Name: Obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym jądrze w pierwotnych neuronach hipokampa z hodowlą pierwotną (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym jądrze w pierwotnych neuronach hipokampa z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół umożliwia badanie dynamiki transportu organelli w komórkach nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Haraldowi Hutterowi i Helenie Decker za uważną lekturę niniejszego manuskryptu. Dziękujemy również Regowi Sidhu z firmy Leica Microsystems za wsparcie techniczne. Badania te były finansowane przez National Sciences and Engineering Council of Canada (grant nr 327100-06) oraz Wydział Nauk Simon Fraser University.

Część 1: Transfekcja neuronów z użyciem Lipofectamine 2000 (Invitrogen)
Konfiguracja sprzętu:
Neurony hipokampa szczura lub myszy hoduje się zgodnie z metodą Kaech i Bankera z 2006 r. [4]. Typowa gęstość komórek stosowana do transfekcji wynosi 250,000 cells/6-cm dish. Wymagane odczynniki i sprzęt obejmują: 50 mM kwasu kynurenowego, standardowy laboratoryjny uchwyt do probówek, chłodziarkę laboratoryjną (zalecana do przechowywania odczynnika Lipofectamine w niskiej temperaturze), 
odczynnik Lipofectamine, MEM, probówki do mikrocentryfugi, mikropipety oraz sterylne pęsety.
Procedura:
<ol>
	<li>Dla każdej transfekcji należy opisać dwie probówki o pojemności 1,5 mL; jedną na plazmidowe DNA, a drugą na odczynnik do transfekcji. Kolejne inkubacje można prowadzić w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>W jednej probówce należy połączyć 1,0 μg plazmidowego DNA z 100 μL MEM (bez żadnych suplementów; MEM nie musi być wyrównany pod względem temperatury lub pH).</li>
		<li>W drugiej probówce 1,5 mL należy połączyć 6,0 μL Lipofectamine z 100 μL MEM.
		<ol>
			<li>W przypadku transfekcji podwójnych nie są wymagane żadne korekty, mimo że stosunek Lipofectamine:DNA zostanie w takich przypadkach zmniejszony dwukrotnie. Stosunek Lipofectamine:DNA nadal mieści się w zaleceniach producenta. W celu uzyskania optymalnej ekspresji najlepiej przetestować ilość 0,5-1,0 μg dla każdego plazmidu.</li>
			<li>Aby zachować trwałość odczynnika Lipofectamine, należy wyjmować go z lodówki na jak najkrótszy czas i umieszczać w chłodzaku laboratoryjnym, gdy nie jest używany. 
			Całkowity czas przebywania poza lodówką powinien być ograniczony do minimum.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Probówki należy inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Roztwór DNA w MEM należy przenieść do probówki z lipidami i delikatnie wymieszać pipetą, a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Po 25 minutach, przed obróceniem szkiełek podstawkowych, należy dodać 60 μL 50 mM kwasu kynurenowego, aby zminimalizować uszkodzenia ekscytotoksyczne w naczyniu z kulturą neuronów.
	<ol>
		<li>Za pomocą sterylnej pęsety należy ostrożnie obrócić szkiełka podstawkowe stroną z nóżkami do góry i ułożyć je tak, aby na siebie nie nachodziły. Należy uważać, aby nie zarysować powierzchni szkiełka pokrytej neuronami ani powierzchni naczynia pokrytej glejem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Z naczynia 6-cm należy pobrać około 0,5 mL pożywki i delikatnie wymieszać w probówce z DNA, a następnie przenieść roztwór DNA z powrotem do naczynia, rozprowadzając go równomiernie po powierzchni pożywki.</li>
	<li>Nie należy kołysać naczyniem, lecz delikatnie przesuwać go w przód i w tył w jednym kierunku, a następnie zatrzymać i powtórzyć ruch w kierunku prostopadłym, aby równomiernie rozprowadzić kompleksy DNA-Lipofectamine. Inkubować przez 90 minut w inkubatorze do hodowli tkanek (37°C, 5% CO2).</li>
	<li>Szkiełka podstawkowe należy obrócić stroną z nóżkami do dołu i ułożyć tak, aby na siebie nie nachodziły. Ekspresję należy kontynuować przez pożądany czas, zazwyczaj od nocy do 48 godzin.</li>
</ol>
Część 2: Obrazowanie na żywo pęcherzyków gęstego rdzenia znakowanych GFP w hodowanych neuronach hipokampa
Konfiguracja sprzętu:
<ol>
