Identyfikacja kompleksów białkowych za pomocą proteomiki ilościowej u S. cerevisiae

Procedura ta rozpoczyna się od hodowli szczepu przynęty w pożywce zawierającej normalne aminokwasy w szczepzie kontrolnym SLAC oraz ciężką izotopową lizynę i argininę. Równe ilości obu szczepów są mieszane i poddawane lizie przez mielenie i ciekły azot Surowe lizaty, najpierw granulowane przez wirówkę, a następnie oczyszczane przez wiązanie z kulkami sferyzowymi. Lizat komórkowy jest następnie wiązany z kulkami IgG.

Białka związane z kulkami IgG są sygnalizowane przez proteazę, rozszczepienie i wytrącanie się. Próbka jest teraz gotowa do analizy za pomocą spektrometrii mas. Cześć, nazywam się Jesse Chao i pracuję w Lone Lab na Wydziale Biologii Środowiskowej Komórki w Instytucie Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej.

Dzisiaj pokażę Ci procedurę ilościowej analizy proteomicznej zwanej silak. W połączeniu z oczyszczaniem powinowactwa. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania kompleksów białkowych.

Więc zacznijmy W tej procedurze szczep przynęty zawiera normalne aminokwasy, podczas gdy szczep kontrolny SLAC zawiera ciężki izotop, lizynę i argininę. Aby rozpocząć, najpierw wyhoduj jeden litr, każdy ze szczepów przynęty i szczep kontrolny oddzielnie do wartości pokazanej na ekranie. Następnie wlej kulturę do 500-mililitrowych probówek wirówkowych Nalgene.

Zrównoważyć obciążenie w komórkach peletowych przy 2,580 RCF, zdekantować medium i ponownie zawiesić pelety. Z 50 mililitrami zimnego D H2O podczas przenoszenia komórek do 50 mililitrów, probówki wirówkowe, odwiruj probówki, aby granulować komórki przy 3000 RCF. W tym momencie możesz zamrozić pellet w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Ważne jest, aby pamiętać o dopasowaniu kultury szczepu kontrolnego do kultury szczepu przynęty w stosunku jeden do jednego na podstawie masy suchego granulatu. Zawiesić każdą osadkę komórkową w 10 mililitrach buforu NP 40 za pomocą koktajlu inhibitorów proteazy od jednego do 2000. Wymieszaj dwie kultury komórkowe, bezpośrednio dekantując jedną probówkę do drugiej.

Aby najpierw rozpocząć mielenie komórek, wlej ciekły azot do wstępnie schłodzonej zaprawy i pozwól mu całkowicie odparować. Następnie dodaj dwa mililitry komórek do zaprawy. Wlej trochę ciekłego azotu, aby zamrozić komórki.

Zmiel komórki, aż staną się drobne. Proszek. Powtarzaj proces, aż wszystkie komórki zostaną zmielone. Pamiętaj, aby nie dopuścić do rozmrożenia komórek.

W razie potrzeby dodaj ciekły azot. Następnie przenieś proszek do lodowatej zlewki i rozmroź w temperaturze pokojowej. Gdy krawędzie zaczną się rozmrażać, dodaj 20 mililitrów bufora NP 40 z jednym do 200 po rozmrożeniu.

Przenieś surowy lizat do 40-mililitrowych probówek Nalgene i wiruj z prędkością 16 000 obr./min w wirniku Sovos SA 600 przez 30 minut. Czekając, weź 300 mikrolitrów SRO, dwie kulki B i trzykrotnie umyj kulki w 300 mikrolitrach buforu NP 40. Następnie ponownie zawieś kulki w o pojemności 300 mikrolitrów, tak aby znalazły się w zawiesinie jeden do jednego.

Następnym krokiem jest wstępne oczyszczenie lizatu komórkowego. Aby to zrobić, najpierw przenieś super natin do nowej rurki i dodaj do Spheros dwa koraliki B. Inkubować na obrotowej platformie w chłodnym pomieszczeniu przez 30 minut.

Podczas inkubacji weź 300 mikrolitrów IgG SROs sześć kulek i trzykrotnie umyj kulki w 300 mikrolitrach buforu NP 40. Następnie ponownie zawieś kulki w o pojemności 300 mikrolitrów, tak aby znalazły się w zawiesinie jeden do jednego. Po inkubacji osadzać w nich substancje samowystarczalne.

Dwa z nich są w środku. Przenieść supernatant do nowej probówki. Pamiętaj, aby zachować porcję lizatu komórkowego do późniejszego western blot.

Następnie dodaj kulki IgG. Podziel zawartość na dwie probówki dla bardziej efektywnego wiązania, inkubuj na obrotowej platformie w chłodnym pomieszczeniu przez dwie godziny. Po inkubacji zebrać kulki w kolumnie chromatograficznej w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Upewnij się, że zapisałeś porcję frakcji niezwiązanej. Umyj koraliki 10 mililitrami. Bufor NP 40.

