Wytwarzanie inżynieryjnych konstruktów tkanki mięśniowej

Procedura ta rozpoczyna się od pobrania tkanki mięśni szkieletowych od noworodkowych szczurów linii Lewis Wraths. Z tkanki tej izolujemy mioblasty. Mioblasty te są hodowane na płytkach do hodowli tkankowej przez dwa dni, a następnie zbierane i mieszane z mieszaniną do tworzenia konstrukcji tkankowej na bazie kolagenu.

Mieszaninę tę ostrożnie przenosi się pipetą do formy zanurzonej w pożywce hodowlanej i inkubuje w temperaturze 37 °C. Witajcie, jestem Christina Pesach z laboratorium Douglasa Cowana w Departamencie Anestezjologii w Children's Hospital w Bostonie oraz w Harvard Medical School. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę tworzenia inżynierowanej tkanki mięśniowej.

Stosujemy tę procedurę do wytwarzania inżynierowanej tkanki przeznaczonej do wszczepienia do serca. Naszym celem jest stworzenie połączenia elektrycznego między górnymi a dolnymi jamami serca jako alternatywnej terapii dla implantacji stymulatora serca u dzieci z całkowitym blokiem serca. Zacznijmy zatem.

W konstrukcie zastosowano formę odlewniczą, aby nadać kształt chirurgicznie implantowalnemu konstruktowi tkankowemu na bazie kolagenu. W towarzyszącym filmie opisano proces tworzenia inżynieryjnych konstruktów tkankowych zawierających mioblastów szkieletowych. Zaprezentowano również implantację w obrębie serca tkanki zcellularyzowanej, przygotowanej zgodnie z niniejszym protokołem.

Formę do tkanki można wykonać w niemal dowolnym kształcie lub rozmiarze, aby spełnić wymagania fizjologiczne dowolnego serca, dla którego tkanka jest projektowana. W tej demonstracji forma pozwoli stworzyć fragment tkanki, który można przyciąć tak, aby pasował do bruzdy przedsionkowo-komorowej serca dorosłego szczura. Rozpocznij konstrukcję formy, używając żyletki do przecięcia rurki silikonowej na odcinki o długości trzech centymetrów, a następnie przetnij każdy odcinek wzdłuż na pół.

Odetnij mały kawałek siatki poliestrowej. Następnie nanieś kroplę silikonowego kleju RTV klasy implantacyjnej na wewnętrzną stronę końcówki rurki. Staraj się ograniczyć ilość naniesionego kleju do minimum, ponieważ jest on w pewnym stopniu toksyczny dla hodowlanych komórek.

Szybko umieść mały kawałek siatki poliestrowej na kropli silikonowego kleju i wyrównaj go z końcem rurki. Zapewni to lekko podniesioną i płaską powierzchnię do mocowania konstrukcji. Powtórz ten proces dla drugiego końca rurki.

Pozostaw formy do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez trzy dni. Zaleca się przygotowanie od 20 do 30 form jednocześnie, ponieważ są one w zasadzie jednorazowe. Po całkowitym wyschnięciu kleju, w celu sterylizacji form, należy przechowywać je w pojemniku wypełnionym 70%etanolem do momentu ich wykorzystania.

Następnie należy sprawdzić, czy wszystkie wymagane roztwory są gotowe do użycia w celu przygotowania do izolacji komórek. Należy przygotować rozcieńczony roztwór lamininy, rozpuszczając 1 mg lamininy w 250 ml PBS z antybiotykami i fungicydem, przefiltrowanego przez filtr 0,2 µm.

Następnie pokryj płytki do hodowli tkankowej o średnicy 150 mm czterema mililitrami rozcieńczonego roztworu lamininy i inkubuj je w temperaturze 37 °C przez co najmniej cztery godziny przed użyciem. Należy również przygotować dwa inne roztwory: pożywkę dla mioblastów oraz roztwór do trawienia mięśni szkieletowych.

Skład produktów opisano w części tekstowej protokołu. Filtrowanie. Sterylizuj bufor trawienny, używając dysku filtrującego o rozmiarze 0,2 mikrona założonego na strzykawkę o pojemności 10 mililitrów. Alikwoty buforu trawiennego można przechowywać w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.

Przyjmij, że na jeden miot szczurów linii Lewis będziesz potrzebować pięciu mililitrów buforu do trawienia. Inkubuj wymaganą ilość buforu do trawienia tkanek oraz 10 mililitrów pożywki dla mioblastów w temperaturze 37 °C. Następnie przystąp do sekcji młodych szczurów.

Najpierw, za pomocą pęsety i małych nożyczek, pobierz co najmniej jeden miot noworodkowych szczurów szczepu Lewis po uśmierceniu. Usuń mięśnie przykręgosłupowe z martwych noworodkowych szczurów Lewis, wykonując nacięcie wzdłuż grzbietu w linii rdzenia kręgowego, odchylając warstwy skóry i powięzi, a następnie wycinając mięśnie. Umieść wycięte mięśnie w 50 mililitrowej probówce stożkowej wypełnionej 40 mililitrami roztworu 1X HBSS w lodzie.

Należy odczekać, aż paski mięśni opadną na dno probówki, a następnie ostrożnie usunąć większość cieczy i pozostałości krwi za pomocą ssania próżniowego z użyciem sterylnej pipety Pasteura w warunkach hodowlanych. Następnie zebrane fragmenty mięśni należy przelać na szalkę hodowlaną o średnicy 150 mm i odessać jak najwięcej pozostałego płynu. Przy użyciu dwóch jednostronnych żyletek należy posiekać tkankę do uzyskania gęstej pasty.

