Name: Wytwarzanie miogennych konstruktów tkankowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 43 s
Description: Poznaj metodę wytwarzania kolagenowych konstruktów tkankowych zawierających myoblasty szkieletowe do naprawy bloku serca. Ta technika inżynierii tkankowej umożliwia tworzenie przewodów elektrycznych AV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca jest finansowana z grantów badawczych National Institutes of Health (HL068915; HL088206), nagrody New Researcher Award z Thrasher Research Fund oraz wpłat na Cardiac Conduction Fund w Children's Hospital Boston.

Część 1: Montaż form do odlewania konstrukcji
<ol>
	<li>Za pomocą żyletki przeciąć wzdłuż rurkę silikonową (VWR) i pociąć ją na odcinki o długości 3 cm.</li>
	<li>Nanieść kroplę silikonowego kleju RTV klasy implantacyjnej (Rhodia) do wnętrza każdego końca rurki.</li>
	<li>Szybko przyłożyć mały kawałek (1 cm x 1 cm) siatki poliestrowej (McMaster-Carr) do kropli kleju silikonowego i wyrównać go z końcem rurki. Zapewni to lekko podniesioną i płaską powierzchnię do mocowania konstruktu. Powtórzyć czynność na drugim końcu.</li>
	<li>Pozostawić formy do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez 3 dni. Zaleca się przygotowanie od 20 do 30 form jednocześnie, ponieważ są one w zasadzie jednorazowe.</li>
	<li>Po całkowitym wyschnięciu kleju przechowywać formy w zlewce wypełnionej 70% etanolem do momentu ich użycia. Krok ten pomoże wysterylizować formy; gotowy produkt przedstawiono na Rysunku 1.</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie do izolacji komórek mioblastów
<ol>
	<li>Rozpuścić 1 mg lamininy (Sigma) w 250 mL sterylizowanego filtrem 0,22 μm roztworu soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) zawierającego 1% penicyliny/streptomycyny (Invitrogen) i 1% Fungizone (Invitrogen).</li>
	<li>Pokryć płytki hodowlane o średnicy 150 mm (BD Falcon) 4 mL rozcieńczonego roztworu lamininy z kroku 1.1 i inkubować w temperaturze 37ºC przez co najmniej 4 godziny przed wysianiem pierwotnych mioblastów szkieletowych.</li>
	<li>Przygotować pożywkę do mioblastów, mieszając Ham’s F-10 Nutrient Mixture (Sigma) z 20% FBS (Atlanta Biologicals), 5 ng/L podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (Promega), 1% penicyliny/streptomycyny (Invitrogen) oraz 1% Fungizone (Invitrogen).</li>
	<li>Przygotować roztwór do trawienia mięśni szkieletowych, rozpuszczając 1 g kolagenazy 2 (~295 U/mg, Worthington) w 100 mL Dispase-2 (2,4 U/mL, Roche). Dodać 0,037 g CaCl2 i dokładnie wymieszać. Bufor do trawienia wysterylizować za pomocą dysku filtrującego 0,2 µm zamocowanego do strzykawki 10 mL, a następnie przechowywać alikwoty w temperaturze -20°C. Ilość potrzebną do trawienia tkanki umieścić w temperaturze 37°C wraz z pożywkami dla mioblastów.</li>
</ol>
Część 3: Izolacja mioblastów z mięśnia szkieletowego
<ol>
	<li>Za pomocą pęsety i małych nożyczek usunąć mięśnie przykręgosłupowe od martwych noworodkowych szczurów linii Lewis, nacinając grzbiet wzdłuż rdzenia kręgowego, odchylając warstwy skóry i powięzi, a następnie wycinając mięśnie.</li>
	<li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza umieścić wycięte mięśnie w probówce stożkowej 50 mL (BD Falcon) wypełnionej 40 mL 1X roztworem soli Hanksa (HBSS) (Invitrogen) w lodzie. Pozostawić paski mięśni do opadnięcia na dno probówki, a następnie ostrożnie usunąć większość cieczy i pozostałości krwi za pomocą odsysania próżniowego sterylną pipetą Pasteura w komorze do hodowli (Baker).</li>
	<li>Przenieść pobrane fragmenty mięśni na szalkę hodowlaną 150 mm i usunąć za pomocą odsysania jak najwięcej pozostałej cieczy. Przy użyciu 2 jednostronnych żyletek rozdrobnić tkankę do postaci gęstej pasty. Wlać podgrzany roztwór do trawienia na pastę i przenieść mieszaninę do nowej probówki 50 mL za pomocą pipety 10 mL. Podczas trawienia enzymatycznego tkankę okresowo homogenizować (bez napowietrzania) pipetą 10 mL zamocowaną do bezprzewodowego kontrolera pipet Pipette-Aid (Drummond). Ponownie pozostawić tkankę do opadnięcia i usunąć nadmiar cieczy.</li>
	<li>Umieścić probówkę na platformie kołyszącej i trawić w temperaturze 37ºC przez około 30 min.</li>
