Disekcja i rejestracja z połączenia nerwowo-mięśniowego C. elegans

Szkiełko podstawowe powlekone sogarem, przygotowane poprzez rozprowadzenie kropli sogaru na szkle i utwardzanie przez noc, umieszcza się w okrągłym wgłębieniu prefabrykowanej komory rejestracyjnej i zalewa roztworem rejestracyjnym. Nicienia umieszczonego w centrum przykleja się do powierzchni osłony progu, zaczynając od głowy lub ogona, nakładając klej na stronę grzbietową ciała za pomocą pipety do kleju. Po zakończeniu przyklejania, za pomocą szklanej igły wykonuje się nacięcie obok vulvy, na styku kutykuli i kleju, a następnie rozszerza się je w kierunku głowy, usuwając wnętrzności i jaja z jamy ciała.

Przeciętą krawędź nacięcia punktowo przykleja się klejem do podłoża (sogar), odsłaniając nerw brzuszny i mięśnie ściany ciała. Mięsień brzuszny przyśrodkowy przedряд vulva zostaje poddany metodzie patch-clamp, a elektrodę stymulującą umieszcza się powyżej wzdłuż sznura nerwowego. Witam, nazywam się Janet Richmond, jestem profesorem adiunktem w Katedrze Nauk Biologicznych na University of Illinois Chicago.

Dzisiaj zaprezentuję technikę sekcji, która pozwala na odsłonięcie złączy nerwowo-mięśniowych u morskich węgorzyc. Do rejestracji elektrofizjologicznej. Wykorzystujemy ten preparat do badania przekaźnictwa synaptycznego.

Zacznijmy. Przed rozpoczęciem pracy z nicieniami, co najmniej jeden dzień przed procedurą, należy przygotować niezbędne akcesoria: komorę do rejestracji sekcji, szkiełka nakrywkowe powlekane S guard, stare pipety, aplikator do kleju oraz pipetę do ekstrakcji.

Rozpocznij od zbudowania komory. Dotnij arkusz pleksiglasu o grubości 1/16 cala tak, aby pasował do stolika mikroskopu. Rejestracje należy przeprowadzać w centrum pleksiglasu.

Wywierć okrągły otwór o średnicy wystarczającej do zamocowania okrągłego szkiełka podstawowego o średnicy 22 mm. Przymocuj szkiełko podstawowe o wymiarach 48 × 60 mm do dolnej strony komory pod otworem, używając w każdym rogu szkiełka grudki wosku do zatapiania tkanek o niskiej temperaturze topnienia. Wosk należy szybko roztopić na płycie grzejnej; po ochłodzeniu pozostanie cienka warstwa wosku pomiędzy pleksiglasem a szkiełkiem podstawowym. Nadmiar wosku należy odciąć ostrzem.

Szkiełko nakrywkowe pasujące do komory to szkiełko pokrywowe o średnicy 22 mm z powłoką S guard. Aby SARD działało, musi zostać przygotowane na świeżo zgodnie z instrukcjami producenta. Po przygotowaniu na każde szkiełko nakłada się małą kroplę SARD, którą następnie rozprowadza się za pomocą ostrza, aby uzyskać równomierną powierzchnię.

Powlekane szkiełka nakrywkowe umieszcza się następnie w zamkniętych pojemnikach i pozostawia na noc w piecu w temperaturze 65 °C w celu utwardzenia. Będą one gotowe do przeprowadzenia sekcji zgodnie z protokołem w następnym dniu. Wymagane są pipety z krzemionkowego szkła o średnicy zewnętrznej 1 mm, wyciągnięte do końcówki o oporności około 4 MΩ, dlatego warto mieć przygotowany słoik z takimi pipetami.

Zapoznaj się z publikacją JoVE dotyczącą przygotowywania patchy, pipet i ostrych elektrod za pomocą programowalnego polaryzatora autorstwa Miriam Goodman. Aby uzyskać szczegóły techniczne niezbędne do przeprowadzenia elektrofizjologii, nicień musi zostać przyklejony w miejscu. W tym celu wymagany jest aplikator do kleju.

