Infekcja wirusem vaccinia oraz analiza czasowa ekspresji genów wirusa: Część 1

Badanie przebiegu czasowego infekcji komórek HeLa wirusem vaccinia rozpoczyna się od przygotowania infekcji wirusowej, zainfekowania komórek, a następnie wyizolowania RNA z zainfekowanych komórek w kilku punktach czasowych po infekcji. RNA to może zostać później amplifikowane w celu hybrydyzacji z mikromacierzami do analizy ekspresji genów. Witam, nazywam się Judy Ann z laboratorium Kate Irvins w Whitehead Institute for Biomedical Research.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę zakażenia wirusem vaccinia w komórkach ssaczych w określonych odstępach czasu oraz następującą po nim ekstrakcję RNA z zakażonych komórek w różnych punktach czasowych po zakażeniu. Technika ta jest wstępnym etapem szerszego protokołu mającego na celu ekstrakcję i amplifikację RNA w celu oceny ekspresji genów wirusa podczas infekcji, co zostanie omówione w dwóch kolejnych filmach JoVE. Przejdźmy zatem do realizacji. Aby przygotować się do zakażenia, należy wyhodować komórki HeLa w kolbach i poczekać, aż komórki osiągną około 80% konfluencji.

Następnie należy przygotować wystarczającą ilość pożywki do wzrostu wirusów na potrzeby eksperymentu. Wykorzystując standardowe DMEM z 2% FBS i bez dodatku antybiotyków, infekcję można przeprowadzić z użyciem albo dostępnego zapasu wirusa ospy prawdziwej o znanym mianie, albo wirusa oczyszczonego sacharozą o znanym mianie. Jeśli istnieje obawa o ekspresję genów gospodarza i używany jest wirus oczyszczony sacharozą, należy przejść do następnej sekcji.

Jeśli używasz surowego wirusa vaccinia, poddaj sonikacji zapas i podziel wirusa na alikwoty bezpośrednio przed infekcją; w przypadku sonikacji w kubku, użyj kąpieli składającej się głównie z lodu i niewielkiej ilości wody, ustawiając moc około 30 W na 20 sekund. Wymieszaj zawartość probówki w wiertaku (vortex) i powtórz sonikację trzy razy, dodając w razie potrzeby więcej lodu, aby kubek pozostał wypełniony lodem i schłodzony; pamiętaj o mieszaniu w vortexie pomiędzy każdym etapem sonikacji. Jeśli nie posiadasz sonikatora kubkowego, zmieszaj równą objętość surowego zapasu wirusa w stężeniu 0,25 mg/mL.

Wigorозnie wymieszaj stok wirusa z trypsyną za pomocą wortexa, a następnie inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut. W odstępach od 5 do 10 minut mieszaj próbkę wortexem w celu przygotowania do zakażenia komórek. Najpierw oblicz liczbę cząsteczek wirusa niezbędną do zakażenia monowarstwy przy pożądanej wielokrotności zakażenia (MOI).

Lub MOI. Zazwyczaj do przebiegów czasowych infekcji stosuje się wysoką MOI w zakresie od 5 do 10. Następnie należy dodać odpowiednią ilość wirusa oczyszczonego sacharozą lub surowego wirusa z hodowli trypsynowej do podłoża do wzrostu wirusów w temperaturze 37 °C i dobrze wymieszać.

Należy użyć takiej ilości pożywki, aby zaledwie pokryła dno kolby. Dla kolby T 1 75 wystarczające będzie 10 milliliters pożywki. Usunąć pożywkę z komórek i wypłukać PBS w temperaturze pokojowej.

Do każdej kolby dodaj wirusa lub pożywkę do hodowli wirusów w celu przygotowania prób kontrolnych dla punktu czasowego zero. W próbkach kontrolnych dodaj wyłącznie pożywkę do hodowli wirusów, bez dodawania samego wirusa. Delikatnie zamieszaj i przechylaj płytki, a następnie inkubuj w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2 przez jedną godzinę. Pamiętaj, aby przechylać i mieszać płytki co 15 minut, aby równomiernie rozprowadzić wirusa i zapobiec wysychaniu komórek.

