Name: Zakażenie wirusem krowianki i czasowa analiza ekspresji genów wirusa: część 1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min
Description: Poznaj metodę zakażenia komórek HeLa wirusem krowianki i ekstrakcji RNA w różnych punktach czasowych. Ta technika umożliwia analizę ekspresji genów wirusa i gospodarza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fundusze dla stypendystów Whitehead Institute

Część 1: Przygotowanie zakażenia
<ol>
<li>Hodować komórki HeLa w kolbach i czekać, aż osiągną konfluencję na poziomie około 80%.</li>
<li>Przygotować odpowiednią ilość pożywki do wzrostu wirusa na potrzeby eksperymentu: standardowe DMEM z 2% FBS bez dodatku antybiotyków.</li>
<li>Infekcję można przeprowadzić, używając albo surowego stoku wirusa vaccinia o znanym mianie, albo wirusa oczyszczonego sacharozą o znanym mianie, jeśli istotna jest kwestia ekspresji genów gospodarza.</li>
<li>W przypadku użycia wirusa oczyszczonego sacharozą należy przejść bezpośrednio do części 2.</li>
<li>W przypadku użycia surowego stoku wirusa vaccinia, bezpośrednio przed infekcją, poddać alikwot wirusa działaniu sonikatora kubkowego w kąpieli składającej się głównie z lodu i niewielkiej ilości wody.
<ul style="list-style-type:lower-alpha;">
<li>Sonikować przy mocy około 30W przez 20 sekund.</li>
<li>Wymieszać zawartość probówki w wirówce typu vortex i powtórzyć sonikację 3 razy, dodając w razie potrzeby więcej lodu, aby utrzymać kubek wypełniony lodem i schłodzony.</li>
<li>Mieszać w vortexie pomiędzy każdym etapem sonikacji.</li>
<li>Przejść do części 2.</li>
</ul>
</li>
<li>Alternatywnie, w przypadku braku sonikatora kubkowego, zmieszać równą objętość surowego stoku wirusa i trypsyny w stężeniu 0.25mg/mL.
<ul style="list-style-type:lower-alpha;">
<li>Wymieszać energicznie w vortexie.</li>
<li>Inkubować mieszaninę stoku wirusa i trypsyny w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C przez 30 minut.</li>
<li>Mieszać w vortexie w odstępach 5-10 minut.</li>
<li>Przejść do części 2.</li>
</ul>
</li>
</ol>
Część 2: Infekowanie komórek
<ol>
<li>Oblicz ilość cząsteczek wirusa potrzebną do zainfekowania monowarstwy przy pożądanej wielokrotności infekcji (MOI). Zazwyczaj do przebiegu czasowego infekcji stosuje się wysoką wartość MOI (między 5 a 10).</li>
<li>Dodaj pożądaną ilość wirusa oczyszczonego sacharozą lub surowego wirusa poddanego trypsynizacji do pożywki do wzrostu wirusa o temperaturze 37°C i dobrze wymieszaj. Należy użyć takiej ilości pożywki, aby zaledwie pokryła dno kolby. Na przykład 10 mL pożywki dla kolby T-175.</li>
<li>Usuń pożywkę z komórek i wypłucz je PBS w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Dodaj wirusa w pożywce do wzrostu wirusa do każdej kolby.
<ul style="list-style-type:lower-alpha;">
<li>Delikatnie zamieszaj, przechyl płytki i inkubuj w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2 przez 1 godzinę.</li>
<li>Przechylaj i zamieszaj płytki co 15 minut, aby równomiernie rozprowadzić wirusa i utrzymać komórki w stanie wilgotnym.</li>
<li>Dla punktu czasowego 0 h/kontrolnego (Mock), dodaj samą pożywkę do wzrostu wirusa, bez dodatku wirusa.</li>
</ul>
</li>
<li>Po 1-godzinnej inkubacji usuń pożywkę zawierającą wirusa i wypłucz trzy razy PBS w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Dodaj maksymalną ilość pożywki do wzrostu wirusa do każdej kolby. Na przykład 30 mL pożywki dla kolby T-175. Przyjmij ten moment jako punkt czasowy 0 h.</li>
</ol>
Część 3: Pozyskiwanie komórek
<ol>
<li>Obejrzeć komórki pod mikroskopem i odnotować wszelki efekt cytopatyczny (CPE).</li>
<li>Usunąć medium i wypłukać komórki 30 mL PBS o temperaturze pokojowej.</li>
<li>Dodać do komórek 15 mL trypsyny i inkubować przez 2-5 min w temperaturze 37°C.</li>
<li>Sprawdzić pod mikroskopem odłączenie się komórek i delikatnie opukać kolbę, aby oderwać komórki.</li>
<li>Przenieść komórki za pomocą sterylnej pipety serologicznej do probówki stożkowej o pojemności 50 mL.</li>