	<li>Po upłynnieniu mięśni przefiltrować roztwór przez sitko komórkowe 70 μm (BD Falcon) i odwirować w temperaturze pokojowej przez 10 min przy 600 x g (Beckman GP). Za pomocą pipety Pasteura i odsysania usunąć jak najwięcej cieczy, a następnie zawiesić osad w 10 mL ciepłego medium do mioblastów.</li>
	<li>Przeprowadzić wstępne wysiewanie komórek na niepowlekaną płytkę do hodowli tkankowej 150 mm przez 15 minut, aby pomóc w usunięciu fibroblastów.</li>
	<li>Przenieść komórki, które nie przywarły jeszcze, do naczyń hodowlanych powleczonych lamininą i rozcieńczyć tak, aby na jedną płytkę przypadało 1 do 2 noworodków szczura. Umieścić płytkę w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37 °C i 5% CO2.</li>
</ol>
Część 4: Odlewanie inżynieryjnych konstruktów tkankowych (5 mL)
<ol>
	<li>Po 1 do 2 dni wyjmij z inkubatora 10 płytek hodowlanych z mioblastami o średnicy 150 mm, wypłucz je dwukrotnie 1X PBS o temperaturze 37°C i dodaj do każdej płytki 4 mL ciepłego 0,05% Trypsin-EDTA. Włóż płytki z powrotem do inkubatora na 5 min.</li>
	<li>Zabierz odklejone mioblasty z płytek w komorze z laminarnym przepływem powietrza i zbierz ciecz do probówki 50 mL (BD Falcon). Użyj 10 mL pożywki do mioblastów, aby wypłukać wszystkie płytki, i połącz tę ciecz z komórkami w probówce do wirowania. Wirowuj komórki w temperaturze pokojowej przez 10 min przy 600 x g (Beckman GP) i usuń nadmiar cieczy zgodnie z opisem w kroku 3.5.</li>
	<li>Resuspenduj komórki mioblastów w 1,6 mL pożywki do mioblastów i umieść na lodzie.</li>
	<li>Za pomocą pęsety ostrożnie wyjmij 4 formy do konstruktów z kroku 1.5 i wypłucz je dwukrotnie 1X PBS. Odsuń wszystkie pozostałości PBS za pomocą pipety Pasteura podciśnieniowo, a następnie umieść każdą formę w 6-dołkowej płytce hodowlanej (BD Falcon).</li>
	<li>Przygotuj na lodzie pozostałe odczynniki potrzebne do przygotowania konstruktów (10X Ham’s F10, antybiotyki, kolagen typu 1 [3,9 mg/mL][6] oraz Matrigel™), a pożywkę do mioblastów utrzymuj w temperaturze 37ºC. Połącz 500 μL 10X Ham’s F10, 100 µL Penicyliny/Streptomycyny, 100 µL Fungizone, 1,6 mL kolagenu oraz 750 µL Matrigel™ w stożkowej probówce 15 mL. Mieszaj roztwór przez 10 s za pomocą mini-wirówka (VWR) ustawionej na stopień 10 i umieść na lodzie.</li>
	<li>Następnie dodaj 80 µL NaHCO3 oraz zawiesinę mioblastów z kroku 3.3 do mieszaniny z kroku 3.5. Wymieszaj całą zawiesinę w wirówce przez 10 s i włóż probówkę z powrotem do pojemnika z lodem na kilka minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza z roztworu.</li>
	<li>Ostrożnie wlej mieszaninę do form za pomocą pipety 10 mL, zanim zacznie ona twardnieć. Każda forma pomieści około 1 mL lepkiej cieczy. Podczas tej procedury należy starać się nie wprowadzać pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Ostrożnie przenieś płytkę z odlanymi konstruktami do inkubatora. Po ok. 30 min wyjmij stwardniałe konstrukty z inkubatora i ostrożnie dodaj pożywkę do mioblastów do każdego dołka, aby zakryć konstrukt tkankowy. Włóż płytkę z powrotem do inkubatora (Rysunek 2).</li>
</ol>
Część 5: Reprezentatywne wyniki
Po prawidłowym wykonaniu tego protokołu konstrukt tkankowy zawierający mioblasty jest gotowy do implantacji in vivo (tj. po wyjęciu z formy) lub do dalszych analiz in vitro po 2 dniach.
<img alt="Implanty do regeneracji nerwów z polimerową siatką, linijka skali dla odniesienia wielkości, badania biomedyczne." src="/files/ftp_upload/1137/Figure1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000">
Rysunek 1. Przykłady gotowych form do konstruktów (patrz Krok 1.5).
<img alt="Układ eksperymentalny do badania elastyczności miękkiego materiału z siatką do analizy testów mechanicznych." height="321" src="/files/ftp_upload/1137/Figure2.jpg" width="400" data-altupdatedat="1787630408000">
Rycina 2. Stężona konstrukcja tkankowa zawierająca mioblasty[1].
<img alt="Porównanie preparatów histologicznych, przekroje tkanki mięśniowej A i B, wyniki badania mikroskopowego." src="/files/ftp_upload/1137/Figure3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000">
Rysunek 3. Przekroje tkankowego konstruktu zawierającego mioblasty, barwione H&amp;E. „A” przedstawia przekrój podłużny, a „B” przekrój poprzeczny.