	<li>Obrazowanie żywych komórek wymaga mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę CCD; stosujemy odwrócony mikroskop Leica DMI 6000B wyposażony w zmienną lampę fluorescencyjną Leica. Wymagana jest również komora obrazowania z kontrolerem temperatury i grzałką obiektywu. Używamy urządzenia Warner Instruments RC-21BR zmodyfikowanego dla szkiełek podstawowych 18 mm, a także grzałki platformy (kat. #PH2) i kontrolera temperatury (kat. #TC324B). Komora nie posiada otwartych portów, co jest modyfikacją, którą można uwzględnić przy zamawianiu urządzenia. Wysoce zalecane jest stosowanie grzałki obiektywu, aby pomóc w utrzymaniu temperatury szkiełka podstawowego i zminimalizować zmiany ostrości wynikające z wahań temperatury. Obrazy są pozyskiwane za pomocą kamery Hamamatsu Orca-ER przy użyciu oprogramowania Metamorph (Molecular Devices) z włączoną funkcją akwizycji w trybie „streaming”. Uwaga – nie korzystamy z komory klimatycznej obejmującej cały mikroskop. Jest to kosztowne rozwiązanie, które nie jest konieczne w przypadku krótkotrwałego obrazowania opisanego w niniejszym protokole.</li>
	<li>Pozostały sprzęt i odczynniki obejmują: świeżo przygotowane medium do obrazowania żywych komórek (1X Hanks z Ca2+ i Mg2+, 0,6% glukozy oraz 10mM HEPES), dodatkowe szklane szkiełka podstawowe 18 mm, pęsetę sterylną, pęsetę niesterylną, chusteczki Kimwipes, smar próżniowy oraz strzykawkę (bez igły lub z zmodyfikowaną igłą o szerokim świetle) do nakładania smaru.</li>
</ol>
Procedura:
<ol>
	<li>Przygotować świeże pożywkę do obrazowania żywych komórek (1X Hanks z Ca2+ i Mg2+, 0,6% glukozy oraz 10mM HEPES). Zazwyczaj przygotowuje się 50 ml jednorazowo i przechowuje w temperaturze 4oC, gdy nie jest używana. Zaleca się przygotowanie ilości wystarczającej na nie więcej niż jeden tydzień. Na jedną szalkę z neuronami zużywa się około 5-10 mL.</li>
	<li>Uruchomić mikroskop, kamerę, lampę fluorescencyjną oraz oprogramowanie do akwizycji obrazu. Włączyć również zasilanie platformy komory oraz grzałek obiektywów.</li>
	<li>Przygotować komorę do obrazowania.
	<ol>
		<li>Komora Warnera zawiera teflonową wkładkę do montażu szkiełek podstawowych. Dla ułatwienia manipulacji należy oznaczyć jeden bok wkładki napisem „góra” za pomocą niezmywalnego markera.</li>
		<li>Nanieść pierścień smaru do rowka otaczającego otwór po stronie komory oznaczonej jako „góra”. Należy unikać nadmiaru smaru, ponieważ dostanie się on do wnętrza komory i zmniejszy obszar obserwacyjny.</li>
		<li>Za pomocą pęsety przymocować czyste, nieużywane szkiełko podstawowe o rozmiarze 18 cm do strony „góra” komory; delikatnie docisnąć krawędzie szkiełka, aby stworzyć szczelne połączenie w zagłębieniu rowka komory.</li>
		<li>Odwrócić komorę i nanieść analogiczny pierścień smaru do rowka po przeciwległej (dolnej) stronie komory.</li>
		<li>Umieścić przygotowaną komorę — stroną dolną do góry — na zakrętce probówki 50-mL, która stanowi idealny uchwyt komory.</li>
		<li>Dodać do komory 750 μL pożywki do obrazowania. Jest to ilość nadmiarowa, ale smar powinien zapobiec wylaniu pożywki, a nadmiar pomoże uniknąć uwięzienia pęcherzyków powietrza podczas nakładania szkiełka z komórkami.</li>
		<li>Przechowywać przygotowaną komorę w inkubatorze do hodowli tkanek do momentu użycia. Należy unikać przedłużonej inkubacji (~ 1 godzina), ponieważ pożywka do obrazowania odparuje, co zmieni jej skład.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przeprowadzić końcowy montaż komory i obrazowanie żywych komórek.
	<ol>
		<li>Przenieść przygotowaną komorę oraz szalkę z przetransfekowanymi szkiełkami z inkubatora do dygestorium do hodowli tkanek.</li>
		<li>Końcowy montaż komory powinien zostać przeprowadzony szybko, aby zapewnić komórkom ciągłe zanurzenie w pożywce w temperaturze 37°C.</li>
		<li>Za pomocą sterylnej pęsety ostrożnie wyjąć jedno szkiełko z szalki z przetransfekowanymi komórkami; dotknąć krawędzi szkiełka chusteczką Kimwipe, aby usunąć pożywkę wzrostową.</li>
