Name: Pomiar egzocytozy w Neurony Korzystanie FM etykietowania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 56 s
Description: Poznaj pomiar egzocytozy w neuronach hipokampu z wykorzystaniem barwnika FM 4-64 i obrazowania w czasie rzeczywistym. Ta metoda pozwala badać kinetykę uwalniania pęcherzyków presynaptycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Komórki: Rat (lub myszy) pierwotne neuronów hipokampa kultur (14-28 dni in vitro). Stymulacja: elektryczne, dostarczane za pomocą dwóch elektrod platynowych, 70-90 mV Mikroskopia: 60x obiektyw olej na odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym CCD. Oprogramowanie: Slidebook (Intelligent Imaging Innovations, Santa Monica, Kalifornia) Zobacz dodatkowe strony metod dalsze szczegóły <ol><li> Warm-HEPES soli buforowanej (HBS) do temperatury pokojowej. Dodaj antagonistów receptorów glutaminianu APV (50 mM stężenie końcowe) i CNQX (10 mM wersja ostateczna). Każdy FM eksperyment wymaga zazwyczaj 20-30 ml HBS. Do pracy stężeniu 10 mM FM 4-64 (Molecular Probes) i rozcieńczyć roztwór 1:1000 w HBS (z antagonistami dodane). Dodać 2 ml FM ciekłym dla każdego doświadczenia. Pokrywa rozwiązanie folią, aby zapobiec ekspozycji na światło. </li><li> Zamontuj szkiełka zawierające neuronów na komory elektrody. Sprawdź, że media w komorze jest na poziomie górnej części komory i całkowicie pokrywa elektrod. Usuń nadmiar roztworu z dna szkiełka. Dodaj olej do obiektywu (jeśli używasz obiektywu z oliwek). </li><li> Ustaw aparat perfuzji. Pierwszy spłukać kilka ml każdego następnego w podanej kolejności (niech każdy przepływ dokładnie przed dodaniem następnego): woda, etanol, woda, następnie HBS. Następnie dodać HBS (zapisać kilka ml, aby dodać ręcznie w przyszłości kroków) i zamknij perfuzji. Ustaw gniazdka perfuzji i ssania po przeciwnych stronach na brzegach szkiełka. Dobrze jest, gdy gniazda perfuzji dochodzi do komory, gdzie jako ssania powinno opierać się na samej górze. Podczas dodawania HBS (przez perfuzji lub ręcznie), otwórz ssanie i dostosowanie ich położenia tak, że utrzymuje mediów na odpowiednim poziomie, tylko w pełni pokrycie elektrod. </li><li> Spójrz na obszar na szkiełko chcesz obraz i spróbuj mniej więcej doprowadzić go w polu ostrości. Optymalnych obszarów zawierają wiele synaps, ale nie powinno być tak gęsta, tak, że poszczególne procesy się nie do odróżnienia. Nie powinno być-to-minimal ciał komórek, błon zewnętrznych (takich jak kępy astrocyty), lub innych materiałów niespecyficzne (np. lint). Barwnik FM może niespecyficznie przestrzeganie tych. </li><li> Użyj &quot;WG&quot; kostka filtr (który podnieca się zielone światło i zbiera czerwone do dalekiej czerwieni emisji). Ustaw SlideView &quot;Ustawienia przechwytywania&quot;, aby dostarczyć 900 AP na 10Hz na początek zdjęcia 0 (zwykle 300 do 900 punktów