Wykrywanie ogniskowych przejściowych zmian stężenia Ca²⁺ w mięśniach gładkich

W pierwszej kolejności przygotowuje się roztwór do ładowania wapniem, który następnie należy ogrzać i napowietrzyć. Pęcherz moczowy zostaje wypreparowany, otwarty i rozpięty na płasko, a następnie pobiera się pasek mięśnia detrusora. Pasek detrusora umieszcza się w roztworze do ładowania, inkubuje, płucze, a następnie rozpina na płasko.

Poziom podstawowy wapnia w tkance jest pobudzany światłem laserowym, a emitowane światło jest rejestrowane. Filmy składające się z pojedynczych klatek są analizowane poprzez porównywanie kolejnych klatek. Tło zostaje odjęte.

Próg krawędzi komórki określa obszar, w którym mogą zostać znalezione zdarzenia, a następnie obliczany jest stosunek między kolejnymi próbkami mózgu. Jeśli pozostałe zdarzenia spełniają zdefiniowane kryteria, zostają one wyróżnione i oznaczone. Witajcie, nazywam się John Young i reprezentuję laboratoria Keitha Braina i Toma Kinane'a z Katedry Farmakologii na Uniwersytecie Oksfordzkim.

Jestem Rob Amos, również z laboratoriów Brain i Canne, a ja nazywam się Keith Brain. Dzisiaj John i Rob zaprezentują Państwu technikę obrazowania wapnia w mięśniach gładkich. Stosujemy ją w naszym laboratorium do badania uwalniania neuroprzekaźników z nerwów autonomicznych oraz ich wpływu na mięśnie gładkie.

Zacznijmy zatem. Wskaźnik wapnia Organ Green 488 BAPTA-1 jest dostarczany w fiolkach o pojemności 500 µL zawierających 50 µg proszku. Aby przygotować wskaźnik wapnia, należy dodać 40 µL roztworu DMF do proszku i delikatnie mieszać przez 30 s, a następnie dodać 460 µL fizjologicznego roztworu soli PSS i ponownie delikatnie mieszać przez kolejne 30 s.

Końcowy roztwór organ green 4 88 BAFTA o stężeniu 10 µM zapewnia cztery alikwoty po 125 µL każda. Należy unikać ekspozycji na światło i przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C przed przeprowadzeniem sekcji interesującej tkanki.

Wyjmij wskaźnik wapnia z zamrażarki i odtaj go w temperaturze pokojowej, dopóki wskaźnik wapnia nie będzie płynny. Wlej jeden mililitr PSS do probówki i umieść ją w kąpieli wodnej o temperaturze 33 °C. Zamocuj napowietrzacz w probówce za pomocą korka lub użyj rurki perfil, a następnie napowietrzaj mieszaniną 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla z prędkością około jednego pęcherzyka na sekundę.

Wypreparuj organ z mięśni gładkich z organizmu zwierzęcia. W tym przypadku jest to pęcherz moczowy myszy. Umieść organ w około 50 mililitrach PSS w celu jego przemycia; po dokładnym przemyciu tkanki ostrożnie usuń tkankę tłuszczową i tkankę łączną.

Przeprowadź sekcję zgodnie z typem laurean dla mięśni gładkich pęcherza moczowego. Rozetnij pęcherz wzdłużnie od szyjki pęcherza, przez koniec dystalny, aż do szczytu kopuły. W części kranialnej przygotuj cztery paski o długości od 6 do 8 mm i szerokości od 1 do 2 mm wzdłuż powierzchni grzbietowej, tnąc w kierunku dominujących pęczków mięśniowych.

Umieścić wypreparowaną tkankę oraz wstępnie ogrzany i napowietrzany PSS do załadowania wskaźnika wapnia, dodając do tkanki w probówce 125 µL 10 µM organ green 488B, a następnie delikatnie potrząsnąć probówką w dłoni w celu wymieszania. Zwrócić probówkę do łaźni wodnej. Wznowić napowietrzanie i przykryć łaźnię wodną arkuszem folii.

Czas potrzebny na wchłonięcie wskaźnika wapnia przez odpowiednią ilość tkanki różni się w zależności od rozmiaru tkanki i grubości warstwy mięśni gładkich. Na przykład w przypadku mięśnia detrusora myszy i oxs szczura czas ten wynosi 70 minut, natomiast w przypadku mięśnia detrusora szczura i VAs deens myszy inkubację prowadzimy przez 120 minut.

Po załadowaniu tkanki wskaźnikiem wapnia można ją przygotować do mikroskopii. Najpierw płucz tkankę w napowietrzonym roztworze PSS przez 10 minut. Następnie zamocuj tkankę w naczyniu preparacyjnym wyłożonym osłoną S guard.