		<li>Położyć szkiełko stroną z neuronami do dołu na przygotowanej komorze. Najpierw dotknąć jedną krawędzią szkiełka smaru, a następnie docisnąć go wokół krawędzi, aby szkiełko przyległo płasko bez uwięzienia pęcherzyków powietrza. Nadmiar pożywki do obrazowania wypłynie zgodnie z oczekiwaniami.</li>
		<li>Zetrzeć nadmiar pożywki do obrazowania, uważając, aby nie przesunąć szkiełek z ich pozycji.</li>
		<li>Przenieść komorę na wstępnie podgrzaną platformę grzewczą i zamocować komorę na miejscu.</li>
		<li>Przenieść komorę na stolik mikroskopu.</li>
		<li>Aby zredukować fotoblaknięcie i fototoksyczność, ustawić lampę na minimalną intensywność niezbędną do zlokalizowania przetransfekowanych komórek.</li>
		<li>Znaleźć interesującą komórkę za pomocą olejowego obiektywu o niskim powiększeniu (40X). Wskazane jest trzymanie się zaplanowanego schematu poszukiwań, aby zapewnić maksymalne pokrycie szkiełka i uniknąć redundantnej akwizycji obrazów, np. zaczynając od lewego górnego rogu szkiełka i skanując w górę i w dół, przesuwając się w prawo.</li>
		<li>Przełączyć na olejowy obiektyw o wysokim powiększeniu (60-100x) po zlokalizowaniu pożądanego pola widzenia.</li>
		<li>Użyć funkcji „stream acquisition” lub analogicznej funkcji oprogramowania do obrazowania, aby zarejestrować wideo dynamiki białek znakowanych fluorescencyjnie.</li>
		<li>Wykonać obraz w kontraście fazowym oraz wszelkie inne towarzyszące obrazy (np. rozpuszczalne GFP) do późniejszej analizy i prezentacji.</li>
		<li>Zapisać wszystkie obrazy przed dalszą eksploracją szkiełka i nagraniem kolejnego wideo.</li>
		<li>Zazwyczaj za sukces uznaje się nagranie 3-5 filmów z jednego szkiełka. Należy pamiętać o fototoksyczności i ogólnym stanie zdrowia komórek, ponieważ w komórkach uszkodzonych transport jest zredukowany. Stan zdrowia komórek można monitorować za pomocą mikroskopii fazowej. Nagrania zazwyczaj trwają około 30 minut na jedno szkiełko.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
Część 3: Reprezentatywne wyniki:
Obserwacje z obrazowania żywych komórek zazwyczaj składają się z filmów (znanych również jako „stosy” obrazów), które pokazują ruch znakowanych fluorescencyjnie organelli w polu widzenia (Rycina 1A). Każdemu filmowi często towarzyszą obrazy pomocnicze, które ilustrują orientację pola widzenia względem ciała komórki, poziom ekspresji białka i/lub stan zdrowia komórki. Filmy z transportu mogą zostać poddane analizie ilościowej poprzez przekształcenie ich w kymografy (Rycina 1B). Kymografy to obrazy ilustrujące ruch cząsteczek poprzez zestawienie skanów liniowych, w których każdy punkt czasowy jest reprezentowany przez kolumnę w kymografie. Rycina 2 pokazuje, w jaki sposób dwie cząsteczki poruszające się w przeciwnych kierunkach są reprezentowane na kymografie. Dalsza analiza kymografów może dostarczyć informacji o strumieniu cząsteczek, prędkości, długości przebiegu, odwróceniach kierunku ruchu oraz cząsteczkach stacjonarnych.
<img alt="Dynamika mikrotubul w neuronach w grupie kontrolnej i po zastosowaniu nocodazolu; transport anterogradny i retrogradny." src="/files/ftp_upload/1144/fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rysunek 1. Reprezentatywne obserwacje z obrazowania żywych komórek. (A) Wybrane klatki z filmu przedstawiającego transport aktywatora plazminogenu tkankowego (TPA) znakowanego mCherry. Wskazano poszczególne cząsteczki poruszające się w kierunku anterogradnym (zielone strzałki) i retrogradnym (czerwone strzałki). (B) Kymografy ilustrujące ruch TPA-mCherry w aksonie. Linie poziome na kymografach reprezentują obiekty stacjonarne, natomiast linie ukośne reprezentują organelle poruszające się od ciała komórki (dodatni nachylenie) lub w stronę ciała komórki (ujemne nachylenie). Długie zielone i czerwone strzałki wskazują przebiegi odpowiadające cząsteczkom w (A). Zmiany w transporcie wywołane przez nocodazol, odczyn depolimeryzujący mikrotubule, zostały również przedstawione na kymografie. Zauważalny jest spadek liczby poruszających się organelli, co przejawia się brakiem linii ukośnych.