<li>Przepłukać kolbę równą objętością medium wzrostowego, a następnie dodać to medium do trypsynizowanych komórek w probówce stożkowej.</li>
<li>Odwirować komórki przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Usunąć trypsynę/medium znad osadu komórkowego.</li>
<li>Resuspender osad komórkowy w odczynniku TRIzol lub buforze lizującym z wybranego zestawu do izolacji RNA.</li>
<li>W przypadku użycia TRIzolu, podzielić próbkę na alikwoty po 1 mL w opisanych probówkach Eppendorf 1,5 mL i zamrozić w temperaturze -80°C.</li>
<li>Powtórzyć procedurę dla wszystkich punktów czasowych, zbierając jedną kolbę dla każdego punktu czasowego.</li>
</ol>
Część 4: Ekstrakcja RNA z próbek w TRIzol
<ol>
<li>Na tym etapie próbki powinny być resuspenderowane w odczynniku TRIzol i gotowe do dalszej obróbki.</li>
<li>Do każdej probówki dodaj 200µL odczynnika do separacji faz BCP na każdy 1 mL TRIzol. W przypadku rozpoczęcia pracy z dużą ilością TRIzol może być konieczne przeniesienie próbki do większej probówki.</li>
<li>Wymieszaj intensywnie za pomocą wortexa lub wstrząsając i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2-3 minuty.</li>
<li>Odwirowuj próbkę przy 12,000 x g przez 15 minut.</li>
<li>Przenieś fazę wodną do nowej probówki. Faza wodna to przejrzysta warstwa na górze. Powinieneś odzyskać około 600µL na każdy 1mL TRIzol użyty na początku.</li>
<li>Przeprowadź drugą ekstrakcję fenol-chloroformową, tym razem stosując 500µL chloroformu na 1 ml TRIzol zamiast BCP.</li>
<li>Wymieszaj intensywnie za pomocą wortexa lub wstrząsając i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 2-3 minuty.</li>
<li>Odwirowuj próbkę przy 12,000 x g przez 15 minut.</li>
<li>Przenieś fazę wodną do nowej probówki. Faza wodna to przejrzysta warstwa na górze.</li>
<li>Do każdej próbki dodaj 20µg liniowej akrylamidu. Liniowy akrylamid działa jako nośnik i pomaga w wytrącaniu RNA.</li>
<li>Do każdej próbki dodaj 500µL izopropanolu na każdy 1 ml TRIzol użyty na początku i dokładnie wymieszaj.</li>
<li>Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
<li>Odwirowuj w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 10-15 minut.</li>
<li>Osad RNA będzie widoczny na dnie probówki. Bardzo ostrożnie usuń nadsącz z probówki, używając aspiratora próżniowego lub pipety. Nie naruszaj osadu.</li>
<li>Przemyj osad 1 mL 70% etanolu.
<ul style="list-style-type:lower-alpha;">
<li>Dodaj 1 mL 70% etanolu do osadu.</li>
<li>Odwirowuj z maksymalną prędkością 14,000g przez 5-7 minut.</li>
<li>Bardzo ostrożnie usuń etanol z probówki za pomocą aspiratora próżniowego lub pipety. Upewnij się, że osad jest widoczny na dnie probówki.</li>
<li>Odrzuć nadsącz.</li>
</ul>
</li>
<li>Powtórz etap przemywania. Po usunięciu nadsączu zaznacz na probówce miejsce, w którym znajduje się osad.</li>
<li>Susz osad na powietrzu nie dłużej niż przez 5 minut. Nie wysusz go zbyt mocno, w przeciwnym razie RNA będzie trudne do resuspensji!</li>
<li>Jeśli chcesz przeprowadzić opcjonalne traktowanie DNazą w celu usunięcia pozostałego DNA z próbki, resuspenderuj osad w 17µL wody wolnej od nukleaz. W przeciwnym razie resuspenderuj osad w 20µL wody wolnej od nukleaz i przejdź do kroku 22.</li>
<li>(Opcjonalne traktowanie DNazą) Korzystając z zestawu DNazy wolnej od RNazy firmy Qiagen, dodaj 2µL buforu RDD i 1µL zrekonstytuowanej DNazy I wolnej od RNazy do resuspenderowanego RNA. Wymieszaj delikatnie.</li>
<li>(Opcjonalne traktowanie DNazą) Inkubuj w temperaturze 37°C przez 30 minut.</li>
<li>(Opcjonalne traktowanie DNazą) Dodaj 2µL 2,5 mM EDTA i inkubuj w temperaturze 65°C przez 5 minut, aby inaktywować DNazę. Nie przekraczaj czasu ani temperatury inaktywacji, ponieważ dłuższy czas lub wyższa temperatura mogą spowodować degradację RNA.</li>
<li>Sprawdź stężenie RNA za pomocą spektrofotometru.</li>
<li>Przechowuj próbkę RNA w temperaturze -80°C.</li>
<li>(Opcjonalna kontrola jakości) Sprawdź jakość RNA za pomocą Agilent BioAnalyzer lub poprzez rozdzielenie próbki na żelu denaturującym i sprawdzenie odczytów O.D. (260nm oraz stosunku 260/280).</li>
</ol>