dostępowych wykorzystywane są do tego bodźca ładowania). W oknie obrazu wybierz &quot;fluo-vis-czerwone&quot; ustawienia filtra i zmiana czasu ekspozycji do 100 ms. Wyłącz wszystkie wcześniejsze ustawienia timelapse. Nie należy stosować żadnych zdjęć, dopóki nie są gotowe do rozpoczęcia stymulacji. </li><li> Upewnij się, że ssanie jest / open. Szybko dodać FM ciekłym (2 ml) do komory na drugi koniec ssania. Natychmiast naciśnij OK w oknie obrazu zrobić zdjęcie i rozpocząć stymulację. Odczekaj 30-45 sekund po stymulacji, a następnie szybko wypłukać FM, dodając ~ 2 ml HBS (mogę to zrobić ręcznie za pomocą pipety, ale może być również dokonane przez perfuzji). </li><li> Umyć FM z HBS przez perfuzji na ~ 10 minut. Szybkość przepływu powinna być 1-1,5 ml / min. Podczas tego etapu umyć, zmienić preferencje stymulacji tak, że początek stymulacji rozpoczyna @ obrazu 10 (zwykle 900 do 1200 punktów przy 10 Hz są wykorzystywane do tego bodźca odbarwiania). Około 7 min do mycia, sprawdź preferencje (początek bodźca zdjęcie 10). Teraz przy małym oknie skupić się wybrać i skupić subregionu. Sprawdź, czy ustawienia stymulacji zostały zmienione przed przejściem do następnego kroku. Weź jeden obraz, czy umyć jest kompletny (poszczególnych synaps powinny być wyraźnie punctated). Jeśli nie, zwiększenie przepływu dodatkowe 0.5mL/min i czekać kolejne 2 minuty. </li><li> Po zakończeniu mycia, ustawić czas ekspozycji należy jeszcze uzyskać dobry, jasny sygnał (zwykle pomiędzy 50-100 ms. Ekspozycji razy powinna być zminimalizowana ze względu na szybki fotochemiczną FM). Następnie ustaw preferencje timelapse wziąć 38 zdjęć co 5 sekund. Sprawdź perfuzji, aby nie wystarczy HBS przez kolejne 5 minut, i pozostawić perfuzji płynące. Początek timelapse rozpocząć odbarwiania. </li><li> Po Odbarwiać, zmienić ustawienia stymulacji dostarczyć 1200 AP @ 10Hz (zwykle 1200 do 2000 punktów są wykorzystywane do tego ostatniego kroku) na zdjęcia 0. Wyłącz ustawienia timelapse i wziąć jeden obraz do rozpoczęcia stymulacji. Perfuzja powinny być nadal płynie Ten krok pomoże usunąć wszelkie pozostałe pęcherzykowej barwnika FM, w celu określenia podstawowych / &quot;całkowite zwolnić&quot; fluorescencji. Po zakończeniu bodźców, wyłączyć ustawienia stymulacji, przybliżyć region w centrum uwagi. Zamknij perfuzji i ssania, A następnie dwóch ostatnich obrazów bazowych. Albo pojedynczych obrazów lub Z-stack zdjęć (0,5 mikrometrów kroków) mogą zostać podjęte. Z-stosy są przydatne w przypadku nastąpiła zmiana w płaszczyźnie ostrości podczas eksperymentu. </li><li> FM eksperyment jest wykonywana. Jeśli od razu robi więcej eksperymentów, soczewki i komory powinny być oczyszczone każdej próby, ale aparat perfuzji nie musi być czyszczone, aż po końcowy eksperymentu. Wypłukać urządzenie całkowicie wodą, a następnie etanolu. </li></ol>

