Obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa

Obrazowanie żywych komórek jest szczególnie użyteczne podczas badania dynamiki transportu organelli. W tym filmie przedstawiono procedurę obrazowania gęstych jąder w hodowlanych neuronach hipokampa. Kompleksy transfekcyjne otrzymuje się najpierw poprzez zmieszanie medium D-N-A-M-E-M oraz odczynnika do transfekcji lipectomy.

Ponieważ neurony hipokampa są hodowane na odwróconych szkiełkach podstawkowych skierowanych w stronę monowarstwy glejowej, szkiełka te należy obrócić, aby odsłonić je na działanie odczynnika do transfekcji. Po zapewnieniu odpowiedniego czasu na ekspresję białek gęstych jąder pęcherzyków synaptycznych z tagiem GFP, należy skonstruować komorę do obrazowania. Obrazowanie gęstych jąder ICAL w hodowlach neuronów można przeprowadzić przy użyciu szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej.

Niniejszy protokół jest elastyczny i może zostać dostosowany do obrazowania innych organelli, takich jak mitochondria, endosomy i peroksysomy. Witam, nazywam się Michael Silverman i zapraszam do mojego laboratorium neuronauki komórkowej na Simon Fraser University. Interesuje nas sposób, w jaki organelle przemieszczają się w komórkach nerwowych.

Aby podejść do tego zagadnienia, znakujemy organelle błonowe, a konkretnie pęcherzyki o gęstym rdzeniu w hodowlanych neuronach hipokampa. Aby pokazać Państwu, jak to robimy, oddaję głos Davidowi. Cześć, jestem David z laboratorium Silvermana.

Dzisiaj zaprezentuję procedurę obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu oraz hodowanych neuronów z wykorzystaniem mikroskopii szerokopolowej. Zacznijmy. W większości eksperymentów stosujemy naczynia z neuronami hipokampa szczura, które były hodowane w gęstości 250 000 komórek na naczynie o średnicy sześciu centymetrów; dla każdej transfekcji należy opisać dwie probówki o pojemności 1,5 mililitra, jedną na plazmid DNA, a drugą na odczynnik do transfekcji.

W komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby połączyć 1 µg plazmidowego DNA ze 100 µl MEM w jednej probówce w temperaturze pokojowej, należy upewnić się, że stosowany MEM nie zawiera żadnych suplementów. W drugiej probówce połącz 6 µl lip z 100 µl MEM. Taka sama ilość może być wykorzystana do podwójnej transfekcji, mimo że w takich przypadkach stosunek lip do DNA zostanie zmniejszony dwukrotnie.

Aby zachować trwałość odczynnika lipidowego, należy go przez cały czas przechowywać w lodówce lub w chłodziarce laboratoryjnej, a następnie inkubować probówki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przenieść mieszaninę DNA w MEM do probówki z lipidami i delikatnie wymieszać za pomocą APE Next, a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po 25 minutach dodać 60 µL 50 mM kwasu neuronowego, aby zminimalizować uszkodzenia cytotoksyczne w hodowanych neuronach.

Ponieważ neurony hodujemy na spodniej stronie szkiełek nakrywkowych zawieszonych nad monowarstwą GL, konieczne jest odwrócenie szkiełek i wystawienie neuronów na działanie roztworu do transfekcji. Ostrożnie odwróć szkiełka nakrywkowe stroną z neuronami do góry, używając sterylnej pęsety. Ułóż je tak, aby na siebie nie nachodziły.

Należy uważać, aby nie uszkodzić powierzchni szkiełka nakrywki pokrytej neuronami ani powierzchni naczynia pokrytej ggl. Po zakończeniu 30 minutowej inkubacji należy pobrać około 0,5 milliliters medium z naczynia o średnicy sześciu centymetrów i delikatnie wymieszać je z DNA w probówce. Następnie należy przenieść roztwór DNA z powrotem do naczynia, rozprowadzając go równomiernie na powierzchni medium.

Delikatnie przesuwaj naczynie w przód i w tył w jednym kierunku, dbając o to, aby nie wzburzyć medium. Po wymieszaniu w jednym kierunku przerwij i powtórz czynność w kierunku prostopadłym, aby równomiernie rozłożyć kompleksy lipektomii DNA w całym naczyniu. Inkubuj przez 90 minut w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide.

Po inkubacji odwróć szkiełka nakrywki stroną z nóżkami do dołu i ułóż je tak, aby na siebie nie nachodziły. Na koniec pozwól na ekspresję DNA przez wymagany czas, który zazwyczaj wynosi od jednej nocy do 48 godzin w inkubatorze. Obrazowanie na żywo granulek gęstego rdzenia znakowanych GFP w hodowlanych neuronach hipokampa wymaga mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę CCD.

Wymagana będzie komora obrazowania z kontrolerem temperatury i grzałką obiektywu. Komora nie powinna posiadać otwartych portów; modyfikacja ta może zostać uwzględniona podczas zamawiania urządzenia. Następnie należy uruchomić kamerę mikroskopową, lampę fluorescencyjną oraz oprogramowanie do akwizycji obrazu.

Włącz zasilanie platformy komory i grzałek obiektywów. Jest to również odpowiedni moment na nałożenie kropli oleju na obiektywy. Następnie przygotuj podgrzewaną platformę oraz komorę obrazowania.

Aby ułatwić manipulację, należy oznaczyć jedną stronę górnej części komory markerem permanentnym. Następnie należy umieścić górną część komory stroną górną do góry na zakrętce probówki o pojemności 50 ml, która stanowi idealny uchwyt komory.

