Name: Wizualizacja żywego połączenia glejowo-nerwowo-mięśniowego Drosophila za pomocą barwników fluorescencyjnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-13T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Poznaj metodę inside-out do wizualizacji żywych synaps glejowo-nerwowo-mięśniowych w larwach Drosophila przy użyciu barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia badanie strukturalnych zmian w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Projekt ten był finansowany przez CIHR oraz NSERC. Chcielibyśmy podziękować Barb Jusiak za wkład w stworzenie linii muszek wykazujących ekspresję SSR znakowanego dsRed (linia BJ) oraz UBC Bio-imaging Facility.

Część 1: Przygotowanie tkanek
<ol>
	<li>Naszym celem jest przygotowanie preparatu tkankowego z larw muchy, w którym układ nerwowy pozostaje nienaruszony, ale wewnętrzna powierzchnia mięśni ściany ciała jest wystawiona na działanie sztucznej hemolimfy i może zostać umieszczona blisko szkiełka przedmiotowego mikroskopu w celu uzyskania dobrej jakości obrazu. Innymi słowy, chodzi o preparat larwy wywiniętej na lewą stronę. 
	 
	Ponieważ konwencjonalne przygotowania tkanek wiążą się z rozcinaniem, przypinaniem i rozciąganiem mięśni ściany ciała, a niekiedy z usuwaniem części układu nerwowego, potrzebowaliśmy innego podejścia. 
	 
	Zależało nam na wywinięciu zwierząt na lewą stronę, aby dokładnie przyjrzeć się cechom strukturalnym i zmianom strukturalnym w synapsie w czasie, zachowując jednocześnie nienaruszony układ nerwowy. Chcieliśmy również uniknąć rozciągania tkanki i aktywacji receptorów rozciągania, co powodowałoby drgania mięśni i psuło obraz.</li>
	 
	<li>Na początek przygotuj zwierzęta. Larwy w trzecim stadium żerowania oraz larwy w trzecim stadium wędrówki są duże i łatwe do wypreparowania, dlatego demonstrację przeprowadzimy na larwach W3. Zwierzę to posiada fenotyp Tubby i jest szerokie, co ułatwia jego wywinięcie. 
	 
	Używaliśmy wyłącznie larw, które aktywnie się poruszały, w tym larw W3.</li>
	<li>Oczyść powierzchnię larwy bardzo miękkim pędzlem w szalce Petriego z podwójnie destylowaną H2O. Oczyszczone larwy zapewniają lepszą jakość obrazu, a czyszczenie redukuje ilość bakterii.</li>
	<li>Przenieś zwierzę do małej szalki Petriego zawierającej około 3 ml lodowatego HL-6, czyli sztucznej hemolimfy. Pozostaw szalkę na lodzie, aż zwierzę przestanie się poruszać i rozluźni (około 5 minut).</li>
	<li>Trzymaj bardzo cienkie pęsety w jednej ręce, a nożyczki sprężynowe w drugiej. Nożyczek używam w ręce dominującej. Zrób nożyczkami mały otwór w ścianie ciała, aby wyrównać ciśnienie wewnątrz i na zewnątrz ściany ciała.</li>
	<li>Delikatnie przytrzymaj zwierzę pęsetą przy dnie szalki i odetnij dwa tylne segmenty. Wypreparuj trzewia; ciało tłuszczowe prawdopodobnie wysunie się z jamy ciała. Usuń również tę tkankę.</li>
	<li>Przytrzymaj larwę przy dnie szalki cienką pęsetą. Weź szpilkę entomologiczną #0 (z tępym czubkiem) i dociśnij ją do części gębowych larwy. Przepchnij części gębowe przez jamę ciała, tak jakbyś wywijał skarpetkę na lewą stronę.</li>
	<li>Wytworzona tkanka wywinięta na lewą stronę będzie wyglądać jak na poniższej rycinie. Za pomocą ultra-cienkiego narzędzia do dysekcji usuń ciało tłuszczowe i tchawki ze ściany ciała. Bardzo staraj się nie pociągać za tchawki ani nie uszkodzić układu nerwowego. Zerwanie tchawki spowoduje powstanie dziur w mięśniach ściany ciała. 
	 