Pasta mięśniowa zostanie poddana trawieniu w uprzednio ogrzanym roztworze trawiącym. Nalej część roztworu trawiącego na pastę mięśniową, a następnie przenieś mieszaninę roztworu i pasty mięśniowej do nowej probówki o pojemności 50 ml. Używając pipety 10 ml, zazwyczaj w celu efektywnego trawienia mięśni szczurów linii Lewis o masie trzech litrów, stosujemy od 10 do 15 ml roztworu.

Umieścić probówkę na platformie kołyszącej i inkubować w celu trawienia w temperaturze 37°C przez około 30 minut. Podczas trawienia enzymatycznego tkankę należy sporadycznie triturować, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Do tego celu należy użyć pipety 10 ml zamontowanej na bezprzewodowym pipetującym urządzeniu.

Po upłynnieniu mięśnia przefiltruj roztwór przez sito komórkowe o oczkach 70 µm. Następnie odwiruj przefiltrowane komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 600 G. Za pomocą pipety Pasteura i ssaka odessać jak najwięcej cieczy, a osad resuspendować w 10 ml ciepłego Medium dla mioblastów. Pozostaw komórki na niepowlekanej płytce hodowlanej 150 mm na 15 minut, aby pomóc w usunięciu fibroblastów, ponieważ przywierają one szybciej niż mioblasty.

Umieść płytkę w inkubatorze z nawilżaniem, ustawionym na 37°C i 5% dwutlenku węgla. Wyjmij płytkę z inkubatora i przenieś komórki, które nie przywarły jeszcze do kultury powlekanej laminą. Zlej je i rozcieńcz w medium dla mioblastów w taki sposób, aby przypadała jedna płytka na jeden do dwóch młodych szczurów.

Jeśli komórki zostaną wysiane zbyt gęsto, będą różnicować się w miotuby. Na koniec należy pozwolić komórkom rosnąć w wilgotnej komorze w temperaturze 37 °C i przy 5% carbon dioxide. Po jednym lub dwóch dniach inkubacji komórki będą gotowe do odlewania w konstrukcje tkankowe.

Po jednym lub dwóch dniach inkubacji wyjmij z inkubatora cztery 150-milimetrowe płytki hodowlane z mioblastami. Nie należy czekać dłużej niż 48 godzin, ponieważ fibroblasty zdominują populację mioblastów. Odessij pożywkę z komórek.

Następnie przepłucz komórki dwukrotnie roztworem XPBS podgrzanym do 37 °C, aby odczepić mioblasty od płytki, a następnie wlej cztery mililitry podgrzanego 0,05% roztworu trypsyny z EDTA do każdej płytki i wprowadź płytki z powrotem do inkubatora na pięć minut. Zbierz mioblasty w komorze z laminarnym przepływem powietrza i przelej ciecz do probówki o pojemności 50 ml. Użyj 10 ml pożywki dla mioblastów do przepłukania wszystkich płytek i połącz ten roztwór z komórkami w probówce do wirowania.

Odwirować komórki w temperaturze pokojowej przez 10 minut przy 600 G i odessać jak najwięcej nadmiaru cieczy. Następnie ponownie zawiesić mioblasty w 1,4 milliliters medium do mioblastów i umieścić je w lodzie. Używając pęsety, ostrożnie wyjąć formę do konstrukcji z kąpieli etanolowej i przepłukać ją dwukrotnie poprzez zanurzenie w XPBS; odessać wszystkie pozostałości PBS za pomocą pipety Pasteura przed umieszczeniem formy w pustej studzience sześciostudniowej płytki do hodowli tkanek.

W tym momencie należy przygotować roztwór. Odważyć następujące odczynniki w warunkach chłodzenia (na lodzie): 10 x hams F 10 fungi zone penicillin streptomycin.

Komórki kolagenu typu jeden resuspenderowane w pożywce do mioblastów, wodorowęglanie sodu i żelu. Połączyć odczynniki zgodnie z opisanim protokołem. Mieszaninę wierzgać w vortexie przez 20 sekund, aż zmieni kolor na różowy.

Należy pamiętać, że komercyjnie dostępne odmiany kolagenu typu I mają różny wpływ na mieszanie, krzepnięcie i konsystencję produktu końcowego. Włożyć probówkę z powrotem do naczynia z lodem na kilka minut, aby usunąć pęcherzyki powietrza z roztworu.

Kluczowe jest, aby kolagen typu I nie był naświetlony, w przeciwnym razie nie ulegnie żelatynizacji. W tym przypadku stosujemy produkt pochodzący ze skóry jajowej. Przed zastygnięciem mieszaniny należy ją ostrożnie wlać do formy w płytce hodowlanej.

Każda forma pomieści około jednego mililitra lepkiej cieczy. Należy starać się unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas tej procedury. Ostrożnie przenieść płytkę z formami konstrukcji do inkubatora ustawionego na 37 °C.

W miarę krzepnięcia mieszanina zmieni kolor z ciemnoróżowego na jasnoróżowy; podczas krzepnięcia formy należy podgrzać podłoże do hodowli mioblastów do 37°C. Po około pół godzinie inkubacji należy ostrożnie zanurzyć każdy konstrukt tkankowy w ogrzanym podłożu do hodowli mioblastów i ponownie umieścić płytkę w inkubatorze. Po prawidłowym wykonaniu tego protokołu konstrukt tkankowy zawierający mioblasty jest gotowy do implantacji in vivo lub do dalszych analiz.

Po dwóch dniach inkubacji zaprezentowaliśmy sposób wytwarzania konstrukcji z tkanki mięśniowej inżynierii tkankowej. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby wszystkie odczynniki niezbędne do przygotowania roztworu konstrukcji przechowywać w lodzie, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.