Pomiar egzocytozy w Neurony Korzystanie FM etykietowania
30 listopada 2006
Zdolność do pomiaru kinetyki uwalniania pęcherzyków może pomóc zapewnić wgląd w niektóre z podstaw nerwowe. Tu używane obrazu w czasie rzeczywistym pęcherzyków oznaczone czerwonym barwnikiem fluorescencyjnym FM 4-64 do pomiaru tempa uwalniania pęcherzyków presynaptycznych neuronów hipokampa w hodowli.
Nazywam się Jimmy Lynn. Jestem studentem studiów doktoranckich w programie biologii molekularnej i komórkowej na Uniwersytecie Harvarda. Obecnie pracuję w laboratorium Murphy'ego, gdzie zajmujemy się neuronami hipokampa.
W tej chwili pokażę Państwu, jak przeprowadzić eksperymenty FM. Teraz zamocujemy szkiełko nakrywkowe z neuronami w tej specjalnie wykonanej komorze. Nasz mikroskop to odwrócony mikroskop z kamerą CCD; należy upewnić się, że spód jest dokładnie osuszony.
Teraz podłączymy elektrody. Teraz układ perfuzji jest gotowy. Umieszczę go na jednym końcu komory.
Używamy gliny w celu stabilizacji. W każdym eksperymentu prowadzący HBS dodadzą wszystkie te elementy. Fuzja została przygotowana.
Można użyć gliny, aby unieruchomić próbkę, prawdopodobnie w ten sposób, gdzie znajdują się ciała komórek, ponieważ ich błony pochłoną dużo barwnika i przeniosą go bezpośrednio do synaps. Można wybrać również obszar sąsiedni, na przykład tutaj, gdzie przygotowałem ten konkretny obszar i będziemy kontynuować. Następnie następuje wstępne fotobielenie podczas rejestracji pierwszych 10 obrazów.
A tutaj przedstawiam się – nazywam się Jamil Newton. Jestem doktorantem w programie biologii molekularnej tutaj, na Harvardzie. Obecnie pracuję w laboratorium neuronauki, gdzie moją opieką naukową kieruje Vinky Murphy.
Dzisiaj chciałbym omówić kwestię przeprowadzania eksperymentów z użyciem barwników FM. Jaki jest cel Państwa eksperymentu? Zaletą barwników FM jest to, że są to barwniki fluorescencyjne, które pozwalają nam śledzić kinetykę egzocytozy.
Dlatego najpierw upewniamy się, że barwnik został pobrany do synapsy, podając bodziec ładujący. Następnie, po okresie przemywania, podajemy bodziec uwalniający, w wyniku którego barwnik zostaje uwolniony z pęcherzyków. Czy pracujesz na konkretnym typie neuronów?
W naszym laboratorium stosujemy tę metodę dla neuronów hipokampa i wykorzystujemy ją w neuronach hodowlanych, a nie w lizatach. Jakie problemy mogą wystąpić podczas tego eksperymentu? Jednym z powszechnych problemów w przypadku stosowanej przez nas stymulacji elektrycznej jest...
W przeszłości zdarzały się problemy z uruchomieniem symulacji elektrycznej, niezależnie od ich przyczyny. Wiem, że inne laboratoria stosują również roztwór z wysokim stężeniem potasu. W związku z tym, w przypadku wystąpienia problemów ze stymulacją elektryczną, roztwór z wysokim stężeniem potasu może stanowić dobrą alternatywę.
Ponadto zazwyczaj, niezależnie od przyczyny, podczas etapu płukania wydaje się, że nieswoiste barwienie nie zostaje w wystarczającym stopniu usunięte. Często stwierdzałem, że samo zwiększenie szybkości przepływu, np. z 0,5 ml do 1,5 ml na minutę, a także wydłużenie czasu płukania z 5 do 10 minut, znacząco poprawia wyniki. Jakie są możliwe zastosowania tego eksperymentu?
Co właściwie chcą Państwo zbadać? Można tę metodę wykorzystać do porównania komórek kontrolnych z komórkami poddanymi określonej manipulacji. Przykładowo, w przypadku różnych linii myszy można sprawdzić, czy kinetyka uwalniania różni się między nimi lub czy podanie konkretnego leku rzeczywiście wpływa na cytozę.
Dziękujemy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie koncentruje się na pomiarze kinetyki uwalniania pęcherzyków w celu pogłębienia zrozumienia neurotransmisji. Wykorzystując obrazowanie w czasie rzeczywistym z użyciem barwnika FM 4-64, w pracy badano tempo uwalniania pęcherzyków presynaptycznych w kulturach neuronów hipokampa.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Neurotransmisja
Wprowadzenie
- Neurotransmisja jest kluczowym procesem w komunikacji neuronalnej.
- Uwalnianie pęcherzyków jest niezbędne dla przesyłania sygnałów między neuronami.
