Wizualizacja żywego złącza glio-neuromuscularnego Drosophila przy użyciu barwników fluorescencyjnych

Niniejsza procedura rozpoczyna się od przygotowania larwy drosofili w taki sposób, aby została ona wywinięta na drugą stronę, co odsłania powierzchnię komórek mięśniowych ściany ciała oraz związane z nimi neurony ruchowe i komórki ggl, poprzez połączenie barwienia fluorescencyjnego zakończeń presynaptycznych neuronów, endogennej ekspresji GFP i DS red ukierunkowanej na błony komórek glejowych i postsynaptycznych komórek mięśniowych oraz wizualizacji przestrzeni parasynaptycznej. Dzięki zastosowaniu barwników fluorescencyjnych w preparacie żywym można zaobserwować wyraźny obraz zmian strukturalnych zachodzących w glejowym złączu nerwowo-mięśniowym. Witam, nazywam się D Brink i pracuję w laboratorium ALS Vanessy na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej w Departamencie Zoologii. Dzisiaj zaprezentuję przygotowanie tkanki oraz dwie techniki znakowania komórek do obrazowania żywej tkanki larw al za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Stosujemy tę procedurę w laboratorium do badania komórek glejowych w synapsie nerwowo-mięśniowej. Przechodząc teraz do zupełnie innego zagadnienia, przygotowanie tkanki metodą „inside out” rozpoczyna się od określenia stadium rozwoju larw. Procedura ta zostanie zaprezentowana na larwach w trzecim stadium wędrownym (W3), ponieważ są one duże i łatwe do sekcji; należy używać wyłącznie aktywnych, pełzających larw W3.

Następnie oczyść powierzchnię larw za pomocą bardzo miękkiego pędzla w szalce Petriego z wodą dwukrotnie destylowaną. Oczyszczanie larw jest istotne, ponieważ zapewnia lepszą jakość obrazu optycznego oraz redukuje liczbę bakterii. Po oczyszczeniu larw przenieś je do małej szalki Petriego zawierającej 3 mL lodowatego medium HL6 z 5 mM glutaminianu.

Umieść naczynie na lodzie, aż zwierzę przestanie się poruszać i rozluźni, co zazwyczaj trwa około dwóch minut. Gdy larwa przestanie się poruszać, można rozpocząć sekcję tkanek przy użyciu mikroskopu sekcyjnego, trzymając nożyczki sprężynowe w dominującej dłoni oraz bardzo cienkie pęsety. Drugą ręką, delikatnie dociskając zwierzę do dna naczynia, wykonaj nożyczkami niewielki otwór w ścianie ciała, aby wyrównać ciśnienie w obrębie ściany ciała.

Za pomocą pęsety odetnij dwa tylne segmenty, a następnie odseparuj wnętrzności. Część ciała tłuszczowego prawdopodobnie zostanie wypchnięta z jamy ciała przez nacięcie. Odetnij również tę tkankę.

Nadal delikatnie przytrzymuj larwy przy dnie szalki za pomocą cienkich pęsety. Drugą ręką chwyć tępy szpilkę entomologiczną numer zero i dociśnij ją do aparatów gębowych larwy. Przepchnij aparat gębowy przez jamę ciała, podobnie jak wywijając skarpetkę na pięści.

Tkanka wywinięta na drugą stronę powinna wyglądać w ten sposób. Za pomocą ultraprecyzyjnych nożyczek sekcyjnych usuń ciało tłuszczowe i tchawki ze ściany ciała. Usuń jak największą ilość ciała tłuszczowego.

Należy bardzo uważać, aby nie pociągnąć tchawików ani nie przerwać połączeń układu nerwowego. Zerwanie tchawików spowoduje powstanie dziur w mięśniach ściany ciała. Po zakończeniu sekcji mięsień powinien być przezroczysty i rozluźniony, a nie mętny lub skurczony.

Jeśli umieści się mięsień w roztworze HL 6 bez glutaminianu w temperaturze pokojowej, prawdopodobnie będzie on rytmicznie kurczyć się. Ponieważ generatory wzorców ruchowych w OUN są aktywne, nienaruszona, wywinięta na drugą stronę ściana ciała ma tendencję do składania się na pół wzdłuż linii środkowej grzbietowej i brzusznej. W związku z tym preparat umożliwia wizualizację lewej lub prawej połowy zwierzęcia.

Na koniec zamocuj tkankę na szkiełku przedmiotowym z użyciem mostka pod szkiełkiem nakrywką. Procedury mocowania tkanki zostaną pokazane później. Aby rozpocząć znakowanie batonów neuronalnych, pipetuj 30 µL roztworu znakowanego fluorescencyjnie przeciwciała pierwszorzędowego przeciwko HRP w HL six i nanieś kroplę na szalkę Petriego.

Następnie zanurz preparat ściany ciała wywiniętej na lewą stronę w kąpieli z barwnikiem. Oznakowanie zakończeń neuronów może być widoczne po około pięciu minutach, jednak należy inkubować próbkę przez 10 do 20 minut, aby uzyskać pełne i intensywne znakowanie.

Aby wypłukać nadmiar znacznika HRP, należy umieścić tkankę w 0,5 ml buforu HL6 na 10 do 30 sekund w temperaturze pokojowej. Niezwiązany barwnik wypłukuje się szybko, dlatego cykl płukania nie musi być długi ani intensywny. Oznakowana tkanka jest teraz gotowa do montażu i wizualizacji pod mikroskopem.