	Usuń jak największą ilość ciała tłuszczowego. Obie te struktury pogarszają jakość optyczną tkanki. Przed wykonaniem tego przygotowania warto zrezygnować z picia kawy.</li>
	 
	<li>Po zakończeniu mięsień będzie przezroczysty, a nie nieprzezroczysty lub biały. Jeśli umieścisz preparat tkankowy w HL-6 bez glutaminianu, w temperaturze pokojowej, prawdopodobnie będzie on rytmicznie kurczył się, ponieważ generatory wzorców ruchowych w OUN są aktywne. 
	 
	Unikaj używania preparatów z ewidentnie skurczonymi lub nieregularnie skurczonymi mięśniami ściany ciała. 
	 
	Nienaruszona ściana ciała wywinięta na lewą stronę ma tendencję do składania się na pół wzdłuż linii środkowej grzbietowej i brzusznej, w związku z czym preparat pozwala na wizualizację lewej lub prawej „hemi-zwierzęcia”.</li>
	<li>1.9 Zamocuj tkankę w komorze komercyjnej o małej objętości, takiej jak komora Warnera, lub na szkiełku mikroskopowym z mostkowym układem szkiełka nakrywkowego. Sugestie dotyczące mocowania tkanek znajdują się w części 3.</li>
</ol>
Część 2: Znakowanie butonów neuronalnych za pomocą przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko HRP znakowanego fluorescencyjnie.
<ol>
	<li>Nanieś 50 µL fluorescencyjnie znakowanego przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko HRP w roztworze HL-6 w formie kropli na szalkę Petriego. Zanurz preparat wywiniętej na drugą stronę ściany ciała w kąpieli z barwnikiem. Znakowanie zakończeń neuronów może być widoczne po około 5 minutach, jednak w celu uzyskania pełnego i jasnego znakowania należy inkubować przez 10-20 minut.</li>
	<li>Płucz preparat w roztworze HL-6 przez 10-30 sekund w temperaturze pokojowej, aby usunąć nadmiar barwnika. Niezwiązany barwnik zostaje szybko wypłukany, więc cykl płukania nie musi być intensywny.</li>
	<li>W razie potrzeby dostosuj stężenie barwnika oraz czas inkubacji.</li>
</ol>
Część 3: Znakowanie przestrzeni perysynaptycznej koniugatem dekstranu z fluoroforem
<ol>
	<li>Rozcieńczyć barwnik dekstran sprzężony z fluoresceincją w roztworze HL-6. Stężenie, które sprawdziło się w naszych celach, wynosiło:</li>
	<li>Jeśli czas dostania się barwnika do przestrzeni zewnątrzkomórkowej nie jest krytyczny, nanieść kroplę 20 µL barwnika na „mostkową” szkiełko podstawowe (patrz część 4) i umieścić preparat w kąpieli z barwnikiem.</li>
</ol>
Część 4: Montowanie tkanki do wizualizacji (za pomocą mikroskopii konfokalnej).
Jeśli nie ma potrzeby perfuzji preparatu (krótkie obserwacje) lub chcą Państwo ograniczyć objętość kąpieli HL-6, należy zastosować metodę szkiełka z podwójnym mostkiem
Jeśli chcą Państwo przeprowadzić perfuzję preparatu, zaleca się zastosowanie komory perfuzyjnej. W naszych badaniach wykorzystaliśmy zmodyfikowaną komorę firmy Warner Instruments.
Szczegóły obu przypadków znajdują się poniżej.
Montaż preparatu na szkiełku z podwójnym mostkiem.
<ol>
	<li>Należy użyć bardzo czystego szkiełka przedmiotowego. Za pomocą superglue należy przykleić dwa kwadratowe szkiełka nakrywkowe 18 mm (#1.5) do szkiełka przedmiotowego, pozostawiając 2 mm odstępu między krawędziami nakrywek.</li>
	<li>Należy poczekać do całkowitego wyschnięcia kleju, w przeciwnym razie na wodnym medium wokół preparatu może utworzyć się niepożądany film.</li>
	<li>Larwy wywinięte na lewą stronę należy umieścić między krawędziami szkiełek nakrywkowych. W przypadku dużych larw oraz ograniczonej matrycy pikseli systemu akwizycji obrazu, może być konieczne ustawienie preparatu po przekątnej.</li>