<ol><li>Kulic, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubule+movement+in+bidirectional+organelle+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The role of microtubule movement in bidirectional organelle transport.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (29), 10011-10016 (2008).</li>
<li>Jacobson, C., Schnapp, B., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+change+in+the+selective+translocation+of+the+Kinesin-1+motor+domain+marks+the+initial+specification+of+the+axon%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A change in the selective translocation of the Kinesin-1 motor domain marks the initial specification of the axon.</a> Neuron. 49 (6), 797-804 (2006).</li>
<li>Barkus, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+an+Axonal+Kinesin-3+Motor+for+Fast+Anterograde+Vesicle+Transport+that+Facilitates+Retrograde+Transport+of+Neuropeptides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of an Axonal Kinesin-3 Motor for Fast Anterograde Vesicle Transport that Facilitates Retrograde Transport of Neuropeptides.</a> Mol Biol Cell. 19 (1), 274-283 (2008).</li>
<li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1 (5), 2406-2415 (2006).</li>
</ol>

Obrazowanie żywych komórek jest wymagającą, ale potężną techniką bezpośredniej obserwacji transportu organelli w hodowlach neuronów. Trudności mogą pojawić się jeszcze przed samą procedurą, w postaci pogorszonej kondycji neuronów wynikającej z komplikacji związanych z hodowlą. Dlatego przed i po transfekcji należy ocenić stan zdrowia komórek (przykłady w ref. 4), obserwując szkiełka podstawowe w pożywce wzrostowej za pomocą mikroskopu świetlnego do hodowli tkankowych. Proces przenoszenia szkiełek z neuronami do komory ob...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?ID=1144">Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons</a>. There was an error in the author's name. The author name was corrected to include a middle initial as follows:

David M. Kwinter, Michael A. Silverman

instead of:

David Kwinter, Michael Silverman.

A correction to author names has been made for article Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

Erratum: Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons.

<table><tbody><tr><td>MEM-Eagle z solami Earle'a i L-glutaminą</td><td>Odczynnik</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>10-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td>Odczynnik do transfekcji</td></tr><tr><td>10X Hanks z Ca2+ i Mg2+</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14185-052</td><td>Pożywka do obrazowania na żywo</td></tr><tr><td>1M HEPES</td><td>Odczynnik</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15630-130</td><td>Pożywka do obrazowania na żywo</td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Obserwacja i charakterystyka dynamicznych procesów komórkowych mogą dostarczyć istotnych informacji o aktywności komórki, których nie można uzyskać z obrazów statycznych. Żywe sondy fluorescencyjne, w szczególności zielone białko fluorescencyjne (GFP), zrewolucjonizowały biologię komórki dzięki możliwości znakowania specyficznych przedziałów wewnątrzkomórkowych oraz struktur komórkowych. Na przykład obrazowanie żywych chimer GFP (i ich wariantów spektralnych) pozwoliło na dynamiczną analizę cytoszkieletu, transportu organelli oraz dynamiki błon w wielu organizmach i typach komórek [1-3]. Choć obrazowanie żywych komórek stało się powszechne, podejście to wciąż niesie ze sobą wiele wyzwań technicznych, szczególnie w przypadku pierwotnych kultur neuronów. Jednym z wyzwań jest ekspresja białek z tagiem GFP w neuronach pomitotycznych; innym jest zdolność do rejestrowania obrazów fluorescencyjnych przy jednoczesnym minimalizowaniu fototoksyczności i fotoblaknięcia oraz utrzymaniu ogólnej żywotności komórek. Przedstawiamy tutaj protokół opisujący metodę transfekcji opartą na lipidach, która skutkuje stosunkowo niską wydajnością transfekcji (~0,5%), jest jednak idealna do obrazowania w pełni spolaryzowanych neuronów. Niska wydajność transfekcji jest niezbędna, aby można było scharakteryzować pojedyncze aksony i dendryty pod kątem ich orientacji względem ciała komórki w celu potwierdzenia kierunkowości transportu, tj. transportu anterogradnego w porównaniu z retrogradowym. Nasze podejście do obrazowania neuronów wykazujących ekspresję GFP opiera się na standardowym szerokopolowym mikroskopie fluorescencyjnym wyposażonym w kamerę CCD, oprogramowanie do akwizycji obrazu oraz podgrzewaną komorę obrazowania. Obrazowaliśmy szeroką gamę organelli lub struktur, np. pęcherzyki o gęstym rdzeniu, mitochondria, stożki wzrostu i aktynę, bez potrzeby stosowania specjalnej optyki lub wymagań dotyczących wzbudzenia poza źródłem światła fluorescencyjnego. Dodatkowo można niemal jednocześnie wizualizować białka znakowane fluorescencyjnie o różnych widmach, np. białka z tagami GFP i dsRed, aby scharakteryzować kotransport lub inne skoordynowane zdarzenia komórkowe. Opisana tutaj metoda obrazowania jest elastyczna w wielu zastosowaniach i może zostać wdrożona w laboratorium przy stosunkowo niskich kosztach, pod warunkiem dostępności mikroskopu.