Wariant protokołu znakowania przeciwciał na żywych komórkach, który został właśnie przedstawiony, polega na zastosowaniu dekstryny sprzężonej z fluoresceincją w celu uwidocznienia wypełnionych płynem przestrzeni zewnątrzkomórkowych. Aby rozpocząć tę procedurę, należy rozcieńczyć barwnik w postaci dekstryny sprzężonej z fluoresceincją w HL six do stężenia 0.001 mg/mL. Można zmodyfikować stężenie dekstryny, jeśli dokładny czas przenikania do przestrzeni zewnątrzkomórkowej nie jest kluczowy.

Nanieś pipetą kroplę 20 µL barwnika na mostek szkiełka nakrywkowego i przenieś preparat tkankowy do kąpieli z barwnikiem. Jeśli tkanka wywinięta na lewą stronę nie wymaga perfuzji lub objętość HL six musi pozostać niewielka, można ją zamocować na szkiełku z podwójnym mostkiem. Rozpocznij od przyklejenia klejem cyjanoakrylowym dwóch kwadratowych szkiełek nakrywkowych o boku 18 mm do bardzo czystego szkiełka przedmiotowego.

Pozostaw dwumilimetrową szczelinę między krawędziami szkiełek zakrywkowych i wycentruj tę szczelinę, mniej więcej w połowie okienka preparatu. Pozostaw klej do całkowitego wyschnięcia, w przeciwnym razie utworzy on błonę na powierzchni medium wodnego wokół preparatu tkankowego.

Następnie nanieś 30 µL kroplę HL six w szczelinie między szkiełkami podstawowymi. Umieść tkankę wywiniętą na lewą stronę w kropli HL six. Jeśli larwa jest duża, a system akwizycji obrazu posiada ograniczoną matrycę pikseli, konieczne może być ułożenie tkanki po przekątnej.

Nanieś niewielką ilość wazeliny na krawędzie trzeciego szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm, a następnie połóż je stroną z wazeliną do dołu na dwóch przyklejonych szkiełkach nad tkanką i delikatnie dociśnij. Oto wyniki uzyskane za pomocą dwóch metod ostrego znakowania fluorescencyjnego preparatu larwy wywiniętej na lewą stronę, zarejestrowane przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem wirującym. Pierwszy obraz to stos optyczny synapsy glejowo-nerwowo-mięśniowej z żywymi zakończeniami butonowymi znakowanymi przeciwciałami anty-HRP.

Na powierzchni komórki mięśniowej widoczne są intensywnie znakowane zakończenia typu guzka neuronowego, zaznaczone kolorem niebieskim. W środkowej części stosu obrazów znajdują się zaznaczone białkiem GFP wypustki glejowe w kolorze zielonym, a także znakowane HRP batony w kolorze niebieskim. Wokół batonów widoczne są przekroje kieszonkowatych SSR (synaptic reticula), czyli sieci synaptycznych, które w środkowej części stosu są zabarwione na czerwono; w głębszych warstwach stosu znajdują się SSR znakowane białkiem DS red.

SSR to wyspecjalizowane regiony synaptyczne komórki mięśniowej. BNS gniazdują w kieszeniach w komórkach mięśniowych, podobnie jak niektóre części zielonych wypustek glejowych. Wypustki komórek glejowych przeplatają się wokół BNS i SSR, lecz nie pokrywają powierzchni synapsy niczym koc w najgłębszych warstwach stosu.

Obserwujemy zielone wypustki glejowe oraz czerwone SSR, jednak znacznie mniej zakończeń typu buton. Możemy również znaleźć przekroje poprzeczne nerwu ruchowego unerwiającego mięsień. Komórki glejowe owijają nerw ruchowy, dlatego on również jest zielony.

Drugim wynikiem ostrego znakowania fluorescencyjnego preparatu larwalnego w orientacji „inside-out” jest fluorescencyjnie znakowana synapsa dekstryną. W tym przypadku płyn w przestrzeni parasynaptycznej lub szczelinie synaptycznej jest znakowany na czerwono. Na warstwach powierzchniowych obrazu z przesuwanego stosu optycznego widoczna jest warstwa płynu z barwnikiem z czerwonej dekstryny i można zauważyć, gdzie gromadzi się on w zagłębieniach pofalowania błony plazmatycznej mięśnia.

W głębszych warstwach stosu fluorescencyjny barwnik dekstrynowy przeniknął do szczelin synaptycznych, tworząc między zakończeniami neuronów a niebiesko oznakowanymi kieszonkami SSR małe pierścienie barwnika w kształcie pączka. Jest to szczelina synaptyczna uwydatniona za pomocą barwnika. Zielona lamelka glejowa nie blokuje przenikania barwnika do szczeliny w głębszych warstwach stosu obrazów.

Najbardziej charakterystycznymi cechami są zaznaczone na niebiesko SSR lub regiony synaptyczne mięśnia oraz płaskie wyrostki glejowe, które są zielone. Podobnie, pochewka glejowa wokół aksonów pozbawionych unerwienia, widoczna w głębokich warstwach, jest zielona. Wydaje się, że pochewka glejowa wyklucza barwnik dekstrynowy.

Właśnie zaprezentowałem Państwu nowatorski sposób wizualizacji synapsy glejowo-nerwowo-mięśniowej w preparacie tkanki larw Drosophila w orientacji „inside out”. Podczas przygotowywania tkanki ważne jest, aby dążyć do bardzo ostrożnego obchodzenia się z materiałem oraz upewnić się, że mięsień jest rozluźniony, a nerwy obwodowe nie zostały uszkodzone. Chciałbym zakończyć cytatem z Marksa.

Czas leci jak strzała. Strach leci jak banan.