	<li>Tkankę należy przykryć bardzo czystym szkiełkiem nakrywkowym #1.5, 18 mm. „Górną” nakrywkę należy przykleić do szkiełka przedmiotowego i bocznych nakrywek za pomocą minimalnej ilości wazeliny.</li>
	<li>Na górną nakrywkę należy nanieść kroplę specjalistycznego oleju immersyjnego Cargill o współczynniku załamania światła 1.3379 (w przypadku użycia HL-6), a następnie obrócić cały zespół.</li>
	<li>Zespół z tkanką należy umieścić na mikroskopie stroną z olejem w stronę obiektywu i ustawić ostrość obiektywu. 
	Montaż tkanki w zmodyfikowanej komorze perfuzyjnej.</li>
	<li>Do komory RC 20 należy przykleić szkiełko nakrywkowe 1.5, tworząc dno. Tkankę należy umieścić w komorze zgodnie z instrukcją obsługi RC-20. Aby utworzyć górną część komory, zamiast szkiełka nakrywkowego należy użyć kawałka siatki Nytex.</li>
</ol>
Część 5: Reprezentatywne wyniki:
<ol>
	<li>Sekwencja preparowania tkanki metodą wywinięcia na lewą stronę: 
	<img alt="Stadia larwy owada; zbliżenie mikroskopowe; obserwacja zmian rozwojowych." src="/files/ftp_upload/1154/fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1"> 
	Larwy W3, wypłukane (fenotyp „Tubby”) ( 5.1.1). Larwy W3, wypreparowane 2 tylne segmenty. Widać ciało tłuszczowe wypchnięte z jamy ciała przez nacisk na ścianę ciała (strzałka). Należy starać się zminimalizować „erupcję” trzewną, wykonując niewielki otwór w ścianie ciała na 1 minutę przed sekcją ( 5.1.2). Preparat z wypreparowanymi trzewiami przed wywinięciem na lewą stronę (5.1.3). Preparat, w większości wywinięty, ze szpilką (strzałka) wewnątrz światła preparatu (5.1.4). Mięsień znajduje się teraz na zewnątrz, a kutykula wewnątrz, z przyczepionymi fragmentami ciała tłuszczowego i tracheolami (5.1.5). W pełni wypreparowany preparat tkankowy z usuniętą niemal całą częścią ciała tłuszczowego i tracheolami (5.1.6). 
	<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna białek GFP i α-HRP w synapsach neuronowych, pokazująca lokalizację białek." height="200" src="/files/ftp_upload/1154/fig2a.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rysunek 2"></li>
	<li>Znakowanie na żywo z użyciem anty-HRP w larwalnym NMJ. Reprezentatywna synapsa nerwowo-mięśniowa larwy W3 z wypustką glejową (preparat wywinięty na lewą stronę). Zakończenia butonów neuronu ruchowego są znakowane przeciwciałem pierwszorzędowym przeciwko HRP (magenta), które jest sprzężone z Cy5. Wypustki glejowe są znakowane GFP (zielony). 
	<img alt="Mikroskopia fluorescencyjna GFP/dsRed/Dextran, obrazowanie łączności neuronowej, schemat pokazuje znakowanie białek." src="/files/ftp_upload/1154/fig2b.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rysunek 3"></li>
	<li>Przestrzeń perysynaptyczna zwizualizowana fluorescencyjnie za pomocą dekstranu Alexa 680 w preparacie wywiniętym na lewą stronę. Wypustka glejowa (zielona) jest znakowana GFP targetowanym do błony. Postsynaptyczne SSR na powierzchni mięśnia (niebieski) jest znakowane dsRed. Dekstran Alexa (czerwony) koncentruje się w obszarach zewnątrzkomórkowych. Barwnik dekstran tworzy baseny w kształcie pączka w przestrzeniach perysynaptycznych. Znakowanie dekstranem oraz znakowane dsRed SSR są przedstawione w skali szarości. Zwróć uwagę na liczne baseny barwnika w kształcie pączka podkreślające przestrzenie perysynaptyczne (strzałka).</li>
</ol>