<ol><li>KH, R. ubins, LE, H. ensley, GW, B. ell, Wang, C., EJ, L. efkowitz, PO, B. rown, DA, R. elman <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection%3A+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li>
<li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li>
<li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundström, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss%3A+Poxvirus+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Muñoz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li>
<li>Guerra, S., López-Fernández, L. A., Pascual-Montano, A., Nájera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC%3A+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li>
<li>Guerra, S., Nájera, J. L., González, J. M., López-Fernández, L. A., Climent, N., JM, G. atell, Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li>
</ol>

Kluczowe etapy
Część 1 i 2
Istnieje kilka krytycznych etapów przygotowania synchronicznej infekcji wirusem vaccinia, z których pierwszym jest staranna sonikacja (lub trypsynizacja) wirusa w celu rozbicia agregatów cząstek wirusowych. Wirus vaccinia ma silną tendencję do agregacji, a rozproszenie cząstek wirusowych jest istotne dla zapewnienia równomiernej infekcji komórek. Aby uzyskać synchroniczną infekcję, należy zastosować wysoką wielokrotność infekcji (MOI powyżej ...

<table><tbody><tr><td>Odczynnik TRIzol</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Można również zastosować podobne odczynniki, takie jak TriPure firmy Roche.</td></tr><tr><td>Odczynnik do separacji faz BCP</td><td>Odczynnik</td><td>Molecular Research Center</td><td>BP151</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw DNazy wolnej od RNaz</td><td>Odczynnik</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>Obróbka DNazą jest krokiem opcjonalnym.</td></tr></tbody></table>

infekcja wirusem vaccinia oraz analiza czasowa ekspresji genów wirusa: część 1

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

RodzinaPoxviridaeskłada się z dużych dwuniciowych cząsteczek DNA zawierających wirusy, które replikują się wyłącznie w cytoplazmie zainfekowanych komórek. Przedstawiciele tejorthopoxrodzaj obejmuje variola, czynnik etiologiczny ospy prawdziwej u ludzi, monkeypox oraz vaccinia (VAC), prototypowego przedstawiciela rodziny wirusów. W obrębie stosunkowo dużego (~ 200 kb) genomu vaccinia kodowane są trzy klasy genów: wczesne, pośrednie i późne. Choć wszystkie trzy klasy są transkrybowane przez kodowane wirusowo polimerazy RNA, każda z nich pełni inną funkcję w cyklu życiowym wirusa. Poxwirusy stosują wiele strategii modulacji środowiska komórkowego gospodarza podczas infekcji. Aby zrozumieć regulację ekspresji genów zarówno gospodarza, jak i wirusa, zastosowaliśmy podejścia całogenomowe do analizy obfitości transkryptów z komórek wirusa i gospodarza. W niniejszym materiale demonstramosmy przebieg infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz pobieranie RNA w kilku punktach czasowych po infekcji. Całkowite RNA gospodarza i wirusa jest izolowane i amplifikowane w celu hybrydyzacji z macierzami mikroarray do analizy ekspresji genów.

Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 1 z 3.

Infekcja wirusem vaccinia oraz analiza czasowa ekspresji genów wirusa: Część 1

Rodzina Poxviridae składa się z dużych wirusów zawierających dwuniciowy DNA, które replikują się wyłącznie w cytoplazmie zainfekowanych komórek. Członkowie ...