Po inkubacji usunąć pożywkę zawierającą wirusa i wypłukać trzy razy roztworem PBS o temperaturze pokojowej. Do każdej kolby dodać maksymalną ilość pożywki do namnażania wirusa.

Na przykład 30 ml pożywki do kolby T 1 75. Odliczanie można rozpocząć, przyjmując ten moment jako punkt czasowy zero w wybranym czasie po infekcji. Należy sprawdzić komórki pod mikroskopem i odnotować wszelkie efekty cytopatyczne lub CPE.

Usunąć pożywkę i przepłukać komórki 30 mililitrami PBS w temperaturze pokojowej. Następnie dodać do komórek 15 mililitrów trypsyny i inkubować od dwóch do pięciu minut. W temperaturze 37 °C sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki się oddzieliły, a następnie delikatnie opukiwać kolbę, aby doprowadzić do ich odczepienia.

Przenieś komórki za pomocą sterylnej pipety serologicznej do stożkowatej probówki o pojemności 50 ml. Przepłucz kolbę taką samą objętością pożywki do wzrostu komórek i dodaj pożywkę do komórek potraktowanych trypsyną w probówce stożkowej. Wirować komórki przy 500 Gs przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po wirowaniu usunąć medium hodowlane z osadu komórkowego, a następnie resuspender osad komórkowy w odczynniku TRIzol lub buforze lizującym z wybranego zestawu do izolacji RNA. W przypadku użycia TRIzolu podzielić próbkę na alykwoaty o objętości 1 mL w oznakowanych probówkach typu Eppendorf 1,5 mL i zamrozić w temperaturze -80 °C. Powtórzyć czynność dla wszystkich punktów czasowych.

Pozyskiwanie jednej kolby dla każdego punktu czasowego. Na tym etapie próbka powinna zostać resuspendowana w odczynniku triolowym i być gotowa do przetworzenia. Dodaj 200 µL odczynnika do separacji faz BCP.

Dla każdego jednego mililitra triolu w każdej probówce, zamiast fenolu stosuje się BCP, czyli jeden bromo trzy chloropropan. Aby zmniejszyć zanieczyszczenie kDNA, może być konieczne przeniesienie próbki do większej probówki. Jeśli rozpoczynasz pracę z dużą ilością triolu, wymieszaj próbkę w wstrząsacu typu vortex lub energicznie wstrząśnij i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech minut; po inkubacji odwiruj próbkę przy 12 000 ×g przez 15 minut.

Faza wodna powinna być widoczna jako przejrzysta warstwa na górze. Przenieś fazę wodną do nowej probówki. Powinno się odzyskać około 600 µL na każdy 1 mL triazolu użytego na początku.

Przeprowadź drugą ekstrakcję fenol-chloroformową. Tym razem użyj 500 µL chloroformu na każdy 1 mL triazolu zamiast BCP. Druga ekstrakcja chloroformowa służy do usunięcia wszelkich śladów rozpuszczalnika organicznego z ekstrakcji, ponieważ nawet śladowe ilości mogą hamować kolejne etapy amplifikacji.

Wymieszaj na wortexie lub energicznie wstrząśnij, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech minut. Odwiruj próbkę przy 12 000 GS przez 15 minut. Po wirowaniu przenieś fazę wodną do nowej probówki.

Należy pamiętać, że faza wodna to przezroczysta warstwa na górze. Następnie do każdej próbki należy dodać 20 µg liniowego akryloamidu. Liniowy akryloamid pełni rolę nośnika i pomaga w wytrącaniu RNA.

Do każdej próbki dodać 500 µL izopropanolu na każdy 1 mL triolu użytego na początku i wymieszać. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie wirować w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 10 do 15 minut. Po wirowaniu na dnie probówki widoczny będzie osad RNA.

Bardzo ostrożnie usuń supernatant z probówki, używając aspiratora próżniowego lub pipety. Nie naruszaj osadu. Przemyj osad jednym mililitrem 70% etanolu i odwiruj z maksymalną prędkością przez pięć do siedmiu minut.