<ol><li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+conduction+through+engineered+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li>
<li>Rando, T. A., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+mouse+myoblast+purification%2C+characterization%2C+and+transplantation+for+cell-mediated+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy.</a> J Cell Biol. 125 (6), 1275-1287 (1994).</li>
<li>Blau, H. M., Webster, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+human+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of human muscle cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (9), 5623-5627 (1981).</li>
<li>Powell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+human+bioartificial+muscles+expressing+a+foreign+recombinant+protein+for+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered human bioartificial muscles expressing a foreign recombinant protein for gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 10 (4), 565-577 (1999).</li>
<li>Vandenburgh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-engineered+skeletal+muscle+organoids+for+reversible+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tissue-engineered skeletal muscle organoids for reversible gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 7 (17), 2195-2200 (1996).</li>
<li>Gallop, P. M., Seifter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Properties+of+Soluble+Collagens%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Preparation and Properties of Soluble Collagens.</a> Methods in Enzymology. 6, 635-641 (1963).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i regulacjami ustanowionymi przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Korzystania ze Zwierząt (Institutional Animal Care and Use Committee) w Children's Hospital Boston.

Formy, w których odlewany będzie konstrukt tkankowy, mogą mieć dowolny kształt i rozmiar; konieczne jest jednak zapewnienie co najmniej dwóch punktów mocowania. W przeciwnym razie macierz i komórki tworzą strukturę sferyczną, co prowadzi do obumarcia komórek. W niniejszym protokole opisujemy zastosowanie siatki poliestrowej w tym celu, choć z powodzeniem stosowaliśmy również siatkę ze stali nierdzewnej. Oczywiście większe formy będą wymagały większej liczby komórek oraz większej objętości pozostałych składników. Podczas ...