Badanie przebiegu czasowego infekcji komórek HeLa wirusem vaccinia rozpoczyna się od przygotowania infekcji wirusowej, zainfekowania komórek, a następnie wyizolowania RNA z zainfekowanych komórek w kilku punktach czasowych po infekcji. RNA to może zostać później amplifikowane w celu hybrydyzacji z mikromacierzami do analizy ekspresji genów. Witam, nazywam się Judy Ann z laboratorium Kate Irvins w Whitehead Institute for Biomedical Research.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę zakażenia wirusem vaccinia w komórkach ssaczych w określonych odstępach czasu oraz następującą po nim ekstrakcję RNA z zakażonych komórek w różnych punktach czasowych po zakażeniu. Technika ta jest wstępnym etapem szerszego protokołu mającego na celu ekstrakcję i amplifikację RNA w celu oceny ekspresji genów wirusa podczas infekcji, co zostanie omówione w dwóch kolejnych filmach JoVE. Przejdźmy zatem do realizacji. Aby przygotować się do zakażenia, należy wyhodować komórki HeLa w kolbach i poczekać, aż komórki osiągną około 80% konfluencji.Następnie należy przygotować wystarczającą ilość pożywki do wzrostu wirusów na potrzeby eksperymentu. Wykorzystując standardowe DMEM z 2% FBS i bez dodatku antybiotyków, infekcję można przeprowadzić z użyciem albo dostępnego zapasu wirusa ospy prawdziwej o znanym mianie, albo wirusa oczyszczonego sacharozą o znanym mianie. Jeśli istnieje obawa o ekspresję genów gospodarza i używany jest wirus oczyszczony sacharozą, należy przejść do następnej sekcji.Jeśli używasz surowego wirusa vaccinia, poddaj sonikacji zapas i podziel wirusa na alikwoty bezpośrednio przed infekcją; w przypadku sonikacji w kubku, użyj kąpieli składającej się głównie z lodu i niewielkiej ilości wody, ustawiając moc około 30 W na 20 sekund. Wymieszaj zawartość probówki w wiertaku (vortex) i powtórz sonikację trzy razy, dodając w razie potrzeby więcej lodu, aby kubek pozostał wypełniony lodem i schłodzony; pamiętaj o mieszaniu w vortexie pomiędzy każdym etapem sonikacji. Jeśli nie posiadasz sonikatora kubkowego, zmieszaj równą objętość surowego zapasu wirusa w stężeniu 0,25 mg/mL.Wigorозnie wymieszaj stok wirusa z trypsyną za pomocą wortexa, a następnie inkubuj w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C przez 30 minut. W odstępach od 5 do 10 minut mieszaj próbkę wortexem w celu przygotowania do zakażenia komórek. Najpierw oblicz liczbę cząsteczek wirusa niezbędną do zakażenia monowarstwy przy pożądanej wielokrotności zakażenia (MOI).Lub MOI. Zazwyczaj do przebiegów czasowych infekcji stosuje się wysoką MOI w zakresie od 5 do 10. Następnie należy dodać odpowiednią ilość wirusa oczyszczonego sacharozą lub surowego wirusa z hodowli trypsynowej do podłoża do wzrostu wirusów w temperaturze 37 °C i dobrze wymieszać.Należy użyć takiej ilości pożywki, aby zaledwie pokryła dno kolby. Dla kolby T 1 75 wystarczające będzie 10 milliliters pożywki. Usunąć pożywkę z komórek i wypłukać PBS w temperaturze pokojowej.Do każdej kolby dodaj wirusa lub pożywkę do hodowli wirusów w celu przygotowania prób kontrolnych dla punktu czasowego zero. W próbkach kontrolnych dodaj wyłącznie pożywkę do hodowli wirusów, bez dodawania samego wirusa. Delikatnie zamieszaj i przechylaj płytki, a następnie inkubuj w temperaturze 37°C w inkubatorze z 5% CO2 przez jedną godzinę. Pamiętaj, aby przechylać i mieszać płytki co 15 minut, aby równomiernie rozprowadzić wirusa i zapobiec wysychaniu komórek.Po