczną. W następnej kolejności niebieskie źródło światła LED z jednostką sterującą zostało dostrojone i skupione na preparacie.Na koniec należy użyć ostrej elektrody, aby przebić mięsień szósty. Następnie podaje się impulsy światła za pomocą źródła napięcia. Witam, jestem Nicholas Marstein z laboratorium dr Leslie Griffith z Katedry Biologii na Uniwersytecie Brandeis.Witajcie, jestem Stefan Pulver z laboratorium Griffitha. Dzisiaj przedstawimy procedurę wywoływania potencjałów synaptycznych przy braku kanałów root absent two w złączu nerwowo-mięśniowym larwy drosophila. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania fizjologii synaptycznej u drosophila.Używamy go również do nauczania studentów fizjologii synaptycznej oraz w ramach zajęć laboratoryjnych. Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć ten protokół, należy utrzymywać linie muszek UAS channel redsin two oraz 3 7, 1 gal four w osobnych butelkach zawierających standardowe pożywkę dla muszek.Zbierz dziewice z linii 3 7, 1 gal i czterech linii much oraz samce z dwóch linii UAS channel redsin. Następnie przygotuj pożywkę dla much wymieszaną z 1 mM all-trans-retinolem (ATR). Aby to zrobić, rozpuść zwykłą pożywkę dla much w kuchence mikrofalowej przez około jedną minutę.Po stopieniu należy pozwolić pożywce ostygnąć przez około 30 do 60 sekund, a następnie dodać 100 µL 100 mM a TR w 100% etanolu na każde 10 mL pożywki dla muszek. Gdy fiolki zawierające pożywkę z a TR będą gotowe, należy umieścić w każdej z nich zebrane samce i samice. Fiolki należy umieścić w ciemnym miejscu w temperaturze od 22 do 25 °C, aby umożliwić muszkom kopulację i zniesienie jaj, a następnie odczekać cztery do pięciu dni, aż pojawią się larwy trzeciego stadium.Na tym etapie można zutylizować dorosłe muchy. Jesteśmy teraz gotowi do przygotowania zestawu do elektrofizjologii. Do źródła światła LED o barwie niebieskiej z radiatorem przymocuj okular dowolnego mikroskopu sekcyjnego.Za pomocą trzpienia i zacisku przymocuj podstawę magnetyczną do okularu oraz źródła światła LED. Umieść podstawę magnetyczną na stole pneumatycznym zestawu do elektrofizjologii. Następnie podłącz źródło światła do obwodu sterującego, a obwód sterujący do zewnętrznego źródła napięcia.Wykorzystujemy wyjście napięciowe z systemu akwizycji danych elektrofizjologicznych PowerLab firmy AD Instruments. Po podłączeniu do źródła napięcia, podajemy impulsy od 1 do 5 V do obwodu sterującego, aby aktywować niebieskie światło, a następnie regulujemy podstawę magnetyczną oraz źródło światła, aż wiązka niebieskiego światła zostanie skupiona na obszarze, w którym zostanie przeprowadzona sekcja larwy. Po dokonaniu odpowiednich regulacji możemy przejść do sekcji larwy.Aby rozpocząć sekcję, umieść sześć szpilek o grubości 0,1 mm w dnie naczynia wyłożonego agarosem. Wyjmij larwy trzeciego stadium gwiazdowego z pożywki i umieść je w dowolnej plastikowej szalce Petriego. Przepłucz larwy solą fizjologiczną, aby usunąć przyklejone do nich resztki pożywki.Następnie umieszczono larwy w naczyniu sekcyjnym obok wbitych szpilek i napełniono naczynie do połowy solą fizjologiczną. Teraz należy zorientować larwy tak, aby widoczne były dwie srebrzyste rurki biegnące wzdłuż grzbietowej powierzchni zwierzęcia. Te