<table><tbody><tr><td>Przewody silikonowe</td><td>VWR international</td><td>60985-724</td><td></td></tr><tr><td>Klej silikonowy</td><td>Rhodia Silicones</td><td>MED ADH 4300 RTV</td><td></td></tr><tr><td>Siatka poliestrowa</td><td>McMaster-Carr</td><td>93185T17</td><td></td></tr><tr><td>Laminina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka nutrient mixture F-10 HAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6908</td><td></td></tr><tr><td>Płytkowa surowica bydlęca (Fetal Bovine Serum)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Fungizone</td><td>Invitrogen</td><td>15290-018</td><td></td></tr><tr><td>Dyspaza-2</td><td>Roche Group</td><td>10295825001</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza 2</td><td>Worthington Biochemical</td><td>46H8863</td><td></td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (Basic Fibroblast Growth Factor)</td><td>Promega Corp.</td><td>G5071</td><td></td></tr><tr><td>Szalki hodowlane 150 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>0.05% (1X) Trypsyna-EDTA</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>1X Zrównoważony roztwór soli Hanksa (Hanks Balanced Salt Solution)</td><td>Invitrogen</td><td>14170-112</td><td></td></tr><tr><td>7.5% NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek 70 &amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Probetka stożkowa 50 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Probetka stożkowa 15 mL</td><td>BD Biosciences</td><td>352099</td><td></td></tr><tr><td>Filtr 0.2 &amp;mu;m</td><td>Nalge Nunc international</td><td>194-2520</td><td></td></tr></tbody></table>

wytwarzanie inżynieryjnych konstruktów tkanki mięśniowej

Fabrication of Myogenic Engineered Tissue Constructs

Mimo że elektroniczne rozruszniki serca są ratującymi życie urządzeniami medycznymi, ich długoterminowe funkcjonowanie u pacjentów pediatrycznych może być problematyczne ze względu na ograniczenia wynikające z niewielkich rozmiarów organizmu dziecka oraz jego nieuniknionego wzrostu. W związku z tym istnieje rzeczywista potrzeba opracowania innowacyjnych terapii zaprojektowanych specjalnie dla pacjentów pediatrycznych z zaburzeniami rytmu serca. Proponujemy, aby przewodząca alternatywa biologiczna, składająca się z macierzy kolagenowej zawierającej komórki pochodzenia autologicznego, mogłaby lepiej dostosować się do wzrostu, zmniejszyć potrzebę przeprowadzania powtórnych operacji i znacznie poprawić jakość życia tych pacjentów. W niniejszej pracy opisujemy procedurę inkorporacji pierwotnych kultur komórek mioblastów szkieletowych w macierz hydrożelową w celu stworzenia tkankowego konstruktu do implantacji chirurgicznej, który będzie służył jako przewód elektryczny między górnymi i dolnymi jamami serca. Ostatecznie planujemy wykorzystanie tego typu tkanki inżynieryjnej do przywrócenia przewodnictwa elektrycznego przedsionkowo-komorowego u dzieci z całkowitym blokiem serca. W tym celu izolujemy mioblasty z mięśni szkieletowych noworodków szczurów szczepu Lewis i wysiewamy je na naczynia do hodowli tkankowej pokryte lamininą, stosując zmodyfikowaną wersję uznanych protokołów[2, 3]Po jednym lub dwóch dniach hodowlane komórki są zbierane i mieszane z antybiotykami, kolagenem typu 1, Matrigelem™ oraz NaHCO3Wynikiem jest lepki, jednorodny roztwór, który można odlać do formy niemal dowolnego kształtu i rozmiaru[1, 4, 5]W przypadku naszych konstruktów tkankowych wykorzystujemy kolagen typu 1 wyizolowany ze skóry płodu owczego zgodnie ze standardowymi procedurami[6]Po zastygnięciu tkanki w temperaturze 37°C, do płytki ostrożnie dodaje się pożywkę hodowlaną, aż konstrukt zostanie całkowicie zanurzony. Następnie pozwala się na dalszą kondensację sztucznie wytworzonej tkanki poprzez odwodnienie przez kolejne 2 dni, po których jest ona gotowa doin vitroocena lub implantacja chirurgiczna.

W niniejszej pracy przedstawiamy sposób wytwarzania konstruktów tkankowych na bazie kolagenu zawierających mioblasty szkieletowe. Te trójwymiarowe konstrukty inżynieryjne mogą być wykorzystywane do zastępowania lub naprawy tkanek in vivo. Na potrzeby naszych badań zaprojektowaliśmy je jako przekaźnik elektryczny przedsionkowo-komorowy do leczenia całkowitego bloku serca[1].

Wytwarzanie inżynieryjnych konstruktów tkanki mięśniowej

Mimo że elektroniczne rozruszniki serca są ratującymi życie urządzeniami medycznymi, ich długoterminowe działanie u pacjentów w wieku pediatrycznym może być problematyczne ze względu na ...