inkubacji usunąć pożywkę zawierającą wirusa i wypłukać trzy razy roztworem PBS o temperaturze pokojowej. Do każdej kolby dodać maksymalną ilość pożywki do namnażania wirusa.Na przykład 30 ml pożywki do kolby T 1 75. Odliczanie można rozpocząć, przyjmując ten moment jako punkt czasowy zero w wybranym czasie po infekcji. Należy sprawdzić komórki pod mikroskopem i odnotować wszelkie efekty cytopatyczne lub CPE.Usunąć pożywkę i przepłukać komórki 30 mililitrami PBS w temperaturze pokojowej. Następnie dodać do komórek 15 mililitrów trypsyny i inkubować od dwóch do pięciu minut. W temperaturze 37 °C sprawdzić pod mikroskopem, czy komórki się oddzieliły, a następnie delikatnie opukiwać kolbę, aby doprowadzić do ich odczepienia.Przenieś komórki za pomocą sterylnej pipety serologicznej do stożkowatej probówki o pojemności 50 ml. Przepłucz kolbę taką samą objętością pożywki do wzrostu komórek i dodaj pożywkę do komórek potraktowanych trypsyną w probówce stożkowej. Wirować komórki przy 500 Gs przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po wirowaniu usunąć medium hodowlane z osadu komórkowego, a następnie resuspender osad komórkowy w odczynniku TRIzol lub buforze lizującym z wybranego zestawu do izolacji RNA. W przypadku użycia TRIzolu podzielić próbkę na alykwoaty o objętości 1 mL w oznakowanych probówkach typu Eppendorf 1,5 mL i zamrozić w temperaturze -80 °C. Powtórzyć czynność dla wszystkich punktów czasowych.Pozyskiwanie jednej kolby dla każdego punktu czasowego. Na tym etapie próbka powinna zostać resuspendowana w odczynniku triolowym i być gotowa do przetworzenia. Dodaj 200 µL odczynnika do separacji faz BCP.Dla każdego jednego mililitra triolu w każdej probówce, zamiast fenolu stosuje się BCP, czyli jeden bromo trzy chloropropan. Aby zmniejszyć zanieczyszczenie kDNA, może być konieczne przeniesienie próbki do większej probówki. Jeśli rozpoczynasz pracę z dużą ilością triolu, wymieszaj próbkę w wstrząsacu typu vortex lub energicznie wstrząśnij i inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech minut; po inkubacji odwiruj próbkę przy 12 000 ×g przez 15 minut.Faza wodna powinna być widoczna jako przejrzysta warstwa na górze. Przenieś fazę wodną do nowej probówki. Powinno się odzyskać około 600 µL na każdy 1 mL triazolu użytego na początku.Przeprowadź drugą ekstrakcję fenol-chloroformową. Tym razem użyj 500 µL chloroformu na każdy 1 mL triazolu zamiast BCP. Druga ekstrakcja chloroformowa służy do usunięcia wszelkich śladów rozpuszczalnika organicznego z ekstrakcji, ponieważ nawet śladowe ilości mogą hamować kolejne etapy amplifikacji.Wymieszaj na wortexie lub energicznie wstrząśnij, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez dwie do trzech minut. Odwiruj próbkę przy 12 000 GS przez 15 minut. Po wirowaniu przenieś fazę wodną do nowej probówki.Należy pamiętać, że faza wodna to przezroczysta warstwa na górze. Następnie do każdej próbki należy dodać 20 µg liniowego akryloamidu. Liniowy akryloamid pełni rolę nośnika i pomaga w wytrącaniu RNA.Do każdej próbki dodać 500 µL izopropanolu na każdy 1 mL triolu użytego na początku i wymieszać. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut, a następnie wirować w mikrowirówce z maksymalną prędkością przez 10 do 15 minut. Po wirowaniu na dnie probówki widoczny będzie osad RNA.Bardzo ostrożnie usuń supernatant z probówki, używając aspiratora próżniowego lub pipety. Nie naruszaj osadu. Przemyj osad jednym mililitrem 70% etanolu i odwiruj z maksymalną prędkością przez pięć do siedmiu minut.Bardzo ostrożnie usuń etanol z probówki za pomocą aspiratora próżniowego lub ręcznie pipetą. Odrzuć nadsącz.Upewnij się, że na dnie probówki widoczny jest osad. Powtórz ten etap płukania po odlaniu supernatantu. Zaznacz na probówce miejsce, w którym znajduje się osad.Suszyć osad na powietrzu nie dłużej niż przez pięć minut. Nie dopuścić do nadmiernego wysuszenia, ponieważ utrudni to rekonstytucję RNA. Następnie, jeżeli planowana jest obróbka DNA, zawiesić osad w 17 µL wody wolnej od nukleaz.Jeśli nie planowane jest traktowanie DNazą, resztę zawiesić w 20 µL. W przypadku traktowania DNazą, należy użyć zestawu KaiGen RNA free DNA. Dodać 2 µL buforu RDD oraz 1 µL zrekonstytuowanego RNA free.Do zawiesiny dodano DNA, zmieszano z RNA i delikatnie inkubowano w 37°C przez 30 minut. Następnie dodano 2 µL 2,5 mM EDTA i inkubowano w 65°C przez pięć minut. Aby inaktywować DNA, nie należy przekraczać czasu ani temperatury inaktywacji, ponieważ dłuższy czas i wyższa temperatura mogą spowodować degradację RNA.Obróbka DNA została zakończona. Sprawdź stężenie RNA za pomocą spektrofotometru. Ślady fenolu lub BCP mogą być wykrywalne jako pik przy 270 nanometrach, poza standardowym pikiem przy 260 nanometrach.Podczas pomiaru absorbancji całkowitego RNA po ekstrakcji, w przypadku wystąpienia takiego zanieczyszczenia, należy oczyścić RNA, stosując metodę ekstrakcji RNA opartą na filtrze lub kolumnie przed przystąpieniem do amplifikacji. Próbkę RNA można przechowywać w temperaturze -80 °C. W razie potrzeby można sprawdzić jakość RNA, korzystając z bioanalizatora Agilent lub poprzez rozdzielenie próbki w żelu denaturującym i sprawdzenie odczytów OD w bioanalizatorze.O dobrej jakości RNA świadczy wskaźnik integralności RNA, czyli RIN. RIN opiera się na systemie numeracji od 1 do 10, gdzie 1 oznacza profil najbardziej zdegradowany, a 10 profil najbardziej nienaruszony. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić infekcję wirusem vaccinia w układzie czasowym oraz jak wyizolować RNA z zainfekowanych komórek w różnych punktach czasowych po infekcji.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że przygotowanie synchronicznej infekcji wirusem vaccinia obejmuje kilka krytycznych etapów. Pierwszym z nich jest staranna sonikacja lub trypsynizacja wirusa. Ważne jest rozbicie agregatów cząsteczek wirusa, ponieważ wirus vaccinia wykazuje silną tendencję do agregacji, co mogłoby uniemożliwić równomierną infekcję komórek.Po drugie, aby uzyskać infekcję asynchroniczną, należy zastosować wysoką wielokrotność infekcji (MOI) przekraczającą dwa, aby zapewnić zainfekowanie każdej komórki. Mieszanina komórek zainfekowanych i niezainfekowanych doprowadzi do wielu rund infekcji, powstania heterogenicznych mieszanin punktów czasowych oraz asynchronicznych odpowiedzi transkrypcyjnych wirusa i gospodarza. Po trzecie, infekcję należy przeprowadzić w minimalnej ilości pożywki, aby umożliwić maksymalną adsorpcję wirusa na komórkach.Ponadto regularne potrząsanie kolbą lub szalkami hodowlanymi co 10 minut umożliwia rozprowadzenie wirusa w kolbie i zapobiega wysychaniu komórek. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.Koniecznie obejrzyj pozostałe filmy z tej serii, w których prezentujemy procedurę liniowej amplifikacji próbek RNA oraz przygotowanie i oczyszczanie znakowanego fluorescencyjnie RNA.