srebrzyste rurki to tchawki.Wbij dużą szpilkę bezpośrednio w odwłok, pomiędzy tchawki. Przytrzymaj larwę i wbij drugą dużą szpilkę w jej głowę. Należy upewnić się, że ciało jest rozciągnięte wzdłuż podczas wbijania szpilki.Za pomocą nożyczek wykonaj małe nacięcie w pobliżu ogona. Kontynuuj nacinanie wzdłuż ciała. Upewnij się, że końcówki nożyczek są uniesione, aby uniknąć przecięcia nerwów brzusznych i/lub mięśni ściany ciała.Umieść cztery szpilki w czterech narożnikach ciała zwierzęcia. Następnie rozetnij środkową część ciała. Wbij szpilki w zgłębnik sekcyjny w taki sposób, aby rozłożyć zwierzę na płasko.Następnie przypnij preparat w taki sposób, aby można było go badać za pomocą pęsety i nożyczek. Usuń narządy trawienne zwierzęcia, tchawicę oraz ciała tłuszczowe. Przepłucz preparat solą fizjologiczną.Po wypłukaniu, zlokalizuj płaty czołowe i zwoje brzuszny preparatu za pomocą mikronozyciórek. Ostrożnie przetnij zwoje brzuszny tuż za płatami czołowymi. Po zakończeniu dyssekcji przystąp do stymulacji światłem niebieskim i rejestracji aktywności mięśni.Aby przeprowadzić rejestrację z mięśnia, należy wyciągnąć elektrodę o oporności od 10 do 20 MΩ. Przy użyciu elektronicznego wyciągacza elektrod należy napełnić wyciągniętą elektrodę 3 M KCL. Napełnioną elektrodę należy umieścić w uchwycie do elektrod.Teraz umieść preparat larwalny na statywie pod mikroskopem stereoskopowym. Ustaw niebieskie światło tak, aby preparowany fragment znajdował się w centrum wiązki świetlnej. Zidentyfikuj mięsień szósty (M6) w dowolnym segmencie ściany ciała larwy, a następnie za pomocą mikromanipulatora ostrożnie wprowadź elektrodę do M6 i obserwuj szybką hiperpolaryzację mięśnia.Potencjały spoczynkowe błony powinny mieścić się w zakresie od -30 mV do -70 mV. Po prawidłowym wprowadzeniu elektrody należy podać do obwodu sterującego impulsy napięcia o czasie trwania od 20 do 100 ms. Stopniowo zwiększaj napięcie podawane do obwodu sterującego.Obserwuj potencjały złącza pobudzającego w komórce mięśniowej. Poniżej przedstawiono reprezentacyjny wynik obrazujący potencjał złącza pobudzającego wywołany krótkimi impulsami światła. Amplituda potencjału złącza pobudzającego pokazana tutaj jest sumaryczną amplitudą z dwóch neuronów ruchowych, o których wiadomo, że ulegają aktywacji.M sześć. Niższe natężenia lub krótszy czas trwania światła mogą odsłonić pobudzający potencjał złącza o mniejszej amplitudzie pochodzący z pojedynczego neuronu ruchowego. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić stymulację potencjałów synaptycznych za pośrednictwem kanałów rodopsyny 2 w złączu nerwowo-mięśniowym ryby oph.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o tym, by nie uszkodzić ściany ciała preparatu podczas sekcji. Należy również pamiętać, że choć preparat może być nadmiernie pobudzony bezpośrednio po sekcji, z czasem się uspokoi, co umożliwi wykonanie wysokiej jakości pomiarów. Podczas nakłuwania mięśni należy uważać, aby nie przebić pierwszej warstwy mięśni i nie wprowadzić igły do ściany ciała.W sytuacji, gdy elektroda utknie w ścianie ciała, można czasami zarejestrować potencjały hiperpolaryzacyjne, mimo że w rzeczywistości nie znajduje się w komórce mięśniowej. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