Procedura ta rozpoczyna się od pobrania tkanki mięśni szkieletowych od noworodkowych szczurów linii Lewis Wraths. Z tkanki tej izolujemy mioblasty. Mioblasty te są hodowane na płytkach do hodowli tkankowej przez dwa dni, a następnie zbierane i mieszane z mieszaniną do tworzenia konstrukcji tkankowej na bazie kolagenu.Mieszaninę tę ostrożnie przenosi się pipetą do formy zanurzonej w pożywce hodowlanej i inkubuje w temperaturze 37 °C. Witajcie, jestem Christina Pesach z laboratorium Douglasa Cowana w Departamencie Anestezjologii w Children's Hospital w Bostonie oraz w Harvard Medical School. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę tworzenia inżynierowanej tkanki mięśniowej.Stosujemy tę procedurę do wytwarzania inżynierowanej tkanki przeznaczonej do wszczepienia do serca. Naszym celem jest stworzenie połączenia elektrycznego między górnymi a dolnymi jamami serca jako alternatywnej terapii dla implantacji stymulatora serca u dzieci z całkowitym blokiem serca. Zacznijmy zatem.W konstrukcie zastosowano formę odlewniczą, aby nadać kształt chirurgicznie implantowalnemu konstruktowi tkankowemu na bazie kolagenu. W towarzyszącym filmie opisano proces tworzenia inżynieryjnych konstruktów tkankowych zawierających mioblastów szkieletowych. Zaprezentowano również implantację w obrębie serca tkanki zcellularyzowanej, przygotowanej zgodnie z niniejszym protokołem.Formę do tkanki można wykonać w niemal dowolnym kształcie lub rozmiarze, aby spełnić wymagania fizjologiczne dowolnego serca, dla którego tkanka jest projektowana. W tej demonstracji forma pozwoli stworzyć fragment tkanki, który można przyciąć tak, aby pasował do bruzdy przedsionkowo-komorowej serca dorosłego szczura. Rozpocznij konstrukcję formy, używając żyletki do przecięcia rurki silikonowej na odcinki o długości trzech centymetrów, a następnie przetnij każdy odcinek wzdłuż na pół.Odetnij mały kawałek siatki poliestrowej. Następnie nanieś kroplę silikonowego kleju RTV klasy implantacyjnej na wewnętrzną stronę końcówki rurki. Staraj się ograniczyć ilość naniesionego kleju do minimum, ponieważ jest on w pewnym stopniu toksyczny dla hodowlanych komórek.Szybko umieść mały kawałek siatki poliestrowej na kropli silikonowego kleju i wyrównaj go z końcem rurki. Zapewni to lekko podniesioną i płaską powierzchnię do mocowania konstrukcji. Powtórz ten proces dla drugiego końca rurki.Pozostaw formy do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez trzy dni. Zaleca się przygotowanie od 20 do 30 form jednocześnie, ponieważ są one w zasadzie jednorazowe. Po całkowitym wyschnięciu kleju, w celu sterylizacji form, należy przechowywać je w pojemniku wypełnionym 70%etanolem do momentu ich wykorzystania.Następnie należy sprawdzić, czy wszystkie wymagane roztwory są gotowe do użycia w celu przygotowania do izolacji komórek. Należy przygotować rozcieńczony roztwór lamininy, rozpuszczając 1 mg lamininy w 250 ml PBS z antybiotykami i fungicydem, przefiltrowanego przez filtr 0,2 µm.Następnie pokryj płytki do hodowli tkankowej o średnicy 150 mm czterema mililitrami rozcieńczonego roztworu lamininy i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez co najmniej cztery godziny przed użyciem. Należy również przygotować dwa inne roztwory: pożywkę dla mioblastów oraz roztwór do trawienia mięśni szkieletowych.Skład produktów opisano w części tekstowej protokołu. Filtrowanie. Sterylizuj bufor trawienny, używając dysku filtrującego o rozmiarze 0,2 mikrona założonego na strzykawkę o pojemności 10 mililitrów. Alikwoty buforu trawiennego można przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Przyjmij, że na jeden miot szczurów linii Lewis będziesz potrzebować pięciu mililitrów buforu do trawienia. Inkubuj wymaganą ilość buforu do trawienia tkanek oraz 10 mililitrów pożywki dla mioblastów w temperaturze 37 °C. Następnie przystąp do sekcji młodych szczurów.Najpierw, za pomocą pęsety i małych nożyczek, pobierz co najmniej jeden miot noworodkowych szczurów szczepu Lewis po uśmierceniu. Usuń mięśnie przykręgosłupowe z martwych noworodkowych szczurów Lewis, wykonując nacięcie wzdłuż grzbietu w linii rdzenia kręgowego, odchylając warstwy skóry i powięzi, a następnie wycinając mięśnie. Umieść wycięte mięśnie w 50 mililitrowej probówce stożkowej wypełnionej 40 mililitrami roztworu 1X HBSS w lodzie.Należy odczekać, aż paski mięśni opadną na dno probówki, a następnie ostrożnie usunąć większość cieczy i pozostałości krwi za pomocą ssania próżniowego z użyciem sterylnej pipety Pasteura w warunkach hodowlanych. Następnie zebrane fragmenty mięśni należy przelać na szalkę hodowlaną o średnicy 150 mm i odessać jak najwięcej pozostałego płynu. Przy użyciu dwóch jednostronnych żyletek należy posiekać tkankę do uzyskania gęstej pasty.Pasta mięśniowa zostanie poddana trawieniu w uprzednio ogrzanym roztworze