Obrazowanie żywych komórek jest szczególnie użyteczne podczas badania dynamiki transportu organelli. W niniejszym materiale opisujemy protokół obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w hodowlach neuronów z wykorzystaniem szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół ten jest elastyczny i może zostać dostosowany do obrazowania innych organelli, takich jak mitochondria, endosomy i peroksysomy.

Obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa

Obserwacja i charakteryzacja dynamicznych procesów komórkowych mogą dostarczyć istotnych informacji o aktywności komórkowej, których nie można uzyskać z obrazów statycznych.

Obrazowanie żywych komórek jest szczególnie użyteczne podczas badania dynamiki transportu organelli. W tym filmie przedstawiono procedurę obrazowania gęstych jąder w hodowlanych neuronach hipokampa. Kompleksy transfekcyjne otrzymuje się najpierw poprzez zmieszanie medium D-N-A-M-E-M oraz odczynnika do transfekcji lipectomy.Ponieważ neurony hipokampa są hodowane na odwróconych szkiełkach podstawkowych skierowanych w stronę monowarstwy glejowej, szkiełka te należy obrócić, aby odsłonić je na działanie odczynnika do transfekcji. Po zapewnieniu odpowiedniego czasu na ekspresję białek gęstych jąder pęcherzyków synaptycznych z tagiem GFP, należy skonstruować komorę do obrazowania. Obrazowanie gęstych jąder ICAL w hodowlach neuronów można przeprowadzić przy użyciu szerokopolowej mikroskopii fluorescencyjnej.Niniejszy protokół jest elastyczny i może zostać dostosowany do obrazowania innych organelli, takich jak mitochondria, endosomy i peroksysomy. Witam, nazywam się Michael Silverman i zapraszam do mojego laboratorium neuronauki komórkowej na Simon Fraser University. Interesuje nas sposób, w jaki organelle przemieszczają się w komórkach nerwowych.Aby podejść do tego zagadnienia, znakujemy organelle błonowe, a konkretnie pęcherzyki o gęstym rdzeniu w hodowlanych neuronach hipokampa. Aby pokazać Państwu, jak to robimy, oddaję głos Davidowi. Cześć, jestem David z laboratorium Silvermana.Dzisiaj zaprezentuję procedurę obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu oraz hodowanych neuronów z wykorzystaniem mikroskopii szerokopolowej. Zacznijmy. W większości eksperymentów stosujemy naczynia z neuronami hipokampa szczura, które były hodowane w gęstości 250 000 komórek na naczynie o średnicy sześciu centymetrów; dla każdej transfekcji należy opisać dwie probówki o pojemności 1,5 mililitra, jedną na plazmid DNA, a drugą na odczynnik do transfekcji.W komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby połączyć 1 µg plazmidowego DNA ze 100 µl MEM w jednej probówce w temperaturze pokojowej, należy upewnić się, że stosowany MEM nie zawiera żadnych suplementów. W drugiej probówce połącz 6 µl lip z 100 µl MEM. Taka sama ilość może być wykorzystana do podwójnej transfekcji, mimo że w takich przypadkach stosunek lip do DNA zostanie zmniejszony dwukrotnie.Aby zachować trwałość odczynnika lipidowego, należy go przez cały czas przechowywać w lodówce lub w chłodziarce laboratoryjnej, a następnie inkubować probówki przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Przenieść mieszaninę DNA w MEM do probówki z lipidami i delikatnie wymieszać za pomocą APE Next, a następnie inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po 25 minutach dodać 60 µL 50 mM kwasu neuronowego, aby zminimalizować uszkodzenia cytotoksyczne w hodowanych neuronach.Ponieważ neurony hodujemy na spodniej stronie szkiełek