<ol><li>Betz, W. J., Bewick, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+analysis+of+synaptic+vesicle+recycling+at+the+frog+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction.</a> Science. 255, 200-203 (1992).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

W 300 akcji potencjałów (AP) jest wystarczające do wywołania co najmniej jedną rundę recyklingu pęcherzyk, załadunku bodziec do 300 punktów lub więcej, jest często stosowany do oznaczania puli recyklingu pęcherzyków. Choć bardziej intensywne bodźce załadunku, takich jak 900 punktów, może pozwolić nominalnej liczby dodatkowych pęcherzyków być znakowane, to także zwiększa ilość czasu barwnika może zamieścić w zewnątrzkomórkowej błony, co prowadzi do barwienia niespecyficzne. Znalazłem płukaniem być krytyczny dla zapewnienia właściwego odbarwi...

<table><tbody><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5282</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>T-3166</td><td></td></tr><tr><td>sód CNQX</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-239</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar egzocytozy w neurony korzystanie fm etykietowania

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

Zdolność do pomiaru kinetyki uwalniania pęcherzyków może pomóc zapewnić wgląd w niektóre z podstaw nerwowe. Tu używane obrazu w czasie rzeczywistym pęcherzyków oznaczony FM barwnika do monitorowania tempa uwalniania pęcherzyków presynaptycznych. FM4-64 jest czerwony barwnik fluorescencyjny amfifilowych styrylowe, który osadza się w błony pęcherzyków synaptycznych jak endocytozy jest stymulowany. Lipofilowych interakcje powodują barwnika do znacznego zwiększenia fluorescencji, a tym samym emituje jasny sygnał, kiedy wiąże się z pęcherzami i nominalnej jeden, gdy w płynie pozakomórkowym. Po etapie mycia służy do usuwania zewnętrznych barwnik w błonie komórkowej, pozostałe FM jest skoncentrowana w pęcherzyki, a następnie wydalony przy egzocytozy jest wywołane kolejną rundę stymulację elektryczną. Szybkość uwalniania pęcherzyków jest mierzona od spadku w wyniku fluorescencji. Od FM barwnika może być stosowany przejściowo i zewnętrznych, jest to użyteczne narzędzie do ustalania stawek egzocytozy w neuronalnych kultur, zwłaszcza przy porównywaniu kursów pomiędzy transfekowane synaps i sąsiednich Boutons kontroli.

Zdolność do pomiaru kinetyki uwalniania pęcherzyków może pomóc zapewnić wgląd w niektóre z podstaw nerwowe. Tu używane obrazu w czasie rzeczywistym pęcherzyków oznaczone czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym FM 4-64 do pomiaru tempa uwalniania pęcherzyków presynaptycznych neuronów hipokampa w hodowli.

Pomiar egzocytozy w Neurony Korzystanie FM etykietowania

Zdolność do pomiaru kinetyki uwalniania pęcherzyków może pomóc w zrozumieniu niektórych podstaw przekazywania sygnałów nerwowych. W niniejszej pracy wykorzystaliśmy analizę w czasie rzeczywistym...

Nazywam się Jimmy Lynn. Jestem studentem studiów doktoranckich w programie biologii molekularnej i komórkowej na Uniwersytecie Harvarda. Obecnie pracuję w laboratorium Murphy'ego, gdzie zajmujemy się neuronami hipokampa.W tej chwili pokażę Państwu, jak przeprowadzić eksperymenty FM. Teraz zamocujemy szkiełko nakrywkowe z neuronami w tej specjalnie wykonanej komorze. Nasz mikroskop to odwrócony mikroskop z kamerą CCD; należy upewnić się, że spód jest dokładnie osuszony.Teraz podłączymy elektrody. Teraz układ perfuzji jest gotowy. Umieszczę go na jednym końcu komory.Używamy gliny w celu stabilizacji. W każdym eksperymentu prowadzący HBS dodadzą wszystkie te elementy. Fuzja została przygotowana.Można użyć gliny, aby unieruchomić próbkę, prawdopodobnie w ten sposób, gdzie znajdują się ciała komórek, ponieważ ich błony pochłoną dużo barwnika i przeniosą go bezpośrednio do synaps. Można wybrać również obszar sąsiedni, na przykład tutaj, gdzie przygotowałem ten konkretny obszar i będziemy kontynuować. Następnie następuje wstępne fotobielenie podczas rejestracji pierwszych 10 obrazów.A tutaj przedstawiam się – nazywam się Jamil Newton. Jestem doktorantem w programie biologii molekularnej t

measuring-exocytosis-in-neurons-using-fm-labeling

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano technikę obrazowania fluorescencyjnego na żywo, służącą do ilościowego określenia uzupełniania i mobilizacji specyficznych pul pęcherzyków synaptycznych (SV) w centralnych zakończeniach nerwowych. Monitorowane są dwie rundy recyklingu SV w tych samych zakończeniach nerwowych, co zapewnia kontrolę wewnętrzną.

Ilościowa analiza uzupełniania puli pęcherzyków synaptycznych w hodowlanych neuronach ziarnistych móżdżku z wykorzystaniem barwników FM

Transport retrogradny barwnika fluorescencyjnego pozwala na oznakowanie subpopulacji neuronów na podstawie projekcji anatomicznej. Oznakowane aksony mogą być celowane wizualnie in vivo, co umożliwia rejestrację pozakomórkową z zidentyfikowanych aksonów. Technika ta ułatwia rejestrację w przypadkach, gdy neurony nie mogą zostać oznakowane poprzez manipulacje genetyczne lub gdy ich izolacja za pomocą „ślepych” metod in vivo jest utrudniona.