<ol><li>Macleod, G. T., Marin, L., Charlton, M., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+Vesicles%3A+Test+for+a+role+in+presynaptic+Calcium+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic Vesicles: Test for a role in presynaptic Calcium regulation.</a> J. Neurosci. 24, 2496-2505 (2004).</li>
<li>Macleod, G. T., Hegstro, M., Wojtowicz, M., Charlton, M. P., Atwood, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+Calcium+signals+in+Drosophila+motor+neuron+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Fast Calcium signals in Drosophila motor neuron terminals.</a> J. Neurophysiology. 88, 2659-2663 (2002).</li>
<li>Morales, M., Ferrus, A., Martinez-Padron, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+calcium-channel+currents+in+normal+and+csp+mutant+Drosophila+peptidergic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Presynaptic calcium-channel currents in normal and csp mutant Drosophila peptidergic terminals.</a> Eur J Neurosci. 11, 1818-1826 (1999).</li>
<li>Stork, T., Engelen, D., Krudewig, A., Silies, M., Bainton, R. J., Kla¨mbt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organization+and+Function+of+the+Blood%E2%80%93Brain+Barrier+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Organization and Function of the Blood–Brain Barrier in Drosophila.</a> J. Neurosci. 28, 587-597 (2008).</li>
</ol>

Niniejsza procedura umożliwia długotrwałe obrazowanie żywych, znakowanych białek oraz procesów komórkowych. Opisane przez nas przygotowanie tkanki in situ posiada nienaruszone i funkcjonujące OUN, Obwodowy Układ Nerwowy oraz łuki odruchy. Przygotowanie to wykazuje zalety nad standardowymi protokołami dotyczącymi mięśni larw muchy, w których mięśnie ściany ciała larwy są rozciągane (podczas ich przypinania). Rozciąganie może zniekształcać morfologię synaptyczną i wywoływać skurcze odruchowe. Nasz preparat typu „i...

<table><tbody><tr><td>HL-6: Sztuczna hemolimfa Drosophila z dodatkiem 5 mM L-glutaminianu i 2 mM wapnia.</td><td>Odczynnik</td><td>N/A</td><td>NA</td><td>5 mM L-glutaminianu blokowało skurcze mięśni. Użyto L-glutaminianu klasy molekularnej (Sigma). Stężenie 2 mM wapnia jest zbliżone do fizjologicznego poziomu wapnia w naturalnej hemolimfie larwalnej. Referencje: Macleod et al 2002 i Macleod 2004</td></tr><tr><td>Dekstran, Alexa Fluor 680; 10 000 MW, anionowy, możliwy do unieruchomienia</td><td>Odczynnik</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D34680</td><td>Należy użyć komory perfuzyjnej o małej objętości, aby utrzymać niską całkowitą objętość barwnika</td></tr><tr><td>Koniugat anty-HRP-CY5 (kozia</td><td>Odczynnik</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>123-175-021</td><td>Rozpuścić 2,0 mg w 1 ml ddH2O; rozdzielić na aliquoty po 4 µL. Zamrozić w temperaturze &amp;#8211;20°C. Jeden aliquot rozcieńczyć w 100 µL HL-6</td></tr><tr><td>Zestaw do znakowania przeciwciał Alexa 647</td><td>Odczynnik</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>A10475</td><td>Przygotowano łącznie 80 µL skoniugowanego przeciwciała pierwszorzędowego, które przechowywano w aliquotach po 2 µL. Każdy aliquot rozcieńczano w 100 µL HL-6 do znakowania.</td></tr><tr><td>Specjalnie opracowana olejowa emulsja do obiektywów, współczynnik załamania światła 1,3379</td><td>Odczynnik</td><td>Cargill Labs</td><td>Custom Formulated</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta ultraprecyzyjna</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-23 lub 11295-20</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki sprężynowe</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>91500-09</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki do przycinania ultraprecyzyjne</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>Komora perfuzyjna z serii RC 20</td><td>Narzędzie</td><td>Warner Instruments</td><td>64-02222</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalny mikroskop ze skaningowym dyskiem</td><td>Mikroskop</td><td>Quorum Technologies</td><td>Quorum Wave FX</td><td>Zamontowany na odwróconym mikroskopie Leica DMI6000</td></tr></tbody></table>

wizualizacja żywego złącza glio-neuromuscularnego drosophila przy użyciu barwników fluorescencyjnych