Aplikator do kleju to po prostu plastikowa rurka o długości dwóch milimetrów i średnicy wewnętrznej jednego milimetra. Jeden koniec rurki trzyma się w ustach. Można go wyposażyć w ustnik, natomiast w drugim końcu rurki umieszcza się pipetę o średnicy jednego milimetra wypełnioną klejem.

Podczas sekcji wykorzystuje się również specjalistyczną pipetę ekstrakcyjną. Składa się ona z rurki i pipety, podobnie jak aplikator do kleju, z tą różnicą, że końcówka pipety jest lekko ścięta, aby pomieścić jaja i wnętrzności. Należy rozpocząć od narysowania linii z wosku wzdłuż obwodu komory.

Teraz dociśnij i umieść szkiełko nakrywkowe pokryte Sylgardem, skierowanym stroną z powłoką Sylgard do góry. Linia wosku unieruchamia szkiełko nakrywkowe i zapobiega przedostawaniu się roztworu rejestracyjnego pod nie, co mogłoby spowodować przesunięcie szkiełka podczas sekcji i rejestracji. Następnie komorę wypełnia się zewnątrzkomórkowym roztworem rejestracyjnym. Skład roztworu znajduje się w tekście towarzyszącym; po jego przygotowaniu komora jest gotowa.

Za pomocą igły do nicieni należy przenieść kilka osobników do roztworu. Przy wprawie pływające nicienie można przyklejać bez stosowania dodatkowych procedur zapobiegających ruchom. Aby móc pracować z klejem, należy napełnić pojemnik na klej wykonany z nakrętki do PCR osadzonej w wosku lub plastelinie gotowym roztworem akrylowego kleju Sano.

Dokończ budowę aplikatora kleju, mocując pipetę rejestrującą do jego końca. Następnie, korzystając z mikroskopu stereoskopowego, napełnij aplikator kleju poprzez zasysanie ustami. Przytwierdzanie kleju do nicienia jest trudne i wymaga wprawy, ponieważ klej polimeryzuje w kontakcie z pozakomórkowym roztworem rejestrującym.

Aby temu zapobiec, należy utrzymać stały przepływ kleju na zewnątrz, w przeciwnym razie stwardnieje on i zapcha pipetę. Jeśli pipeta zostanie zapchana, czasami można ją odblokować, delikatnie stukając końcówką o lamellkę. Należy przećwiczyć pracę z klejem.

Kiedy będą Państwo w stanie napisać swoje nazwisko klejem na osłonie sil, prawdopodobnie będą Państwo gotowi do przyklejenia kutykuli nicienia, aby unieruchomić organizm. Po pierwsze, należy wybrać osobnika znajdującego się blisko centrum komory, gdzie istnieje wystarczająca przestrzeń do pracy. Po drugie, należy nanieść niewielką ilość kleju na głowę lub ogon nicienia i szybko przycisnąć go do powierzchni osłony sil.

Następnie nałóż strumień kleju wzdłuż grzbietowej krawędzi kutykuli nicieni. Wymusi to u nicienia pozycję w kształcie litery C, z wulkanizacją skierowaną do wewnątrz. Wszelkie przerwy w linii kleju należy wypełnić, aby zapewnić maksymalną adhezję nicienia do sylgardu.

Jest to skomplikowany proces, dlatego pomocne może być przeprowadzenie ćwiczeń na mutantach o obniżonej ruchliwości. Tak jak w przypadku 31, tuż po prawej stronie znajduje się pęcherzyk. Teraz przesunę preparat w kierunku okrężnym, a następnie wprowadzę szklaną igłę i wykonam nacięcie. Aby wykonać nacięcie kutykuli, należy przełączyć się na ręczną pipetę do sekcji.

Pipeta ta musi być ostrzejsza od pipet do utrwalania klejem i posiadać krótki, sztywny trzon, aby umożliwić pracę przy najwyższym powiększeniu. Pod mikroskopem stereoskopowym należy ustawić pipetę równolegle do osi podłużnej nicienia i wprowadzić jej końcówkę w pobliżu wulwy, w miejscu styku kutykuli z klejem. To nacięcie uwalnia ciśnienie hydrostatyczne nicienia, co powoduje wypchnięcie jaj oraz jelit przez miejsce nacięcia.