trawiącym. Nalej część roztworu trawiącego na pastę mięśniową, a następnie przenieś mieszaninę roztworu i pasty mięśniowej do nowej probówki o pojemności 50 ml. Używając pipety 10 ml, zazwyczaj w celu efektywnego trawienia mięśni szczurów linii Lewis o masie trzech litrów, stosujemy od 10 do 15 ml roztworu.Umieścić probówkę na platformie kołyszącej i inkubować w celu trawienia w temperaturze 37°C przez około 30 minut. Podczas trawienia enzymatycznego tkankę należy sporadycznie triturować, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Do tego celu należy użyć pipety 10 ml zamontowanej na bezprzewodowym pipetującym urządzeniu.Po upłynnieniu mięśnia przefiltruj roztwór przez sito komórkowe o oczkach 70 µm. Następnie odwiruj przefiltrowane komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 600 G. Za pomocą pipety Pasteura i ssaka odessać jak najwięcej cieczy, a osad resuspendować w 10 ml ciepłego Medium dla mioblastów. Pozostaw komórki na niepowlekanej płytce hodowlanej 150 mm na 15 minut, aby pomóc w usunięciu fibroblastów, ponieważ przywierają one szybciej niż mioblasty.Umieść płytkę w inkubatorze z nawilżaniem, ustawionym na 37°C i 5% dwutlenku węgla. Wyjmij płytkę z inkubatora i przenieś komórki, które nie przywarły jeszcze do kultury powlekanej laminą. Zlej je i rozcieńcz w medium dla mioblastów w taki sposób, aby przypadała jedna płytka na jeden do dwóch młodych szczurów.Jeśli komórki zostaną wysiane zbyt gęsto, będą różnicować się w miotuby. Na koniec należy pozwolić komórkom rosnąć w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C i przy 5% carbon dioxide. Po jednym lub dwóch dniach inkubacji komórki będą gotowe do odlewania w konstrukcje tkankowe.Po jednym lub dwóch dniach inkubacji wyjmij z inkubatora cztery 150-milimetrowe płytki hodowlane z mioblastami. Nie należy czekać dłużej niż 48 godzin, ponieważ fibroblasty zdominują populację mioblastów. Odessij pożywkę z komórek.Następnie przepłucz komórki dwukrotnie roztworem XPBS podgrzanym do 37 °C, aby odczepić mioblasty od płytki, a następnie wlej cztery mililitry podgrzanego 0,05% roztworu trypsyny z EDTA do każdej płytki i wprowadź płytki z powrotem do inkubatora na pięć minut. Zbierz mioblasty w komorze z laminarnym przepływem powietrza i przelej ciecz do probówki o pojemności 50 ml. Użyj 10 ml pożywki dla mioblastów do przepłukania wszystkich płytek i połącz ten roztwór z komórkami w probówce do wirowania.Odwirować komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 600 G i odessać jak najwięcej nadmiaru cieczy. Następnie ponownie zawiesić mioblasty w 1,4 milliliters medium do mioblastów i umieścić je w lodzie. Używając pęsety, ostrożnie wyjąć formę do konstrukcji z kąpieli etanolowej i przepłukać ją dwukrotnie poprzez zanurzenie w XPBS; odessać wszystkie pozostałości PBS za pomocą pipety Pasteura przed umieszczeniem formy w pustej studzience sześciostudniowej płytki do hodowli tkanek.W tym momencie należy przygotować roztwór. Odważyć następujące odczynniki w warunkach chłodzenia (na lodzie): 10 x hams F 10 fungi zone penicillin streptomycin.Komórki kolagenu typu jeden resuspenderowane w pożywce do mioblastów, wodorowęglanie sodu i żelu. Połączyć odczynniki zgodnie z opisanim protokołem. Mieszaninę wierzgać w vortexie przez 20 sekund, aż zmieni kolor na różowy.Należy pamiętać, że komercyjnie dostępne odmiany kolagenu typu I mają różny wpływ na mieszanie, krzepnięcie i konsystencję produktu końcowego. Włożyć probówkę z powrotem do naczynia z lodem na kilka minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza z roztworu.Kluczowe jest, aby kolagen typu I nie był naświetlony, w przeciwnym razie nie ulegnie żelatynizacji. W tym przypadku stosujemy produkt pochodzący ze skóry jajowej. Przed zastygnięciem mieszaniny należy ją ostrożnie wlać do formy w płytce hodowlanej.Każda forma pomieści około jednego mililitra lepkiej cieczy. Należy starać się unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas tej procedury. Ostrożnie przenieść płytkę z formami konstrukcji do inkubatora ustawionego na 37 °C.W miarę krzepnięcia mieszanina zmieni kolor z ciemnoróżowego na jasnoróżowy; podczas krzepnięcia formy należy podgrzać podłoże do hodowli mioblastów do 37°C. Po około pół godzinie inkubacji należy ostrożnie zanurzyć każdy konstrukt tkankowy w ogrzanym podłożu do hodowli mioblastów i ponownie umieścić płytkę w inkubatorze. Po prawidłowym wykonaniu tego protokołu konstrukt tkankowy zawierający mioblasty jest gotowy do implantacji in vivo lub do dalszych analiz.Po dwóch dniach inkubacji zaprezentowaliśmy sposób wytwarzania konstrukcji z tkanki mięśniowej inżynierii tkankowej. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby wszystkie odczynniki niezbędne do przygotowania roztworu konstrukcji przechowywać w lodzie, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