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

W naszym projekcie zidentyfikowano struktury glejowe znakowane GFP w rozwijającej się synapsie nerwowo-mięśniowej larwy muchy. Aby badać rozwój żywych synaps glej-nerw-mięsień, opracowaliśmy preparat tkankowy larwy, który zachowywał cechy żywych, nienaruszonych larw, wykazując jednocześnie korzystne właściwości optyczne. Nowy preparat ten umożliwił również dostęp perfuzatów do synapsy. Wykorzystaliśmy larwy muchy, zanurzyliśmy je w sztucznej hemolimfie, a następnie schłodziliśmy, aby rozluźnić ich naturalne rytmiczne skurcze ciała. Następnie odcięto tylne segmenty każdego zwierzęcia, a za pomocą tępej szpilki entomologicznej przesunięto części gębowe do tyłu przez jamę ciała. Doprowadziło to do wywinięcia ściany ciała larwy, podobnie jak przy wywijaniu skarpetki na lewą stronę. Disekcję zakończono przy użyciu ultraprecyzyjnych nożyczek chirurgicznych, eksponując w ten sposób stronę trzewną mięśni ściany ciała. Struktury glejowe w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) eksponowały ukierunkowany na błonę GFP pod kontrolą promotorów specyficznych dla gleju. Błona postsynaptyczna, czyli SSR (retikula subsynaptyczna) w mięśniu, eksponowała ukierunkowany synaptycznie dsRed. Konieczne było doraźne znakowanie zakończeń neuronów ruchowych, stanowiących trzecią część synapsy. W tym celu zastosowano przeciwciała pierwszorzędowe przeciwko HRP, sprzężone z fluorophorem emitującym światło w bliskiej podczerwieni (far-red). Aby zbadać właściwości dyfuzji barwnika do przestrzeni perisynaptycznej między zakończeniami neuronów ruchowych a SSR, zastosowano roztwór dużych cząsteczek deks‌ترanu sprzężonych z fluorophorem emitującym światło w bliskiej podczerwieni, a następnie wykonano akwizycję obrazów.

Opisaliśmy cechy strukturalne synaps glejowo-neuromuscularnych w nowatorskiej preparacji tkankowej żywych larw muchy typu „Inside-out”, wykorzystując barwniki fluorescencyjne oraz mikroskopię konfokalną. Oznaczyliśmy zakończenia żywych neuronów za pomocą fluorescencyjnych przeciwciał pierwszorzędowych przeciwko HRP, a także zwizualizowaliśmy przestrzeń perisynaptyczną przy użyciu fluorescencyjnych dekstranów.

Wizualizacja żywego złącza glio-neuromuscularnego Drosophila przy użyciu barwników fluorescencyjnych

W naszym projekcie zidentyfikowano struktury glejowe znakowane białkiem GFP w rozwijającej się synapsie nerwowo-mięśniowej larwy muchy. Aby zbadać rozwój żywego układu glej-nerw-mięsień...