Lekko rozciągnąć tkankę, aby utworzyć płaski arkusz. Przypiąć tkankę za pomocą krótkich odcinków, na przykład 2 mm srebrnego drutu o średnicy od 25 do 50 µm, wbijając piny pod kątem.

Należy unikać używania szpilek o długości przekraczającej kilka milimetrów, ponieważ mogą one zarysować obiektyw. Staranne przypięcie tkanki jest ważne, aby zminimalizować jej samoistne kurczenie się oraz ułatwić zlokalizowanie odpowiedniego miejsca do obrazowania. Po przypięciu tkanki należy umieścić naczynie z preparatem na stoliku mikroskopu.

Należy uważać, aby PSS nie wypłynął poza obszar szalki wyłożony osłoną silikonową, ponieważ może to doprowadzić do pokrycia PSS dużego obszaru. W celach demonstracyjnych, po rozpoczęciu superfuzji, następujące kroki zostaną wykonane w świetle.

Należy pamiętać, że doświadczenia te są zazwyczaj przeprowadzane w ciemności. Włącz pompę, aby przeprowadzić superfuzję preparatu. W przypadku PSS często stosuje się przepływ na poziomie 100 milliliters per hour.

Włącz urządzenie grzewcze, a następnie umieść rurki dopływowe i odpływowe oraz sondę temperatury na naczyniu preparacyjnym, mocując każdą z nich do metalowego paska za pomocą magnesu znajdującego się u podstawy. Wysokość końcówki rurki odpływowej określi głębokość PSS. Należy zachować ostrożność i upewnić się, że odpływ rzeczywiście usuwa PSS, ponieważ czasami tak się nie dzieje.

Wstępnie ustaw temperaturę na urządzeniu grzewczym, aby osiągnąć pożądaną temperaturę w zakresie od 33 do 35 °C. Pozostaw tkankę do wyrównania temperatury przez co najmniej 10 minut, używając obiektywu o niskiej powiększeniu, 10x lub 20x.

Użyj fluorescencji epifluorescencyjnej lub wzbudzenia światłem niebieskim, aby uwidocznić mięśnie gładkie i zidentyfikować odpowiedni obszar do monitorowania. Ponieważ ekspozycja na wzbudzenie i oświetlenie powoduje fotoblaknięcie wskaźnika, należy unikać stosowania tej metody przez więcej niż kilka sekund jednorazowo.

Należy unikać obszarów z jasnymi strukturami, ponieważ mogą one powodować dużą liczbę wyników fałszywie dodatnich w algorytmie detekcji obrazu. Należy starać się wybrać miejsce z minimalnym ruchem i dużą liczbą komórek mięśni gładkich w polu widzenia. Po wybraniu miejsca do obrazowania należy przełączyć na obiektyw o większym powiększeniu, np. 40 x.

Obrócić stoлик lub oś optyczną tak, aby komórka lub komórki mięśni gładkich znajdowały się w pozycji poziomej, czyli równolegle do osi szybkiego skanowania. Komórki mięśni gładkich są teraz gotowe do obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej.

W niniejszym protokole wykorzystujemy pionowy mikroskop konfokalny Leica SP dwa. Należy zamknąć otwór pinhole do wielkości jednej plamki Airy’ego. Moc lasera na filtrowym strojonym filtrze custo optic należy ustawić w zakresie od 25 do 35%.

Wartość ta stanowi kompromis pomiędzy jasnością a fotowyblakaniem. Aby przygotować się do analizy danych, należy pobrać i zainstalować program ImageJ. Pobierz wersję odpowiednią dla swojego systemu operacyjnego, a następnie zaktualizuj ją do najnowszej wersji, pobierając najnowszy plik jar programu ImageJ w celu zastąpienia starego pliku. Następnie pobierz plik jar programu Excel writer i zainstaluj go w katalogu plugins jar.

Skopiuj te pliki do katalogu plugins. Zainstaluj każdy z tych skryptów za pomocą makr wtyczek. Zainstaluj funkcję w programie ImageJ. Oprogramowanie do mikroskopu konfokalnego Leica SP2, którego używamy, nazywa się Leica.

LCS zapisuje poszczególne klatki każdej serii jako oddzielne pliki. Aby zrekonstruować serię, należy upewnić się, że wszystkie klatki przeznaczone do rekonstrukcji znajdują się w jednym folderze.

Na przykład folder danych tiffs. Następnie z menu plugins macros należy wybrać makro Leica SP two stacker. Wybierz katalog główny, w tym przypadku folder danych.

Wybierz odpowiedni folder z listy rozwijanej. W tym przypadku wybierz katalog wyjściowy dla plików tiff lub utwórz nowy. Na przykład folder data stacks.

Następnie skrypt zrekonstruuje serie z poszczególnych klatek, aby skorygować ruch. Używamy ogólnodostępnego algorytmu, który wyrównuje lub dopasowuje klatki w obrębie serii: downloads stack, rig oraz turbo reg. Skopiuj pliki dla każdego z nich do folderu stacks.