channelrhodopsin2-mediated-stimulation-synaptic-potentials-at

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Stymulacja potencjałów synaptycznych za pośrednictwem Channelrhodopsin2 w złączach nerwowo-mięśniowych Drosophila

W niniejszej pracy opisujemy metody elektrofizjologiczne służące do pomiaru przekaźnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym larwy Drosophila. Uwalnianie wywołane inicjuje się sztucznie poprzez stymulację aksonów neuronów ruchowych, a przekaźnictwo w złączu NMJ można zmierzyć na podstawie odpowiedzi postsynaptycznej wywołanej w mięśniu.

Metody elektrofizjologiczne rejestracji potencjałów synaptycznych z złącza nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Ten film demonstruje technikę rejestrowania prądów synaptycznych z synaptycznego połączenia nerwowo-mięśniowego larwy Drosophila. Technika ta umożliwia monitorowanie aktywności pojedynczego bulionu synaptycznego, co jest ważne dla badania zmutowanych linii much o zwiększonej spontanicznej lub asynchronicznej aktywności synaptycznej.

Rejestrowanie prądów synaptycznych w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila

Tutaj opisujemy protokół optogenetycznej manipulacji aktywnością motoneuronalną podczas monitorowania zmian w wydatkach motorycznych (skurczu mięśni) u częściowo nienaruszonych larw Drosophila za pomocą laserów w konwencjonalnym mikroskopie konfokalnym. Technika ta umożliwia naukowcom osiągnięcie lokalnych zaburzeń aktywności neuronalnej w kilku neuromerach, aby wyjaśnić dynamikę obwodów motorycznych.

Optogenetyczne zaburzenia aktywności neuronalnej za pomocą oświetlenia laserowego u częściowo nienaruszonych larw Drosophila w ruchu

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Prądy synaptyczne mogą być rejestrowane ogniskowo z wizualizowanych bulionów synaptycznych w trzecim stadium rozwojowym połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila. Technika ta umożliwia monitorowanie aktywności pojedynczego bulionu synaptycznego.

Ogniskowe zapisy makroplastów prądów synaptycznych z połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Ten artykuł przedstawia metodę testowania połączeń monosynaptycznych między neuronami za pomocą tetrodotoksyny i kanału sodowego opornego na tetrodotoksynę, NaChBac.

Badanie połączeń monosynaptycznych u Drosophila przy użyciu kanałów sodowych opornych na tetrodotoksynę

Cykl pęcherzyków synaptycznych (SV) jest podstawowym mechanizmem komunikacji międzykomórkowej w synapsach neuronalnych. Wychwyt i uwalnianie barwnika FM są podstawowymi sposobami ilościowego oznaczania endo- i egzocytozy SV. Tutaj porównujemy wszystkie metody stymulacji w celu napędzania cyklu FM1-43 w synapsie modelu połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila (NMJ).

Cykl barwnika FM w synapsie: porównanie wysokiej depolaryzacji potasu, stymulacji elektrycznej i rodopsyny kanałowej

Mapowanie obwodów wspomaganych rodopsyną kanałową (CRACM) to precyzyjna technika funkcjonalnego mapowania projekcji neuronalnych dalekiego zasięgu pomiędzy anatomicznie i/lub genetycznie zidentyfikowanymi grupami neuronów. Tutaj opisujemy, jak wykorzystać CRACM do mapowania słuchowych połączeń pnia mózgu, w tym za pomocą opsyny przesuniętej ku czerwieni, ChrimsonR.

Mapowanie obwodów wspomaganych rodopsyną kanałową dalekiego zasięgu neuronów wzgórka dolnego z niebieskimi i czerwonymi rodopsynami kanałowymi

Przedstawiamy protokół do elektrofizjologicznego charakterystyki bistabilnych fotopigmentów: (i) wykorzystanie przemieszczeń ładunku w cząsteczkach fotopigmentu po absorpcji fotonów i ich ogromnej ilości w fotoreceptorach, oraz (ii) wykorzystanie różnic w widmach absorpcyjnych rodopsyny i metarodopsyny. Protokoły te są przydatne do badań przesiewowych pod kątem mutacji wpływających na bistabilne systemy fotopigmentowe.

Elektrofizjologiczne metody pomiaru poziomu fotopigmentu w fotoreceptorach Drosophila

Ten protokół ocenia aktywność synaptyczną funkcjonalną między określonymi partnerami neuronowymi in vivo w centralnym układzie nerwowym larw Drosophila melanogaster przy użyciu genetycznie zakodowanych narzędzi. Optogenetyczna stymulacja presynaptycznych cIVda neuronów sensorycznych za pomocą CsChrimson indukuje fotokonwersję zależną od wapnia CaMPARI w postsynaptycznych interneuronach Basin-4.

Charakterystyka funkcjonalna indywidualnych partnerów przed- i postsynaptycznych w Drosophila Ośrodkowym Układzie Nerwowym Larwalnym przy użyciu CaMPARI

Poznaj metodę stymulacji potencjałów synaptycznych w połączeniach nerwowo-mięśniowych Drosophila przy użyciu światła niebieskiego i kanału rodopsynowego. Technika ta stanowi prostą alternatywę dla elektrod ssących w badaniach fizjologii synaptycznej.

Stymulacja potencjałów synaptycznych w złączach nerwowo-mięśniowych Drosophila za pośrednictwem kanalorodopsyny 2

Przeglądaj więcej filmów