nakrywkowych zawieszonych nad monowarstwą GL, konieczne jest odwrócenie szkiełek i wystawienie neuronów na działanie roztworu do transfekcji. Ostrożnie odwróć szkiełka nakrywkowe stroną z neuronami do góry, używając sterylnej pęsety. Ułóż je tak, aby na siebie nie nachodziły.Należy uważać, aby nie uszkodzić powierzchni szkiełka nakrywki pokrytej neuronami ani powierzchni naczynia pokrytej ggl. Po zakończeniu 30 minutowej inkubacji należy pobrać około 0,5 milliliters medium z naczynia o średnicy sześciu centymetrów i delikatnie wymieszać je z DNA w probówce. Następnie należy przenieść roztwór DNA z powrotem do naczynia, rozprowadzając go równomiernie na powierzchni medium.Delikatnie przesuwaj naczynie w przód i w tył w jednym kierunku, dbając o to, aby nie wzburzyć medium. Po wymieszaniu w jednym kierunku przerwij i powtórz czynność w kierunku prostopadłym, aby równomiernie rozłożyć kompleksy lipektomii DNA w całym naczyniu. Inkubuj przez 90 minut w inkubatorze do hodowli tkankowych w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide.Po inkubacji odwróć szkiełka nakrywki stroną z nóżkami do dołu i ułóż je tak, aby na siebie nie nachodziły. Na koniec pozwól na ekspresję DNA przez wymagany czas, który zazwyczaj wynosi od jednej nocy do 48 godzin w inkubatorze. Obrazowanie na żywo granulek gęstego rdzenia znakowanych GFP w hodowlanych neuronach hipokampa wymaga mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w kamerę CCD.Wymagana będzie komora obrazowania z kontrolerem temperatury i grzałką obiektywu. Komora nie powinna posiadać otwartych portów; modyfikacja ta może zostać uwzględniona podczas zamawiania urządzenia. Następnie należy uruchomić kamerę mikroskopową, lampę fluorescencyjną oraz oprogramowanie do akwizycji obrazu.Włącz zasilanie platformy komory i grzałek obiektywów. Jest to również odpowiedni moment na nałożenie kropli oleju na obiektywy. Następnie przygotuj podgrzewaną platformę oraz komorę obrazowania.Aby ułatwić manipulację, należy oznaczyć jedną stronę górnej części komory markerem permanentnym. Następnie należy umieścić górną część komory stroną górną do góry na zakrętce probówki o pojemności 50 ml, która stanowi idealny uchwyt komory.Nanieś pierścień smaru w rowek otaczający otwór w bocznej ściance komory oznaczonej jako górna. Unikaj nadmiernego stosowania smaru, ponieważ przedostanie się on do wnętrza komory i zmniejszy obszar obserwacyjny. Użyj pęsety.Przymocuj czyste, nieużywane szkiełko nakrywkowe o długości 18 centymetrów do górnej strony komory. Delikatnie dociśnij krawędzie szkiełka nakrywkowego, aby zapewnić szczelne zamknięcie w zagłębieniu komory. Odwróć komorę i nałóż podobny pierścień smaru w zagłębieniu po przeciwnej, dolnej stronie komory.Przenieś 750 µL medium obrazującego do komory. Jest to ilość nadmiarowa, jednak smar powinien zapobiec wyciekaniu medium, a nadmiar płynu zapobiegnie uwięzieniu pęcherzyków powietrza podczas nakładania szkiełka nakrywkowego z komórkami. Przechowuj przygotowaną komorę w inkubatorze do hodowli tkanek do momentu użycia.Należy unikać przedłużonej inkubacji, trwającej godzinę lub dłużej, ponieważ medium obrazujące wyparuje, co zmieni jego skład. W celu końcowego montażu komory do obrazowania lifestyle, przenieś przygotowaną komorę oraz naczynie z transfektowanymi szkiełkami nakrywkowymi z inkubatora do dygestorium do hodowli tkankowych. Używając sterylnej pęsety, ostrożnie wyjmij jedno szkiełko nakrywkowe z naczynia z transfektowanymi próbkami.Następnie dotknij krawędzi