fabrication-of-myogenic-engineered-tissue-constructs

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wytwarzanie inżynieryjnych konstrukcji tkankowych pochodzenia miogennego

Opisano metody przygotowania wstrzykiwalnego żelu macierzy z tkanki decelularyzowanej oraz jego wstrzykiwania do mięśnia sercowego szczura in vivo.

Wytwarzanie biologicznych materiałów wstrzykiwalnych do inżynierii tkankowej mięśnia sercowego

Sztucznie wytworzona tkanka mięśniowa ma ogromny potencjał w medycynie regeneracyjnej, jako model chorób, a także jako alternatywne źródło mięsa. W niniejszej pracy opisujemy proces tworzenia konstruktu mięśniowego, w tym przypadku z progenitorowych mioblastów mysich, oraz jego stymulację impulsami elektrycznymi.

Inżynieria tkanek mięśni szkieletowych z murynych komórek progenitorowych mioblastów i zastosowanie stymulacji elektrycznej

Generowanie wyrównanej tkanki mięśnia sercowego jest kluczowym wymogiem dla dostosowania najnowszych osiągnięć w biologii komórek macierzystych do klinicznie użytecznych celów. W tym artykule opisujemy podejście do druku mikrokontaktowego w celu precyzyjnej kontroli kształtu i funkcji komórki. Korzystając z wysoce oczyszczonych populacji embrionalnych komórek progenitorowych serca pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych, generujemy anizotropową funkcjonalną tkankę mięśnia sercowego.

Generowanie wyrównanej funkcjonalnej tkanki mięśnia sercowego poprzez drukowanie mikrokontaktowe

Ten system modelowy zaczyna się od wypełnionego miofibroblastami żelu fibrynowego, który może być używany do badania endogennej kolagenu (re)organizacji w czasie rzeczywistym w sposób nieniszczący. System modelowy jest bardzo przestrajalny, ponieważ może być używany z różnymi źródłami komórek, dodatkami do pożywek i może być łatwo dostosowany do konkretnych potrzeb.