Niniejsza procedura rozpoczyna się od przygotowania larwy drosofili w taki sposób, aby została ona wywinięta na drugą stronę, co odsłania powierzchnię komórek mięśniowych ściany ciała oraz związane z nimi neurony ruchowe i komórki ggl, poprzez połączenie barwienia fluorescencyjnego zakończeń presynaptycznych neuronów, endogennej ekspresji GFP i DS red ukierunkowanej na błony komórek glejowych i postsynaptycznych komórek mięśniowych oraz wizualizacji przestrzeni parasynaptycznej. Dzięki zastosowaniu barwników fluorescencyjnych w preparacie żywym można zaobserwować wyraźny obraz zmian strukturalnych zachodzących w glejowym złączu nerwowo-mięśniowym. Witam, nazywam się D Brink i pracuję w laboratorium ALS Vanessy na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej w Departamencie Zoologii. Dzisiaj zaprezentuję przygotowanie tkanki oraz dwie techniki znakowania komórek do obrazowania żywej tkanki larw al za pomocą mikroskopii konfokalnej.Stosujemy tę procedurę w laboratorium do badania komórek glejowych w synapsie nerwowo-mięśniowej. Przechodząc teraz do zupełnie innego zagadnienia, przygotowanie tkanki metodą „inside out” rozpoczyna się od określenia stadium rozwoju larw. Procedura ta zostanie zaprezentowana na larwach w trzecim stadium wędrownym (W3), ponieważ są one duże i łatwe do sekcji; należy używać wyłącznie aktywnych, pełzających larw W3.Następnie oczyść powierzchnię larw za pomocą bardzo miękkiego pędzla w szalce Petriego z wodą dwukrotnie destylowaną. Oczyszczanie larw jest istotne, ponieważ zapewnia lepszą jakość obrazu optycznego oraz redukuje liczbę bakterii. Po oczyszczeniu larw przenieś je do małej szalki Petriego zawierającej 3 mL lodowatego medium HL6 z 5 mM glutaminianu.Umieść naczynie na lodzie, aż zwierzę przestanie się poruszać i rozluźni, co zazwyczaj trwa około dwóch minut. Gdy larwa przestanie się poruszać, można rozpocząć sekcję tkanek przy użyciu mikroskopu sekcyjnego, trzymając nożyczki sprężynowe w dominującej dłoni oraz bardzo cienkie pęsety. Drugą ręką, delikatnie dociskając zwierzę do dna naczynia, wykonaj nożyczkami niewielki otwór w ścianie ciała, aby wyrównać ciśnienie w obrębie ściany ciała.Za pomocą pęsety odetnij dwa tylne segmenty, a następnie odseparuj wnętrzności. Część ciała tłuszczowego prawdopodobnie zostanie wypchnięta z jamy ciała przez nacięcie. Odetnij również tę tkankę.Nadal delikatnie przytrzymuj larwy przy dnie szalki za pomocą cienkich pęsety. Drugą ręką chwyć tępy szpilkę entomologiczną numer zero i dociśnij ją do aparatów gębowych larwy. Przepchnij aparat gębowy przez jamę ciała, podobnie jak wywijając skarpetkę na pięści.Tkanka wywinięta na drugą stronę powinna wyglądać w ten sposób. Za pomocą ultraprecyzyjnych nożyczek sekcyjnych usuń ciało tłuszczowe i tchawki ze ściany ciała. Usuń jak największą ilość ciała tłuszczowego.Należy bardzo uważać, aby nie pociągnąć tchawików ani nie przerwać połączeń układu nerwowego. Zerwanie tchawików spowoduje powstanie dziur w mięśniach ściany ciała. Po zakończeniu sekcji mięsień powinien być przezroczysty i rozluźniony, a nie mętny lub skurczony.Jeśli umieści się mięsień w roztworze HL 6 bez glutaminianu w temperaturze pokojowej, prawdopodobnie będzie on rytmicznie kurczyć się. Ponieważ generatory wzorców ruchowych w OUN są aktywne, nienaruszona, wywinięta na drugą stronę ściana ciała ma tendencję do składania się na pół wzdłuż linii środkowej grzbietowej i brzusznej. W związku z tym preparat umożliwia wizualizację lewej lub prawej połowy zwierzęcia.Na koniec zamocuj tkankę na szkiełku przedmiotowym z użyciem mostka pod szkiełkiem nakrywką. Procedury mocowania tkanki zostaną pokazane później. Aby rozpocząć znakowanie batonów neuronalnych, pipetuj 30 µL roztworu znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko HRP w HL six i nanieś kroplę na szalkę Petriego.Następnie zanurz preparat ściany ciała wywiniętej na lewą stronę w kąpieli z barwnikiem. Oznakowanie zakończeń neuronów może być widoczne po około pięciu minutach, jednak należy inkubować próbkę przez 10 do 20 minut, aby uzyskać pełne i intensywne znakowanie.Aby wypłukać nadmiar znacznika HRP, należy umieścić tkankę w 0,5 ml buforu HL6 na 10 do 30 sekund w temperaturze pokojowej. Niezwiązany barwnik wypłukuje się szybko, dlatego cykl płukania nie musi być długi ani intensywny. Oznakowana tkanka jest teraz gotowa do montażu i wizualizacji pod mikroskopem.Wariant protokołu znakowania przeciwciał na żywych komórkach, który został właśnie przedstawiony, polega na zastosowaniu dekstryny sprzężonej z fluoresceincją w celu uwidocznienia wypełnionych płynem