Długoterminowe Imaging komórkach ssaków przy dużym polu Mikroskopia

W rzeczywistości najpierw zamontuję to tutaj, a następnie dokonam zamiany. Teraz spróbuję przeprowadzić aspirację, starając się być tak delikatnie, jak to możliwe. Dobrze. Przez kilka sekund po prostu trzymam. Dobrze. W porządku.

Ważnymi cechami naszej siatki do obrazowania stylu życia jest to, że jest to mikroskop odwrócony, co oznacza, że obiektyw i próbki znajdują się poniżej. Zatem obiektyw jest skierowany w górę, a cały mikroskop, a w zasadzie niemal cały, włącznie z obiektywami i próbkami, znajduje się w temperaturze 37 °C. Wszystko w tym plastikowym pudełku jest w temperaturze 37 °C.

Bezpośrednio nad stolikiem znajduje się mieszanka powietrza i CO2. Jest to 5% CO2. Idea polega na tym, że próbka znajduje się w komorze, która działa jak inkubator komórkowy.

Oto nasz mieszalnik powietrza i CO2, który nawilża i podgrzewa gaz, a następnie doprowadza go rurką do próbki znajdującej się na stoliku. Dobrze. Dzisiaj przeprowadzimy badanie fluorescencji w jednym kanale – fluorescencji GFP. Jest to wąż, przez który doprowadzany jest 5% CO2, a on sam jest po prostu dopasowany do uchwytu stolika.

To ważne. Następnie możemy je zamknąć, zdjąć i przejść do pierwszej pozycji. Przejdę do pierwszego pola, które jest moją próbką kontrolną, a pozycje wybiorę na podstawie tego, co widzę na ekranie.

Dlatego upewniam się, że faktycznie spoglądam przez mikroskop przy każdym nowym, cóż, ponieważ płaszczyzna ogniskowania dla każdej z studzienek jest inna, dno płytki nie jest idealnie płaskie. Będzie więc konieczne wprowadzenie precyzyjnych korekt podczas przechodzenia ze studzienki do studzienki. Obecnie znajduję się w pierwszej studni, teraz wykonam ostrzenie, więc po prostu włączyłem światło, światło przechodzące w mikroskopie.

Upewniam się, że całe światło dociera do okularów. Następnie zaglądam do środka, aby upewnić się, że pole widzenia jest wyraźne i czyste. Potem wyłączam to światło i włączam światło fluorescencyjne, aby sprawdzić, czy obserwowane komórki wyglądają na zdrowe i nie wykazują cech apoptozy.

I teraz to wyłączam. Następnie wybieram opcję „wyślij”, zatem zacznę teraz wybierać pozycje, co oznacza, że muszę przekierować drogę światła do kamery. Oto kamera.

Zatem konfiguruję mikroskop tak, aby cały obraz był przesyłany do kamery, przez co w okularach nic nie jest widoczne. W oprogramowaniu sterującym mikroskopem wybiorę odpowiedni zestaw filtrów, który w naszym przypadku jest to psy, a następnie ustawię czas ekspozycji.

Znam te komórki bardzo dobrze i wiem, że wymagają one czasu ekspozycji wynoszącego 0,2 sekundy. Zatem tak ustawiam oprogramowanie. Następnie kliknę przycisk ostrości.

To jest, i w zasadzie jest po prostu żywe. Zapali się światło i można, och, nie wiem, czy widać komórki, ale powodem, dla którego to jest dobre pole widzenia, jest to, że wszystkie komórki, nawet pod kątem ich fluorescencji, nie wykazują obecności komórek apoptotycznych. Komórki apoptotyczne mają tendencję do bycia bardzo jasnymi, a w polu widzenia nie ma żadnych zanieczyszczeń ani brudu.

Można zauważyć, że to jest komórka w metafazie, a tamta to również komórka w metafazie, natomiast ta komórka prawdopodobnie właśnie zakończyła mitozę. Wiem to po tym, że te dwa zestawy chromatyny są bardzo wyraźnie względem siebie zorientowane; wyglądają tak, jakby właśnie opuściły anfazę.

Zatem to jest odpowiednie pole. Skoro wiem już, że czas ekspozycji i zestaw filtrów są właściwe – a to będzie zależeć od konkretnego oprogramowania – przejdę do zapisywania pozycji; teraz oprogramowanie zapamięta pozycję X, Y, Z tego pola. Następnie, gdy będę wybierać kolejne pola w tej samej studzience, otworzę migawkę i będę sprawdzać, co widzę na ekranie, i na tej podstawie wybierać pola, zamiast zaglądać bezpośrednio w pole widzenia.