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zakażenie wirusem ospy prawdziwej i czasowa analiza ekspresji genów wirusa: Część 1

Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 2 z 3.

Infekcja wirusem vaccinia i analiza czasowa ekspresji genów wirusa: część 2

Protokół infekcji komórek HeLa wirusem Vaccinia oraz analizy ekspresji genów gospodarza i wirusa. Część 3 opisuje proces znakowania fluorescencyjnego namnożonego RNA z próbek gospodarza i wirusa poprzez sprzęganie barwników za pomocą grup aminoallilowych. Część 3 z 3.

Infekcja wirusem vaccinia i analiza czasowa ekspresji genów wirusowych: Część 3

Nowe czynniki gospodarza zaangażowane w infekcje wirusowe można zidentyfikować za pomocą komórkowego przesiewu RNAi w celu utraty funkcji w skali całego genomu. Model hodowli komórkowej Drosophila jest szczególnie podatny na to podejście ze względu na łatwość i wydajność RNAi. W niniejszym materiale prezentujemy tę technikę, posługując się wirusem vaccinia jako przykładem.

Przesiew RNAi w poszukiwaniu czynników gospodarza zaangażowanych w infekcję wirusem Vaccinia z wykorzystaniem komórek Drosophila

Wirusy onkolityczne stanowią obiecującą metodę terapeutyczną w leczeniu nowotworów. Zdolność do oceny podatności na zakażenie żywych próbek tkanek pobranych od pacjentów przed rozpoczęciem leczenia jest unikalną zaletą tego podejścia terapeutycznego. Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania tkanek do zakażenia ex vivo wirusem onkolitycznym oraz późniejszą kwantyfikację wirusa.