przestrzeni zewnątrzkomórkowych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy rozcieńczyć barwnik w postaci dekstryny sprzężonej z fluoresceincją w HL six do stężenia 0.001 mg/mL. Można zmodyfikować stężenie dekstryny, jeśli dokładny czas przenikania do przestrzeni zewnątrzkomórkowej nie jest kluczowy.Nanieś pipetą kroplę 20 µL barwnika na mostek szkiełka nakrywkowego i przenieś preparat tkankowy do kąpieli z barwnikiem. Jeśli tkanka wywinięta na lewą stronę nie wymaga perfuzji lub objętość HL six musi pozostać niewielka, można ją zamocować na szkiełku z podwójnym mostkiem. Rozpocznij od przyklejenia klejem cyjanoakrylowym dwóch kwadratowych szkiełek nakrywkowych o boku 18 mm do bardzo czystego szkiełka przedmiotowego.Pozostaw dwumilimetrową szczelinę między krawędziami szkiełek zakrywkowych i wycentruj tę szczelinę, mniej więcej w połowie okienka preparatu. Pozostaw klej do całkowitego wyschnięcia, w przeciwnym razie utworzy on błonę na powierzchni medium wodnego wokół preparatu tkankowego.Następnie nanieś 30 µL kroplę HL six w szczelinie między szkiełkami podstawowymi. Umieść tkankę wywiniętą na lewą stronę w kropli HL six. Jeśli larwa jest duża, a system akwizycji obrazu posiada ograniczoną matrycę pikseli, konieczne może być ułożenie tkanki po przekątnej.Nanieś niewielką ilość wazeliny na krawędzie trzeciego szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm, a następnie połóż je stroną z wazeliną do dołu na dwóch przyklejonych szkiełkach nad tkanką i delikatnie dociśnij. Oto wyniki uzyskane za pomocą dwóch metod ostrego znakowania fluorescencyjnego preparatu larwy wywiniętej na lewą stronę, zarejestrowane przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym. Pierwszy obraz to stos optyczny synapsy glejowo-nerwowo-mięśniowej z żywymi zakończeniami butonowymi znakowanymi przeciwciałami anty-HRP.Na powierzchni komórki mięśniowej widoczne są intensywnie znakowane zakończenia typu guzka neuronowego, zaznaczone kolorem niebieskim. W środkowej części stosu obrazów znajdują się zaznaczone białkiem GFP wypustki glejowe w kolorze zielonym, a także znakowane HRP batony w kolorze niebieskim. Wokół batonów widoczne są przekroje kieszonkowatych SSR (synaptic reticula), czyli sieci synaptycznych, które w środkowej części stosu są zabarwione na czerwono; w głębszych warstwach stosu znajdują się SSR znakowane białkiem DS red.SSR to wyspecjalizowane regiony synaptyczne komórki mięśniowej. BNS gniazdują w kieszeniach w komórkach mięśniowych, podobnie jak niektóre części zielonych wypustek glejowych. Wypustki komórek glejowych przeplatają się wokół BNS i SSR, lecz nie pokrywają powierzchni synapsy niczym koc w najgłębszych warstwach stosu.Obserwujemy zielone wypustki glejowe oraz czerwone SSR, jednak znacznie mniej zakończeń typu buton. Możemy również znaleźć przekroje poprzeczne nerwu ruchowego unerwiającego mięsień. Komórki glejowe owijają nerw ruchowy, dlatego on również jest zielony.Drugim wynikiem ostrego znakowania fluorescencyjnego preparatu larwalnego w orientacji „inside-out” jest fluorescencyjnie znakowana synapsa dekstryną. W tym przypadku płyn w przestrzeni parasynaptycznej lub szczelinie synaptycznej jest znakowany na czerwono. Na warstwach powierzchniowych obrazu z przesuwanego stosu optycznego widoczna jest warstwa płynu z barwnikiem z czerwonej dekstryny i można zauważyć, gdzie gromadzi się on w zagłębieniach pofalowania błony plazmatycznej mięśnia.W głębszych warstwach stosu fluorescencyjny barwnik dekstrynowy przeniknął do szczelin synaptycznych, tworząc między zakończeniami neuronów a niebiesko oznakowanymi kieszonkami SSR małe pierścienie barwnika w kształcie pączka. Jest to szczelina synaptyczna uwydatniona za pomocą barwnika. Zielona lamelka glejowa nie blokuje przenikania barwnika do szczeliny w głębszych warstwach stosu obrazów.Najbardziej charakterystycznymi cechami są zaznaczone na niebiesko SSR lub regiony synaptyczne mięśnia oraz płaskie wyrostki glejowe, które są zielone. Podobnie, pochewka glejowa wokół aksonów pozbawionych unerwienia, widoczna w głębokich warstwach, jest zielona. Wydaje się, że pochewka glejowa wyklucza barwnik dekstrynowy.Właśnie zaprezentowałem Państwu nowatorski sposób wizualizacji synapsy glejowo-nerwowo-mięśniowej w preparacie tkanki larw Drosophila w orientacji „inside out”. Podczas przygotowywania tkanki ważne jest, aby dążyć do bardzo ostrożnego obchodzenia się z materiałem oraz upewnić się, że mięsień jest rozluźniony, a nerwy obwodowe nie zostały uszkodzone. Chciałbym zakończyć cytatem z Marksa.Czas leci jak strzała. Strach leci jak banan.