Zatem nie widzę tam żadnego z moich toniców. Ale powtórzę, nawet przy dobrym wycentrowaniu, komórki te przejdą przez mój PS; kontynuuję, oto dobry przykład. To jest dobry przykład tego, czego bym unikał, widzicie, jak mocno to świeci?

To jest bardzo jasne. To prawdopodobnie szczątki komórki apoptotycznej. Powodem, dla którego bym tego unikał, jest fakt, że ze względu na tak dużą jasność, podczas automatycznego ustawiania ostrości oprogramowanie skupi się właśnie na tym punkcie i nie będzie on znajdować się w tej samej płaszczyźnie co wszystkie pozostałe komórki.

Zatem nie otrzymam żadnych informacji z tego pola. To wygląda dobrze. Tutaj mamy prometafazę, a to jest metafaza.

Zatem wykonam pomiary w trzech pozycjach na każdą studzienkę. Po przeanalizowaniu trzech pozycji przejdę do kolejnej studzienki. Prawdopodobnie będę wykonywać zdjęcia co 10 minut, co stanowi rozwiązanie kompromisowe.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym (lifestyle imaging) jest zawsze pewnego rodzaju kompromisem, prawda? Musisz przeprowadzić obrazowanie, a jednocześnie utrzymać komórki w zdrowiu, zwłaszcza jeśli interesuje Cię mitoza. Dlatego należy zminimalizować ich ekspozycję na światło fluorescencyjne.

Aby jednak uzyskać informacje, należy wykonać zdjęcia, zatem trzeba pójść na kompromis i dokonać wyboru co do tego, co chcemy uchwycić i jakiego rodzaju informacje chcemy uzyskać. W naszym przypadku mitoza trwa zazwyczaj około godziny.

Zatem jeśli przyjmiemy 10-minutowe odstępy, jest to całkiem dobra wartość. Widzimy profazę, metafazę i anafazę, a także możemy zaobserwować, kiedy stosuje się zabiegi, leki lub siRNAs wpływające na te konkretne etapy cyklu komórkowego. Dla naszych celów jest to wystarczające, choć zawsze dążymy do uzyskania większej precyzji.

Zawsze dążymy do uzyskania większej liczby pozycji lub dokładniejszego czasu i odstępów bądź czegoś podobnego. Jest to zatem kompromis. Następnie naciskam start.

Nasze oprogramowanie wykonuje zatem przejście autofokusa podczas pierwszego cyklu. Po kliknięciu przycisku start powinno rozpocząć automatyczne ustawianie ostrości, a Państwo zauważą otwieranie i zamykanie migawki pomiędzy etapami autofokusa. Klikam zatem start.

W ten sposób migawka otwiera się i zamyka. Silnik osi Z pracuje i próbuje odnaleźć płaszczyznę o największym kontraście, która będzie najlepiej ostrością. Na ekranie można zauważyć proces poszukiwania optymalnej płaszczyzny ostrości, co może budzić niepokój.

W ten sposób urządzenie steruje silnikiem osi Z, aby odnaleźć płaszczyznę o najlepszej ostrości obrazu. Następnie wykonuje zdjęcie w tym punkcie i zapamiętuje tę pozycję Z, której następnie używa podczas kolejnych 12 przejść.

Następnie ponownie przeprowadzimy etap automatycznego ustawiania ostrości. Jakiego rodzaju eksperymenty wykonujecie? Cóż, nasze laboratorium jest zainteresowane przede wszystkim zrozumieniem mechanizmów regulujących przebieg mitozy, a przynajmniej ja najbardziej interesuję się właśnie tym.

Dzięki obrazowaniu żywych komórek, a zwłaszcza nasz mikroskop do długoterminowego obrazowania wielopozycyjnego, można filmować komórki przez dwa lub trzy dni podczas wchodzenia i przechodzenia przez mitozę, co pozwala na obrazowanie wielu cykli mitotycznych i lepsze zrozumienie tego procesu. Można również poddać komórki działaniu leków, RNA lub dowolnych innych perturbacji, które chcemy badać. Pozwala to zrozumieć, w jaki sposób te leki lub geny wpływają na regulację przebiegu mitozy.

Ponieważ nie jest to praca na utrwalonych komórkach, lecz na żywych komórkach, można zrozumieć, kiedy należy wprowadzić perturbację, aby wpłynąć na mitozę lub która faza mitozy została dotknięta. W tym względzie jest to niezwykle potężne narzędzie. Jakie są główne elementy techniczne tych eksperymentów?