Kontynuuj wycinanie kutykuli w kierunku głowy nicienia, wykonując ruchy tnące podobne do otwierania koperty, aż dotrzesz do gardła. Następnie przełącz się na pipetę ekstrakcyjną, aby odessać organy wewnętrzne nicienia. Po oczyszczeniu nacięcia otwarta kutykula zachowa swój cylindryczny kształt.

Następnie należy pobrać nową pipetę do klejenia. Używając jej, należy punktowo przykleić kutykulę na krawędzi nacięcia do powierzchni sylgardu. Na tym etapie ważne jest stosowanie minimalnej ilości kleju, aby uniknąć uszkodzenia lub przysłonięcia njs.

Brzuszny sznur nerwowy i mięśnie ściany ciała są teraz odsłonięte, jednak należy jeszcze usunąć błonę podstawną pokrywającą NMJ. Aby to zrobić, odessać roztwór do rejestracji zewnątrzkomórkowej z komory i aplikować roztwór do rejestracji zewnątrzkomórkowej z dodatkiem kolagenazy w stężeniu 0,4 mg/mL. Po 10 do 20 sekundach usunąć kolagenazę i kilkukrotnie przemyć preparat świeżym roztworem do rejestracji.

Nicień jest teraz gotowy do pomiarów elektrofizjologicznych. W miejscu złącza nerwowo-mięśniowego (NMJ) ustaw komorę pomiarową na stoliku mikroskopu pionowego, używając obiektywu 10x, aby wycentrować nicienia, następnie przełącz na obiektyw imersyjny wodny 40x z optyką DIC i sprawdź, czy mięśnie ściany ciała oraz sznur nerwowy są nienaruszone. Ustaw nicienia poziomo, tak aby elektrody można było wprowadzić zarówno z lewej, jak i z prawej strony.

Zazwyczaj wykonujemy patch-clamp w obrębie brzusznej części środkowej ciała, wybierając mięśnie położone wewnętrznie względem vulvy, jednak można z łatwością przeprowadzić tę procedurę również w przypadku mięśni po stronie grzbietowej i brzusznej nicienia, w pobliżu kilku neuronów, które kształtem przypominają półkola przylegające do mięśnia. Następnie należy przeprowadzić patch-clamp mięśnia, stosując standardowe techniki, aby uzyskać giga-uszczelnienie (gigaseal). W naszym doświadczeniu elektrody rejestrujące o rezystancji około 4 MΩ sprawdzają się dobrze w trybie rejestracji voltage clamp w konfiguracji whole-cell.

Zwiększ siłę ssania i stymuluj membranę impulsem elektrycznym, aż do przerwania uszczelnienia gigo. Wspominaliśmy o uzyskaniu rezystancji rzędu 4 MΩ. Jeśli spojrzycie tutaj, tak, widnieje tam wartość 4,9 MΩ.

Jest większe, to normalne. Mieści się w przedziale, którego używamy. Dobrze. Tak. Teraz spróbujemy zwiększyć skalę, więc co dalej?

Co? Chcemy, aby to zeszło na sam dół. Tak. Mam to. Super.

W przypadku dobrego pomiaru mięśnie ściany ciała dorosłych nicieni typu dzikiego mają zazwyczaj pojemność błony komórkowej wynoszącą około 70 pF i mogą być stabilnie rejestrowane przez co najmniej 10 minut przy potencjale utrzymującym wynoszącym -60 mV z minimalnymi prądami utrzymującymi, wynoszącymi około 50 pA. Po wykonaniu patch-clampu komórki mięśniowej, stymulacja za pomocą drugiej elektrody, kanału aktywowanego światłem, Rodin lub dodanie roztworu hiperosmotycznego wywoła mierzalne odpowiedzi. Aby wywołać odpowiedź elektryczną, zazwyczaj umieszczamy elektrodę stymulującą zawierającą roztwór zewnątrzkomórkowy na brzusznym sznurze nerwowym, wewnątrz w stosunku do badanej komórki mięśniowej.