visualizing-live-drosophila-glial-neuromuscular-junction-with

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wizualizacja aktywnego połączenia Drosophila glialno-nerwowo-mięśniowego za pomocą barwników fluorescencyjnych

Niniejszy protokół demonstruje sposób wykonania immunohistochemii na wypreparowanych larwach Drosophila.

Immunohistochemia NMJ larw Drosophila

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

Niniejszy protokół opisuje sekcję larw Drosophila in vivo w celu obrazowania ruchu pęcherzyków aksonalnych znakowanych białkiem GFP wzdłuż szyn mikrotubularnych.

In vivo wizualizacja pęcherzyków synaptycznych w aksonach segmentowych larw Drosophila

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Źródło: Guan, W., et. al. Wizualizuj Drosophila Aksony neuronu ruchowego nóg przez dorosły naskórek. J. vis. exp. (2018) Ten film pokazuje obrazowanie Drosophila z zielonymi fluorescencyjnymi neuronami ruchowymi eksprymującymi białko za pomocą mikroskopii konfokalnej. Laser i dwa detektory wychwytują GFP i autofluorescencję naskórków. Obrazy są przetwarzane przez dzielenie kanałów, odejmowanie autofluorescencji i łączenie w kolorowy obraz kompozytowy w celu wizualizacji aksonów w segmencie nogi.

Obrazowanie znakowanych fluorescencyjnie neuronów ruchowych w nodze dorosłego Drosophila

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Tutaj ilustrujemy, jak można przeprowadzić mikroskopię lokalizacyjną aktywowaną fotocząsteczką pojedynczej cząsteczki na zakończeniu nerwu ruchowego żywej larwy Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym.

In vivo (in vivo) Śledzenie pojedynczych cząsteczek na presynaptycznym zakończeniu nerwu ruchowego Drosophila

Tutaj opisujemy protokół wizualizacji celowania aksonalnego za pomocą białka fluorescencyjnego w odnóżach dorosłych Drosophila poprzez etapy fiksacji, montażu, obrazowania i po obrazowaniu.

Wizualizuj aksony neuronu ruchowego nóg Drosophila przez naskórek dorosłego człowieka

Opisujemy metodę wstecznego śledzenia embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych.

Wsteczne śledzenie embrionalnych neuronów ruchowych Drosophila za pomocą lipofilowych barwników fluorescencyjnych

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Poznaj metodę inside-out do wizualizacji żywych synaps glejowo-nerwowo-mięśniowych w larwach Drosophila przy użyciu barwników fluorescencyjnych i mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia badanie strukturalnych zmian w czasie rzeczywistym.

Wizualizacja żywego złącza glio-neuromuscularnego Drosophila przy użyciu barwników fluorescencyjnych

Przeglądaj więcej filmów