szkiełka nakrywki chusteczką Kimwipe, aby odssać medium hodowlane. Dalej, połóż szkiełko nakrywkę stroną z neuronami do dołu na przygotowanej komorze. Dotknij najpierw jedną krawędzią szkiełka smaru, a następnie dociśnij krawędzie, aby szkiełko przylegało płasko, nie więżąc pęcherzyków powietrza.Nadmiar medium obrazującego prawdopodobnie wypłynie; należy go wytrzeć, uważając jednak, aby nie przesunąć szkiełka nakrywki. Przenieś komorę na wstępnie podgrzany podgrzewacz platformy i przymocuj ją na miejscu. Następnie przenieś komorę na stolik, aby zminimalizować fotowyblakanie i fototoksyczność.Ustaw lampę na minimalną intensywność niezbędną do zlokalizowania transfektowanych komórek. Następnie znajdź interesującą Cię komórkę. Przy użyciu immersyjnego obiektywu o niskim powiększeniu, np. 40 x, zaleca się stosowanie zaplanowanego wzoru przeszukiwania, aby zapewnić maksymalny zasięg obrazowania szkiełka nakrywnego i uniknąć powtarzalnego pozyskiwania obrazów.Po zlokalizowaniu pożądanego pola widzenia, przełącz kanał na odpowiadający fluorescencyjnie znakowanemu białku zainteresowania. Przełącz na obiektyw olejowy o dużym powiększeniu, np. 60-100x, i przywróć wysoką intensywność lampy. W przypadku szybko poruszających się organelli, użyj funkcji stream acquisition lub analogicznej funkcji oprogramowania do obrazowania, aby zarejestrować dynamikę fluorescencyjnie znakowanego białka. Czas ekspozycji oraz odstępy między ekspozycjami powinny być zminimalizowane, aby uzyskać nagrania z wysoką częstotliwością klatek.Dryft ogniskowy obserwowany w podglądzie na ekranie można korygować w czasie rzeczywistym poprzez ręczną regulację ostrości. Należy pamiętać o wykonaniu obrazu w kontraście fazowym oraz wszelkich innych towarzyszących obrazów niezbędnych do późniejszej analizy i prezentacji. Zapisz wszystkie obrazy przed dalszą eksploracją szkiełka nakrywki i wykonaniem kolejnego nagrania.Zazwyczaj za udaną uznaje się uzyskanie od trzech do pięciu zapisów z jednej szalki z przykrywką, a obrazowanie każdej z nich trwa od 30 do 60 minut; należy przy tym pamiętać o fototoksyczności i ogólnym stanie zdrowia komórek, ponieważ w komórkach uszkodzonych liczba transporterów jest zmniejszona. Obserwacje w obrazowaniu żywych komórek zazwyczaj składają się z nagrań, znanych również jako stosy obrazów, które ukazują ruch organelli znakowanych fluorescencyjnie w polu widzenia. Poniżej znajduje się reprezentatywny film przedstawiający transport gęstych rdzeni iCal.Kolory zostały odwrócone w celu łatwiejszej obserwacji. Zwróć uwagę na poruszające się cząsteczki. Wykresy CH to obrazy ilustrujące ruch cząsteczek poprzez zestawienie skanów liniowych, w których każdy punkt czasowy jest reprezentowany przez kolumnę na wykresie.Rysunek ten pokazuje, w jaki sposób dwie cząstki poruszające się w przeciwnych kierunkach są reprezentowane na wykresie CH. Dalsza analiza chronogramów może dostarczyć informacji o prędkości strumienia cząstek, odwróceniach długości przebiegu oraz cząstkach stacjonarnych. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak uzyskać nagrania wysokiej rozdzielczości czasowej transportu pęcherzyków dsco w hodowanych neuronach hipokampa.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o wstępnym podgrzaniu wszystkich elementów komory obrazowania i platformy, w celu zmniejszenia stresu komórek podczas ich przenoszenia z inkubatora na stolik mikroskopu. Należy pracować szybko, ale ostrożnie. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.