Ex Vivo zakażanie żywej tkanki wirusami onkolitycznymi

Opisujemy protokół służący do identyfikacji kluczowych ról cząsteczek sygnałowych gospodarza w litycznej replikacji modelowego herpeswirusa, gamma herpeswirusa 68 (γHV68). Wykorzystując genetycznie zmodyfikowane szczepy myszy oraz fibroblasty zarodkowe do litycznej replikacji γHV68, protokół ten umożliwia zarówno charakterystykę fenotypową, jak i analizę molekularną oddziaływań wirus-gospodarz podczas litycznej replikacji wirusa.

Analiza oddziaływań gospodarz-wirus podczas litycznej replikacji modelowego herpeswirusa

Opisano metodę śledzenia neuronów połączonych synaptycznie. Wykorzystujemy specyficzność TVA w komórce upstream, aby zbadać, czy interesująca nas populacja komórek otrzymuje sygnały synaptyczne od genetycznie zdefiniowanych typów komórek.

Wirusowe śledzenie genetycznie zdefiniowanych obwodów neuronalnych

Szybki i modułowy protokół generowania rekombinowanych wirusów krowianki wyrażających fluorescencyjnie znakowane białka jednocześnie przy użyciu metody przejściowej selekcji dominującej jest opisany tutaj.

Metodologia wydajnego wytwarzania znakowanych fluorescencyjnie białek wirusa krowianki

Opisujemy użycie fluorescencyjnego wirusa krowianki reporterowej, który umożliwia pomiar zakaźności wirusa i ekspresji genów w czasie rzeczywistym poprzez specyficzną dla etapu ekspresję spektralnie odrębnych fluoroforów reporterowych. Szczegółowo opisujemy metodę opartą na płytkach do dokładnej identyfikacji etapu, na którym replikacja wirusa jest zaburzona w odpowiedzi na hamowanie małych cząsteczek.

Wirusy reporterowe krowianki do ilościowego określania funkcji wirusa na wszystkich etapach ekspresji genów

Wirus krowianki (VV) jest szeroko stosowany w badaniach biomedycznych i poprawie zdrowia ludzkiego. W tym artykule opisano prostą, bardzo wydajną metodę edycji genomu VV przy użyciu systemu CRISPR-Cas9.

Proste i skuteczne podejście do konstruowania zmutowanych wektorów wirusa krowianki

Tutaj prezentujemy protokoły identyfikacji 1) kodowanych przez wirusa immunomodulatorów, które promują replikację arbowirusa i 2) eukariotycznych czynników gospodarza, które ograniczają replikację arbowirusa. Te metody oparte na fluorescencji i luminescencji pozwalają naukowcom szybko uzyskać ilościowe odczyty replikacji arbowirusa w uproszczonych testach o niskim stosunku sygnału do szumu.

Zakażenia arbowirusem jako narzędzia przesiewowe do identyfikacji immunomodulatorów wirusa i czynników przeciwwirusowych gospodarza

ICP0 ulega translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej podczas infekcji HSV-1. Mechanizm molekularny tego zdarzenia nie jest znany. W tym miejscu opisujemy zastosowanie mikroskopu konfokalnego jako narzędzia do ilościowego określania ruchu ICP0 w zakażeniu HSV-1, co stanowi podstawę do ilościowej analizy translokacji ICP0 w przyszłych badaniach mechanistycznych.

Analiza czasowa translokacji jądrowej do cytoplazmatycznej białka wirusa opryszczki pospolitej 1 za pomocą immunofluorescencyjnej mikroskopii konfokalnej

Poznaj metodę zakażenia komórek HeLa wirusem krowianki i ekstrakcji RNA w różnych punktach czasowych. Ta technika umożliwia analizę ekspresji genów wirusa i gospodarza.

Infekcja wirusem vaccinia oraz analiza czasowa ekspresji genów wirusa: Część 1

Przeglądaj więcej filmów