Retrogradne znakowanie fluorescencyjne umożliwia ukierunkowaną zewnątrzkomórkową rejestrację pojedynczych jednostek z zidentyfikowanych neuronów in vivo

W tym filmie włókna nerwowe larw Drosophila są zanurzone w barwniku FM, który wiąże się z lipidami błony komórkowej. Mikroelektroda ssąca i impulsy elektryczne stymulują proces endocytozy, wprowadzając barwnik FM do nowo powstałych pęcherzyków endocytarnych. Ta metoda, która wizualizuje presynaptyczne etapy neuroprzekaźnictwa, jest przydatna do badania funkcji synaptycznych i uwalniania neuroprzekaźników.

Ładowanie i rozładowywanie barwnika FM za pośrednictwem mikroelektrod w komórkach nerwowych larw Drosophila

Opisujemy użycie styrylowych barwników FM do obrazowania recyklingu pęcherzyków synaptycznych w funkcjonalnych zakończeniach nerwowych. Protokół ten może być stosowany nie tylko do wywołanych, ale także spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych. Protokół rozszerza różnorodność zdarzeń synaptycznych, które można skutecznie ocenić.<br...

Badanie recyklingu pęcherzyków synaptycznych za pomocą barwników FM podczas wywołanych, spontanicznych i miniaturowych aktywności synaptycznych

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Tutaj opisujemy nowatorskie przygotowanie do obrazowania żywych lancetowatych końcówek czuciowych końcówek palisadowych, które unerwiają mieszki włosowe skóry uszu myszy podczas barwienia i odbarwiania barwnikami styrylowo-pirydyniowymi.

Monitorowanie optyczne znakowania żywych zakończeń nerwowych w lancetowatych zakończeniach mieszków włosowych skóry ucha myszy ex vivo

Endocytoza pęcherzyków synaptycznych jest wykrywana za pomocą mikroskopii świetlnej pHluoryny połączonej z białkiem pęcherzyków synaptycznych oraz za pomocą mikroskopii elektronowej wychwytu pęcherzyków.

Pomiar endocytozy pęcherzyków synaptycznych w hodowanych neuronach hipokampa

Objętość jest ważnym parametrem dotyczącym fizjologicznych i patologicznych cech komórek. Opisujemy metodę wykluczenia fluorescencyjnego pozwalającą na pomiar objętości neuronów in vitro w pełnym polu z submikrometryczną rozdzielczością osiową wymaganą do analizy neurytów i dynamicznych struktur implikowanych we wzroście neuronów.

Wysokorozdzielcze obrazowanie objętościowe neuronów z wykorzystaniem metody fluorescencji eXclusion oraz dedykowanych urządzeń mikroprzepływowych

Cykl pęcherzyków synaptycznych (SV) jest podstawowym mechanizmem komunikacji międzykomórkowej w synapsach neuronalnych. Wychwyt i uwalnianie barwnika FM są podstawowymi sposobami ilościowego oznaczania endo- i egzocytozy SV. Tutaj porównujemy wszystkie metody stymulacji w celu napędzania cyklu FM1-43 w synapsie modelu połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila (NMJ).

Cykl barwnika FM w synapsie: porównanie wysokiej depolaryzacji potasu, stymulacji elektrycznej i rodopsyny kanałowej

Opisano dwie powiązane metody wizualizacji zdarzeń subkomórkowych wymaganych do transmisji synaptycznej. Protokoły te umożliwiają monitorowanie w czasie rzeczywistym dynamiki napływu presynaptycznego wapnia i fuzji błony pęcherzyków synaptycznych przy użyciu obrazowania żywych komórek neuronów hodowanych in vitro.

Fluorescencyjny pomiar funkcji synaptycznych w czasie rzeczywistym w modelach stwardnienia zanikowego bocznego

Poznaj pomiar egzocytozy w neuronach hipokampu z wykorzystaniem barwnika FM 4-64 i obrazowania w czasie rzeczywistym. Ta metoda pozwala badać kinetykę uwalniania pęcherzyków presynaptycznych.

Pomiar egzocytozy w Neurony Korzystanie FM etykietowania

Przeglądaj więcej filmów