live-imaging-dense-core-vesicles-primary-cultured-hippocampal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie na żywo gruboziarnistych pęcherzyków w pierwotnych hodowanych neuronach hipokampu

Przedstawiamy protokół hodowli wysoko oczyszczonych neuronów hipokampa z prenatalnych mózgów myszy bez użycia warstwy komórek glejowych jako komórek zasilających.

Izolacja i hodowla neuronów hipokampa z myszy prenatalnych

Ten film pokazuje, jak pęcherzyki neuronalne są znakowane specyficznymi białkami fluorescencyjnymi, aby uwidocznić ich ruch. Najpierw plazmid kodujący białko fluorescencyjne jest inkubowany ze środkiem transfekcyjnym, a następnie wprowadzany do kultury neuronów. Następnie pozyskiwane są obrazy neuronów i analizowane w celu śledzenia ruchu pęcherzyków.

Wizualizacja ruchliwości pęcherzyków w neuronach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego

Źródło: Villarreal, S., et. al., Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa. J. Vis. Exp. (2017)Ten film przedstawia analizę endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa poprzez znakowanie peroksydazą chrzanową i mikroskopię elektronową.

Transmisyjne obrazowanie mikroskopowe elektronów endocytozy pęcherzyków synaptycznych w neuronach hipokampa myszy 

Źródło: Calvo-Rodríguez, et al. Obrazowanie fluorescencyjne i bioluminescencyjne subkomórkowego Ca2+ w starzejących się neuronach hipokampa. J. vis. exp. (2015).  Ten film demonstruje zastosowanie obrazowania fluorescencyjnego do pomiaru poziomu cytozolowego wapnia w krótko- i długoterminowych hodowlach hipokampa szczurów. Porównując młode i starzejące się neurony, podkreśla, w jaki sposób zwiększona gęstość kanałów wapniowych bramkowanych napięciem typu L i przedłużona aktywacja w starzejących...

Obrazowanie wapnia in vitro w krótko- i długoterminowych hodowlach hipokampa szczurów

Opisujemy, jak przeprowadzić badania oparte na fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej (PALM) pęcherzyków w stałych, hodowanych neuronach. Kluczowe elementy naszego protokołu obejmują znakowanie pęcherzyków za pomocą chimer fotokonwertowalnych, zbieranie rzadkich próbek surowych obrazów za pomocą systemu mikroskopii o wysokiej rozdzielczości oraz przetwarzanie surowych obrazów w celu uzyskania obrazu o super rozdzielczości.

Obrazowanie w superrozdzielczości pęcherzyków neuronalnych o gęstym rdzeniu

Kultury o niskiej gęstości pierwotnych neuronów hipokampa zazwyczaj wymagają warstwy zasilającej glej, aby dostarczyć czynników neurotroficznych i utrzymać długowieczność. Opisujemy tutaj uproszczoną metodę hodowli neuronów o ultra niskiej gęstości na szklanych szkiełkach nakrywkowych w obecności warstwy zasilającej neurony o dużej gęstości, co ułatwia badanie specyficznych mechanizmów neuronalno-autonomicznych.

Uproszczona metoda długoterminowej hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o bardzo niskiej gęstości

Ten artykuł opisuje protokół hodowli pierwotnych neuronów hipokampa o niskiej gęstości rosnących na szklanych szkiełkach nakrywkowych odwróconych na monowarstwie glejowej. Warstwy neuronów i glejowe są oddzielone kulkami wosku parafinowego. Neurony wyhodowane tą metodą nadają się do obrazowania optycznego o wysokiej rozdzielczości i testów funkcjonalnych.

Pierwotna hodowla neuronów hipokampa o niskiej gęstości

Badanie transportu błonowego jest kluczowe dla zrozumienia funkcji neuronalnych. W tym miejscu przedstawiamy metodę ilościowego określania ruchliwości pęcherzyków w neuronach. Jest to wygodna metoda, którą można dostosować do ilościowego oznaczania transportu błonowego w układzie nerwowym.

Kwantyfikacja ruchliwości endosomów i lizosomów w hodowanych neuronach za pomocą sond fluorescencyjnych

Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest wykrywana za pomocą mikroskopii świetlnej pHluoryny połączonej z białkiem pęcherzyków synaptycznych oraz za pomocą mikroskopii elektronowej wychwytu pęcherzyków.

Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa

Ten protokół pokazuje, jak wykorzystać mikroskopię superrozdzielczą do badania kolokalizacji białek w pierwotnych kulturach neuronalnych.

Obrazowanie superrozdzielcze w celu zbadania kolokalizacji białek i markerów synaptycznych w neuronach pierwotnych

Tutaj pokazujemy, jak połączyć transfekcję pierwotnych neuronów gryzoni hipokampa z obrazowaniem konfokalnym żywych komórek, aby przeanalizować patologiczne efekty wywołane przez białka na transport aksonalny i zidentyfikować szlaki mechanistyczne pośredniczące w tych efektach.

Wykorzystanie obrazowania żywych komórek do pomiaru wpływu patologicznych białek na transport aksonalny w pierwotnych neuronach hipokampa

Poznaj metodę obrazowania na żywo pęcherzyków o gęstym jądrze w pierwotnych neuronach hipokampa z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej. Protokół umożliwia badanie dynamiki transportu organelli w komórkach nerwowych.

Obrazowanie na żywo pęcherzyków o gęstym rdzeniu w pierwotnych hodowlach neuronów hipokampa

Przeglądaj więcej filmów