- Techniki obrazowania w czasie rzeczywistym mogą dostarczyć informacji na temat dynamiki pęcherzyków.
- FM 4-64 to barwnik fluorescencyjny powszechnie stosowany do znakowania pęcherzyków.
Cel badania
- Pomiar szybkości uwalniania pęcherzyków presynaptycznych.
- Zrozumienie mechanizmów neurotransmisji.
- Wykorzystanie obrazowania w czasie rzeczywistym do obserwacji dynamiki pęcherzyków.
Zastosowane metody
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym pęcherzyków znakowanych barwnikiem FM 4-64.
- Wykorzystanie hodowli neuronów hipokampa do eksperymentów.
- Specjalnie wykonana komora do montowania szkiełek podstawkowych z neuronami.
- Konfiguracja mikroskopu odwróconego do obrazowania.
Główne wyniki
- Skuteczny pomiar szybkości uwalniania pęcherzyków presynaptycznych.
- Wnioski dotyczące kinetyki dynamiki uwalniania pęcherzyków.
- Wykazanie skuteczności FM 4-64 w badaniach obrazowych.
- Wkład w zrozumienie procesów neurotransmisji.
Wnioski
- Obrazowanie w czasie rzeczywistym jest cennym narzędziem do badania uwalniania pęcherzyków.
- Badanie to poszerza wiedzę na temat mechanizmów neurotransmisji.
- FM 4-64 stanowi niezawodną metodę wizualizacji pęcherzyków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowy pomiar egzocytozy pęcherzyków synaptycznych za pomocą znakowania barwnikami FM dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów uwalniania neuroprzekaźników, co wspiera wczesną walidację celów w procesie odkrywania leków ukierunkowanych na neurobiologię. Podejście to umożliwia bezpośrednie porównanie kinetyki uwalniania pęcherzyków pomiędzy neuronami poddanymi manipulacjom genetycznym lub farmakologicznymi a grupą kontrolną, co pozwala na mechanistyczne ograniczenie ryzyka i zwiększenie pewności prognostycznej w kluczowym momencie procesu odkrywania leku.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie mechanizmów uwalniania synaptycznego w kulturach neuronalnych istotnych dla przebiegu chorób.
- Wspiera funkcjonalną walidację manipulacji genetycznych lub farmakologicznych wpływających na egzocytozę.
- Ułatwia ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez kwantyfikację zmian w funkcji presynaptycznej.
- Zapewnia pewność prognostyczną przy rozwijaniu programów badawczych nad związkami neuroaktywnymi.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Umożliwia uzyskanie powtarzalnych i ilościowych odczytów uwalniania pęcherzyków w pierwotnych kulturach neuronów.
- Wspiera standaryzację testu w celu porównania synaps transfekowanych z kontrolnymi.
- Umożliwia skalowalną ocenę wpływu związków chemicznych lub interwencji genetycznych na tempo egzocytozy.
- Przygotowuje zwalidowane systemy do dalszego przesiewania modulatorów synaptycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Dostosowuje testy funkcji synaptycznych in vitro do modeli neuronalnych istotnych dla danej choroby.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych po walidację przedkliniczną celów synaptycznych.
- Wspiera dostosowane do ryzyka opracowywanie kandydatów na leki neuroterapeutyczne w oparciu o odczyty funkcjonalne.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Pomiar egzocytozy oparty na barwnikach FM wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, stanowiąc pomost między wczesnymi badaniami mechanistycznymi a walidacją translacyjną w układach neuronalnych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowe określanie uwalniania pęcherzyków synaptycznych w celu weryfikacji hipotez dotyczących mechanizmów neurotransmisji.
- Przesiewanie: Dostarczanie powtarzalnych, ilościowych wyników dla przesiewania związków lub modyfikacji genetycznych w kulturach neuronalnych.
- Analityka: Zapewnienie pomiarów kinetycznych opartych na fluorescencji w celu przeprowadzenia rzetelnego porównania statystycznego warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Powiązanie funkcji synaptycznej in vitro z fenotypami istotnymi dla przebiegu chorób w modelach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Udostępnienie platformy wielokrotnego użytku do oceny różnorodnych interwencji neuroaktywnych w ramach wielu programów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i ogranicza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów synaptycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i skaluje ilościowe testy egzocytozy w celu zapewnienia porównywalności między badaniami.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową w portfelach neurobiologicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków neuroaktywnych i celów genetycznych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli neuronów oraz obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek.
- Niezbędny jest dostęp do odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego oraz specjalistycznych komór perfuzyjnych.
- Wymagane są rygorystyczne protokoły płukania i stymulacji w celu zapewnienia powtarzalności testu.
- Należy dostosować prędkości przepływu oraz czasy płukania, aby zoptymalizować usuwanie barwnika i specyficzność sygnału.
- Ograniczenia praktyczne obejmują potencjalną zmienność stymulacji elektrycznej oraz wydajność pobierania barwnika.