Następnie umyj koraliki trzema mililitrami. Bufor TEVC. Ponownie pamiętaj, aby zapisać porcję koralików.

Będzie to odzwierciedlać skuteczność wiązania w celu elucji koralików. Najpierw dodaj pięć mikrolitrów A-C-T-E-V do jednego mililitra buforu TEVC. Dodaj bufor TEVC do koralików i wymieszaj.

Przenieś zawartość do dwóch 1,5-mililitrowych probówek EINOR z bardziej wydajnego mieszania i inkubuj na obrotowej platformie w chłodni przez noc. Następnie odwiruj kulki i przenieś eluat do świeżej 1,5 mililitrowej probówki. Po umyciu umyj koraliki dodatkowymi 0,5 mililitra bufora TEVC.

Połącz osiem w jednej tubce. W sumie powinieneś mieć 1,5 mililitra ELU eight. Zaoszczędź podwielokrotność TEV Elu osiem do wytrącenia.

Dostosuj podwielokrotności do 25%TCA ze stuprocentowym TCA. Aby to zrobić, rozdziel 1,5 mililitra LU osiem na dwie probówki po 750 mikrolitrów każda. Dodaj 250 mikrolitrów 100% TCA do probówki.

Twój roztwór powinien zmienić kolor na mleczny. Następnie umieść go na lodzie na 30 minut. Okresowe wirowanie mieszaniny po inkubacji.

Wirować z maksymalną prędkością w wirówce stołowej w chłodni przez 30 minut. Umyć raz 500 mikrolitrami lodowatego acetonu zawierającego 0,05 zwykłego kwasu solnego. Następnie wiruj przez pięć minut z maksymalną prędkością w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Następnie umyj raz 500 mikrolitrami lodowatego acetonu i wiruj przez pięć minut z maksymalną prędkością w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po odwirowaniu ostrożnie usuń aceton i suchy granulat do barwienia srebra. Zawiesić osad w 50 mikrolitrach jednorazowego buforu próbki SDS.

Jeśli planujesz użyć wytrąconego białka do analizy opartej na spektrometrii mas, zaleca się wytrącanie przy użyciu etanolu. Aby to zrobić, najpierw dodaj 20 mikrogramów glikogenu, a następnie rozcieńcz próbki pięciokrotnie stuprocentowym etanolem i dostosuj do 50 milimolowych wodorowęglanu sodu z 2,5 molowym zapasem o pH 5,0. Wymieszaj roztwór, odwracając probówkę.

Odstawić na dwie godziny w temperaturze pokojowej. Na koniec podziel zawartość na dwie probówki einor. Wytrącone białko osadzać przez odwirowywanie przez 10 minut w temperaturze 12 000 GS w temperaturze pokojowej.

Podwielokrotność zapisana podczas procedury oczyszczania powinna zawierać wstępnie oczyszczony lizat komórkowy, frakcję związaną, frakcję niezwiązaną i frakcję umkniętą. Zalecamy analizę zawartości białek w powyższych porcjach za pomocą Western blot przy użyciu przeciwciała Antit TAP lub barwienia srebrem, aby odzwierciedlić skuteczność wiązania i elucji eksperymentu. W tym oczyszczonym żelu do barwienia srebra SCS dwa stuknięcia w jego interakcję, partnerzy zostali zwizualizowani i porównani z nieoznakowaną kontrolą w tej zachodniej plamie.

Różne frakcje pobrane podczas oczyszczania SCS two tap analizowano za pomocą Western blot przy użyciu przeciwciała Antit tap. Zauważ, że SCS dwa kran migrował z niższą masą cząsteczkową po wyjaśnieniu przez rozszczepienie proteazy TEV i nie pozostał żaden S SCS dwa kran na kulkach IgG po elucji. Potwierdziło to, że oczyszczanie było bardzo wydajne.

Właśnie pokazaliśmy, jak oczyszczać kompleksy białkowe poprzez oczyszczanie powinowactwa za pomocą kulek IgG. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać, aby upewnić się, że przed rozpoczęciem procedury oczyszczania należy upewnić się, że szczep podstawowy i szczep kontrolny są dopasowane pod względem masy suchej pele. Ponieważ LAC zapewnia nam bezstronne i dokładne pomiary partnerów wiążących białka, przeprowadzamy tylko pierwszy etap oczyszczania z kranu, aby zminimalizować straty próbki.

Jeśli doświadczysz znacznych ilości niespecyficznych wiązań, możesz chcieć przeprowadzić cały protokół, który można znaleźć w podręczniku Cold Springing Harbor. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

Hej, daj spokój, mark. Ach, idź.