Ta konfiguracja typu loose patch wymaga impulsów prądu o czasie trwania od jednego do dwóch milisekund przy napięciu między 10 a 40 voltami. Niestety, po kilku odpowiedziach wywołanych, sznur nerwowy ulega nieodwracalnemu uszkodzeniu i z nieznanych przyczyn w tej konfiguracji można wywołać jedynie odpowiedzi cholinergiczne. Alternatywnie, do wywołania uwalniania można wykorzystać nicienie wykazujące ekspresję kanału aktywowanego światłem, gdzie transgen dosin znajduje się w różnych populacjach neuronalnych.

Przygotowując się do tej metody, należy pamiętać, że nicienie wykorzystywane w tej aplikacji muszą być hodowane na bakteriach wzbogaconych retinolem. W tym przygotowaniu zastosowano wysoko wydajną diodę LED o długości fali 470 nanometrów, filtrowaną przez filtr wzbudzenia GFP od 450 do 490 nanometrów, aby wielokrotnie aktywować opsynę kanałową, co wywołuje uwalnianie różnych neurotransmiterów w zależności od tego, które typy komórek wykazują ekspresję kanału. Ostatnią omawianą techniką można posłużyć się do pomiaru wielkości puli pęcherzyków synaptycznych gotowych do uwolnienia z kilku neuronów na rejestrowany mięsień.

Osiąga się to poprzez podanie impulsowe nadciśnienia hiperosmotycznego roztworu zewnątrzkomórkowego na miejsce patchowania mięśnia przez jedną do trzech sekund. Wynikiem będzie seria asynchronicznych zdarzeń postsynaptycznych. Przedstawiono rejestracje potencjału błonowego w konfiguracji whole-cell dla mięśni ściany ciała dla każdego z trzech opisanych powyżej protokołów stymulacji: odpowiedzi wywołane elektrycznie, wywołane światłem oraz hiperosmotycznie.

W każdym przypadku mięsień brzuszno-przyśrodkowej ściany ciała jest utrzymywany w potencjale -60 mV. Komórki mięśniowe typu dzikiego zazwyczaj wykazują wysoką częstość endogennych dośrodkowych miniaturowych prądów synaptycznych. W naszych standardowych roztworach rejestracyjnych depolaryzacja przedniego brzusznego sznura nerwowego trwająca 2 ms powoduje synchroniczne uwalnianie z kilku synaps, co skutkuje dużą odpowiedzią wywołaną o natężeniu około 2 do 2,5 nA.

W przypadku nicieni typu dzikiego, reprezentatywne zapisy po prawej stronie śladów typu dzikiego w A i B pokazują uwalnianie synaptyczne u mutanta z ciężkimi zaburzeniami koordynacji na 18 panel C pokazuje odpowiedź wywołaną światłem z połączenia nerwowo-mięśniowego nicienia typu dzikiego wykazującego ekspresję channel red dosin. W neuronach cholinergicznych dwumilisekundowy impuls światła zazwyczaj wywołuje odpowiedź rzędu 1,5 do 1,8 nano amps. Wtrysk ciśnieniowy soli hiperosmotycznej 850 Milli osmo na mięsień przez jedną sekundę wywołuje asynchroniczną serię miniaturowych prądów synaptycznych reprezentujących pulę pęcherzyków gotowych do uwolnienia.

Właśnie zaprezentowałem technikę sekcji, której używamy do odsłonięcia złączy nerwowo-mięśniowych u sea elegance oraz do przeprowadzania pomiarów elektrofizjologicznych. Należy pamiętać, że technika ta jest wymagająca i prawdopodobnie opanowanie jej zajmie Państwu kilka miesięcy. Jednak raz nabyta, staje się umiejętnością intuicyjną.

Techniki te pozostaną w Państwa pamięci, a im częściej będą one stosowane, tym przygotowanie stanie się szybsze i bardziej niezawodne. To wszystko na dziś. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.