Bardzo ostrożnie usuń etanol z probówki za pomocą aspiratora próżniowego lub ręcznie pipetą. Odrzuć nadsącz.

Upewnij się, że na dnie probówki widoczny jest osad. Powtórz ten etap płukania po odlaniu supernatantu. Zaznacz na probówce miejsce, w którym znajduje się osad.

Suszyć osad na powietrzu nie dłużej niż przez pięć minut. Nie dopuścić do nadmiernego wysuszenia, ponieważ utrudni to rekonstytucję RNA. Następnie, jeżeli planowana jest obróbka DNA, zawiesić osad w 17 µL wody wolnej od nukleaz.

Jeśli nie planowane jest traktowanie DNazą, resztę zawiesić w 20 µL. W przypadku traktowania DNazą, należy użyć zestawu KaiGen RNA free DNA. Dodać 2 µL buforu RDD oraz 1 µL zrekonstytuowanego RNA free.

Do zawiesiny dodano DNA, zmieszano z RNA i delikatnie inkubowano w 37°C przez 30 minut. Następnie dodano 2 µL 2,5 mM EDTA i inkubowano w 65°C przez pięć minut. Aby inaktywować DNA, nie należy przekraczać czasu ani temperatury inaktywacji, ponieważ dłuższy czas i wyższa temperatura mogą spowodować degradację RNA.

Obróbka DNA została zakończona. Sprawdź stężenie RNA za pomocą spektrofotometru. Ślady fenolu lub BCP mogą być wykrywalne jako pik przy 270 nanometrach, poza standardowym pikiem przy 260 nanometrach.

Podczas pomiaru absorbancji całkowitego RNA po ekstrakcji, w przypadku wystąpienia takiego zanieczyszczenia, należy oczyścić RNA, stosując metodę ekstrakcji RNA opartą na filtrze lub kolumnie przed przystąpieniem do amplifikacji. Próbkę RNA można przechowywać w temperaturze -80 °C. W razie potrzeby można sprawdzić jakość RNA, korzystając z bioanalizatora Agilent lub poprzez rozdzielenie próbki w żelu denaturującym i sprawdzenie odczytów OD w bioanalizatorze.

O dobrej jakości RNA świadczy wskaźnik integralności RNA, czyli RIN. RIN opiera się na systemie numeracji od 1 do 10, gdzie 1 oznacza profil najbardziej zdegradowany, a 10 profil najbardziej nienaruszony. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić infekcję wirusem vaccinia w układzie czasowym oraz jak wyizolować RNA z zainfekowanych komórek w różnych punktach czasowych po infekcji.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że przygotowanie synchronicznej infekcji wirusem vaccinia obejmuje kilka krytycznych etapów. Pierwszym z nich jest staranna sonikacja lub trypsynizacja wirusa. Ważne jest rozbicie agregatów cząsteczek wirusa, ponieważ wirus vaccinia wykazuje silną tendencję do agregacji, co mogłoby uniemożliwić równomierną infekcję komórek.

Po drugie, aby uzyskać infekcję asynchroniczną, należy zastosować wysoką wielokrotność infekcji (MOI) przekraczającą dwa, aby zapewnić zainfekowanie każdej komórki. Mieszanina komórek zainfekowanych i niezainfekowanych doprowadzi do wielu rund infekcji, powstania heterogenicznych mieszanin punktów czasowych oraz asynchronicznych odpowiedzi transkrypcyjnych wirusa i gospodarza. Po trzecie, infekcję należy przeprowadzić w minimalnej ilości pożywki, aby umożliwić maksymalną adsorpcję wirusa na komórkach.

Ponadto regularne potrząsanie kolbą lub szalkami hodowlanymi co 10 minut umożliwia rozprowadzenie wirusa w kolbie i zapobiega wysychaniu komórek. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.

Koniecznie obejrzyj pozostałe filmy z tej serii, w których prezentujemy procedurę liniowej amplifikacji próbek RNA oraz przygotowanie i oczyszczanie znakowanego fluorescencyjnie RNA.