Nanieś pierścień smaru w rowek otaczający otwór w bocznej ściance komory oznaczonej jako górna. Unikaj nadmiernego stosowania smaru, ponieważ przedostanie się on do wnętrza komory i zmniejszy obszar obserwacyjny. Użyj pęsety.

Przymocuj czyste, nieużywane szkiełko nakrywkowe o długości 18 centymetrów do górnej strony komory. Delikatnie dociśnij krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby zapewnić szczelne zamknięcie w zagłębieniu komory. Odwróć komorę i nałóż podobny pierścień smaru w zagłębieniu po przeciwnej, dolnej stronie komory.

Przenieś 750 µL medium obrazującego do komory. Jest to ilość nadmiarowa, jednak smar powinien zapobiec wyciekaniu medium, a nadmiar płynu zapobiegnie uwięzieniu pęcherzyków powietrza podczas nakładania szkiełka nakrywkowego z komórkami. Przechowuj przygotowaną komorę w inkubatorze do hodowli tkanek do momentu użycia.

Należy unikać przedłużonej inkubacji, trwającej godzinę lub dłużej, ponieważ medium obrazujące wyparuje, co zmieni jego skład. W celu końcowego montażu komory do obrazowania lifestyle, przenieś przygotowaną komorę oraz naczynie z transfektowanymi szkiełkami nakrywkowymi z inkubatora do dygestorium do hodowli tkankowych. Używając sterylnej pęsety, ostrożnie wyjmij jedno szkiełko nakrywkowe z naczynia z transfektowanymi próbkami.

Następnie dotknij krawędzi szkiełka nakrywki chusteczką Kimwipe, aby odssać medium hodowlane. Dalej, połóż szkiełko nakrywkę stroną z neuronami do dołu na przygotowanej komorze. Dotknij najpierw jedną krawędzią szkiełka smaru, a następnie dociśnij krawędzie, aby szkiełko przylegało płasko, nie więżąc pęcherzyków powietrza.

Nadmiar medium obrazującego prawdopodobnie wypłynie; należy go wytrzeć, uważając jednak, aby nie przesunąć szkiełka nakrywki. Przenieś komorę na wstępnie podgrzany podgrzewacz platformy i przymocuj ją na miejscu. Następnie przenieś komorę na stolik, aby zminimalizować fotowyblakanie i fototoksyczność.

Ustaw lampę na minimalną intensywność niezbędną do zlokalizowania transfektowanych komórek. Następnie znajdź interesującą Cię komórkę. Przy użyciu immersyjnego obiektywu o niskim powiększeniu, np. 40 x, zaleca się stosowanie zaplanowanego wzoru przeszukiwania, aby zapewnić maksymalny zasięg obrazowania szkiełka nakrywnego i uniknąć powtarzalnego pozyskiwania obrazów.

Po zlokalizowaniu pożądanego pola widzenia, przełącz kanał na odpowiadający fluorescencyjnie znakowanemu białku zainteresowania. Przełącz na obiektyw olejowy o dużym powiększeniu, np. 60-100x, i przywróć wysoką intensywność lampy. W przypadku szybko poruszających się organelli, użyj funkcji stream acquisition lub analogicznej funkcji oprogramowania do obrazowania, aby zarejestrować dynamikę fluorescencyjnie znakowanego białka. Czas ekspozycji oraz odstępy między ekspozycjami powinny być zminimalizowane, aby uzyskać nagrania z wysoką częstotliwością klatek.

Dryft ogniskowy obserwowany w podglądzie na ekranie można korygować w czasie rzeczywistym poprzez ręczną regulację ostrości. Należy pamiętać o wykonaniu obrazu w kontraście fazowym oraz wszelkich innych towarzyszących obrazów niezbędnych do późniejszej analizy i prezentacji. Zapisz wszystkie obrazy przed dalszą eksploracją szkiełka nakrywki i wykonaniem kolejnego nagrania.

Zazwyczaj za udaną uznaje się uzyskanie od trzech do pięciu zapisów z jednej szalki z przykrywką, a obrazowanie każdej z nich trwa od 30 do 60 minut; należy przy tym pamiętać o fototoksyczności i ogólnym stanie zdrowia komórek, ponieważ w komórkach uszkodzonych liczba transporterów jest zmniejszona. Obserwacje w obrazowaniu żywych komórek zazwyczaj składają się z nagrań, znanych również jako stosy obrazów, które ukazują ruch organelli znakowanych fluorescencyjnie w polu widzenia. Poniżej znajduje się reprezentatywny film przedstawiający transport gęstych rdzeni iCal.

Kolory zostały odwrócone w celu łatwiejszej obserwacji. Zwróć uwagę na poruszające się cząsteczki. Wykresy CH to obrazy ilustrujące ruch cząsteczek poprzez zestawienie skanów liniowych, w których każdy punkt czasowy jest reprezentowany przez kolumnę na wykresie.

Rysunek ten pokazuje, w jaki sposób dwie cząstki poruszające się w przeciwnych kierunkach są reprezentowane na wykresie CH. Dalsza analiza chronogramów może dostarczyć informacji o prędkości strumienia cząstek, odwróceniach długości przebiegu oraz cząstkach stacjonarnych. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak uzyskać nagrania wysokiej rozdzielczości czasowej transportu pęcherzyków dsco w hodowanych neuronach hipokampa.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o wstępnym podgrzaniu wszystkich elementów komory obrazowania i platformy, w celu zmniejszenia stresu komórek podczas ich przenoszenia z inkubatora na stolik mikroskopu. Należy pracować szybko, ale ostrożnie. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.