Jakie problemy mogą wystąpić? Cóż, największym problemem, poza samym przygotowaniem aparatury – a przygotowanie aparatury nie jest trywialne – jest u wielu osób posiadanie zestawu, ale konieczność upewnienia się, że działa on prawidłowo w konkretnej zastosowaniu.

Kwestia finansowa nie jest, wiecie, nie jest pomijalna. Istnieje kwestia przygotowania aparatury, a następnie, po zebraniu danych, pojawia się realny problem związany z ich analizą. Chodzi o te filmy; jeśli zbieracie 40 filmów, z których każdy obejmuje 30 komórek – czyli macie 40 pól widzenia, które sfilmowaliście, a w każdym z tych pól znajduje się 30 komórek – musicie usiąść do każdego z tych filmów i przeanalizować każdą z tych komórek w danym nagraniu.

Analiza danych zajmuje bardzo dużo czasu. W efekcie analiza danych, których zebranie zajęło dwa dni, trwa tydzień. Jest to zatem bardzo duża przeszkoda w kontekście gromadzenia dużych ilości danych.

Zatem, choć mamy do czynienia z wysokoprzepustowym gromadzeniem danych, nie jest to analiza wysokoprzepustowa. Co należałoby zatem zrobić, aby ten eksperyment stał się naprawdę wysokoprzepustowy? Nasze laboratorium jest obecnie w procesie opracowywania programu, który automatycznie przeprowadza analizę danych.

I jest to całkiem przyzwoity program. Nie jest idealny. Ludzkie oko zawsze radzi sobie lepiej, ale program zmierza w tym kierunku.

Jakie są zatem interesujące zastosowania tego eksperymentu? Może można wspomnieć o innych dziedzinach? Poza podziałem komórki?

Ma Pani na myśli obrazowanie żywych komórek? Tak. Cóż, można przeprowadzać testy ruchliwości komórek. W zależności od zastosowanej mikroskopii można, wie Pani, obserwować zachowanie komórek, a jeśli bardzo by Pani chciała, można by nawet badać rozwój nowotworu.

Jednakże przy odpowiedniej konfiguracji obrazowania praktycznie nie ma żadnych ograniczeń. Nasz mikroskop posiada szerokie pole widzenia i korzystamy z obiektywu 20x. Jest to zatem konfiguracja o dość niskiej rozdzielczości, ale jest ona wystarczająca do naszych potrzeb.

Zatem istnieją, ale zdecydowanie nie ograniczaliby Państwo swoich możliwości. Każdy rodzaj eksperymentu o charakterze dynamicznym, czyli każdy eksperyment biologiczny, odniósłby naprawdę dużą korzyść z obrazowania na żywo. Przykładem jest obrazowanie wapnia, którego choć nie można wykonać na naszym aparacie, jest to metoda stosowana w żywych komórkach.

Do tego zdecydowanie potrzebne jest obrazowanie żywych komórek. Tak jak wspomniałem, testy z udziałem pacjentów, analizy motywności i tego rodzaju badania odniosłyby ogromną korzyść z zastosowania obrazowania żywych komórek. Czy chciałbyś powiedzieć kilka słów o swoim poprzednim doświadczeniu?

Jak długo pracuje Pan/Pani nad tymi technikami? Nad czym pracował(a) Pan/Pani wcześniej? Wow. Więc w trakcie mojego doktoratu nie pracowałem/am.

Wykorzystywałem często mikroskopię konfokalną, ale nie zajmowałem się obrazowaniem żywych komórek (lifestyle imaging). Dlatego podczas stażu podoktorskiego pomagałem dr. Kingowi w pozyskaniu aparatury, którą wykorzystaliśmy do przygotowania tych fragmentów i uruchomienia całego procesu. Dzięki temu w trakcie stażu podoktorskiego zdobyłem duże doświadczenie zarówno w obrazowaniu szerokopolowym z wykorzystaniem techniki time-lapse na naszym mikroskopie szerokopolowym, jak i w obrazowaniu time-lapse przy użyciu mikroskopii konfokalnej.

Powiedziałbym, że jest to naprawdę potężne narzędzie. Uzyskuje się dzięki niemu wiele informacji, ale nie jest łatwo doprowadzić je do perfekcyjnego działania. Wymaga to zatem ogromnej uwagi i dbałości o szczegóły na każdym, nawet najmniejszym etapie procesu.

I nawet wtedy mogą pojawić się problemy. To zatem wymagająca aplikacja, ale jeśli jest ona niezbędna do zbadania problemu naukowego, to w tym względzie okazuje się nieoceniona, mimo że jest trudna. Dlatego warto znaleźć kogoś, kto zna się na rzeczy, i skorzystać z jego pomocy.

To moja rada. Bardzo dobra.