Inżynieria konstruktów tkankowych na bazie fibryny z miofibroblastów oraz zastosowanie ograniczeń i szczepów do indukowania reorganizacji komórek i kolagenu

Aby stworzyć wysoce zorganizowane struktury złożonej tkanki, należy złożyć wiele typów materiałów i komórek w zintegrowany kompozyt.  Ten kombinatoryczny projekt obejmuje warstwowe arkusze komórek specyficzne dla narządów z dwoma odrębnymi materiałami pochodzenia biologicznego, zawierającymi silną włóknistą podstawę macierzy oraz komórki śródbłonka w celu usprawnienia tworzenia nowych naczyń.

Inżynieria tkankowa: budowa wielokomórkowego rusztowania 3D do dostarczania warstwowych arkuszy komórkowych

W tej pracy prezentujemy technikę szybkiego wytwarzania żywych tkanek naczyniowych poprzez bezpośrednią hodowlę kolagenu, komórek mięśni gładkich i komórek śródbłonka. Ponadto opisano nowy protokół charakterystyki mechanicznej zmodyfikowanych tkanek naczyniowych.

Inżynieria 3D cellularnych żeli kolagenowych do regeneracji tkanki naczyniowej

Do tej pory, grube ubytki tkanek są zazwyczaj rekonstruowane za pomocą autologicznych płatów tkankowych lub tkanek zmodyfikowanych. W niniejszym protokole przedstawiamy nową metodę inżynierii unaczynionego płata tkankowego z autologiczną szypułką, która ma służyć jako substytut płatów autologicznych.

Zaprojektowana unaczyniona płat mięśniowa

Ten protokół opisuje platformę do produkcji samodzielnie składających się pierścieni tkankowych w różnych rozmiarach przy użyciu dostosowanej formy z tworzywa sztucznego wydrukowanej w 3D. Negatywy PDMS są utwardzane w formie wydrukowanej w 3D; następnie agaroza jest odlewana w utwardzonych negatywach PDMS. Komórki są wysiewane do powstałych studzienek agarozowych, gdzie agregują się w pierścienie tkankowe.

Wytwarzanie niestandardowych studzienek agarozowych do wysiewu komórek i samomontażu pierścieni tkankowych przy użyciu form drukowanych w 3D

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół tworzenia matryc 3D mikrotkanek ludzkich mięśni szkieletowych oraz minimalnie inwazyjnych testów funkcji in situ, w tym analizy siły skurczu i obchodzenia się z wapniem.

Ocena funkcjonalnych wskaźników zdrowia mięśni szkieletowych w mikrotkankach mięśni szkieletowych człowieka

Opisujemy powtarzalny, zautomatyzowany i bezstronny system obrazowania do charakteryzowania funkcji połączeń nerwowo-mięśniowych przy użyciu ludzkiej tkanki mięśniowej i optogenetycznych neuronów ruchowych. System ten pozwala na funkcjonalną kwantyfikację połączeń nerwowo-mięśniowych w czasie i wykrywa zmniejszone funkcje nerwowo-mięśniowe spowodowane przez neurotoksyny i surowicę pacjenta z miastenią.

Inżynieria i charakterystyka modelu optogenetycznego ludzkiego połączenia nerwowo-mięśniowego

Ten protokół dostarcza metod generowania tkanek serca i mięśni szkieletowych w inżynierii 3D oraz opisuje ich zastosowanie w przedklinicznych badaniach przesiewowych leków. Opisane metody wykorzystują system detekcji magnetycznej, aby ułatwić jednoczesną ocenę 24 tkanek równolegle.

Przedkliniczne testy leków w skalowalnych tkankach mięśniowych modyfikowanych w 3D

Poznaj metodę wytwarzania kolagenowych konstruktów tkankowych zawierających myoblasty szkieletowe do naprawy bloku serca. Ta technika inżynierii tkankowej umożliwia tworzenie przewodów elektrycznych AV.

Wytwarzanie inżynieryjnych konstruktów tkanki mięśniowej

Przeglądaj więcej filmów