Wczytaj stos obrazów do przetworzenia, a następnie przejdź do klatki, która wyraźnie pokazuje obszar zainteresowania. Pozostałe klatki zostaną wyrównane do tej klatki referencyjnej. Następnie przejdź do menu wtyczek (plugins), a potem do sekcji stosy (stacks).

Rejestracja stosu. Należy wypróbować różne transformacje, aby określić, która jest najskuteczniejsza dla każdego miejsca. Czynniki obrazowania wpływające na detekcję przejściowych wzrostów stężenia wapnia będą się różnić w zależności od pomiaru określonych właściwości i parametrów cząsteczkowych każdego miejsca.

Zwiększono czułość i swoistość detekcji. W związku z tym dla każdego obszaru obliczymy próg dla odjętego progu stosunku oraz próg krawędzi komórki. Aby rozpocząć, przejdź do plugins, macros, install i wybierz jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Następnie przejdź do plugins macros load stack.

Wybierz serię i oblicz następujące parametry cząsteczek. Aby obliczyć próg dla metody odejmowania (subtracted), zaznacz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) w miejscu, które uznajesz za pomiar tła. Zanotuj średnią. Aby obliczyć próg dla metody stosunku (ratio), zaznacz prostokątny obszar zainteresowania wokół optycznie płaskiego obszaru komórki lub komórek mięśnia gładkiego.

Zmierz i zapisz średnią oraz odchylenie standardowe. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy lub narysuj trzy ramki jednocześnie, naciskając shift. Oblicz i zapisz wartość progową dla stosunku.

Oblicz wartość jako odchylenie standardowe podzielone przez średnią plus jeden, a następnie pomnóż wynik przez 32. Przy uśrednianiu wartości z trzech powtórzeń, mnożnik 32 jest niezbędny, aby uwzględnić algorytm obliczania stosunku, w którym brak zmian w stosunku do poprzedniej klatki jest mapowany na wartość całkowitą 32. Zapewnia to odpowiedni zakres dynamiczny do wykrywania wzrostów i spadków tego stosunku.

W przypadku obrazu 8-bitowego wybierz opcję dostosowania progu obrazu (image adjust threshold). Wybierz tryb czarno-biały. Zdefiniuj górną granicę suwaka i zanotuj odpowiadającą jej wartość.

Znajduje się to po prawej stronie suwaka. Liczone będą tylko zdarzenia występujące w obszarach czarnych. Kliknij reset.

Po obliczeniu progów odjęcia dla stosunku oraz progu krawędzi komórki można przystąpić do analizy stosów obrazów. Należy określić lokalizację stosów przeznaczonych do analizy. Na tym etapie należy wybrać tylko jedną serię.

Jest to pierwszy plik, a ostatni plik powinien być taki sam. Następnie wybierz lokalizację dla plików danych wyjściowych i stosów. Na przykład folder danych wyjściowych.

Wprowadź wartości progu odejmowania, progu stosunku oraz progu krawędzi komórki. Pozostałe ustawienia pozostaw w wartościach domyślnych. Algorytm wygeneruje okno z dwoma panelami, w którym po lewej stronie zostanie wyświetlona seria przetworzona, a po prawej seria oryginalna.

Otwórz ten plik z folderu wyjściowego i dokładnie go przeanalizuj, aby ocenić liczbę wyników fałszywie dodatnich oraz przypadki, w których zdarzenia widoczne gołym okiem nie zostały wykryte. Dla każdej serii algorytm generuje plik Excel, który szczegółowo opisuje charakterystykę wykrytego zdarzenia, taką jak amplituda, powierzchnia i pozycja; wyniki fałszywie dodatnie, zidentyfikowane podczas przeglądania plików obrazów wygenerowanych przez algorytm, można ręcznie usunąć z tego pliku Excel. Należy jednak stosować w tym celu rygorystyczne kryteria.

Jest to film przedstawiający przejścia wapniowe w mięśniach gładkich. W tym przykładzie film składa się ze 100 poszczególnych klatek zarejestrowanych z częstotliwością pięciu herców. Podczas badania, na przykład, wpływu konkretnego leku na częstotliwość przejść wapniowych, rejestrowalibyśmy wiele takich filmów w ramach jednego eksperymentu.

Tutaj widzimy liczne spontaniczne przejściowe wzrosty stężenia wapnia w komórkach mięśni gładkich. Przedstawiono tutaj wynik działania algorytmu detekcji cząstek. Dla każdej serii algorytm generuje plik Excel zawierający szczegółowe charakterystyki wykrytego zdarzenia, takie jak amplituda, obszar i pozycja.

Zaprezentowaliśmy metodę obrazowania przejściowych zmian stężenia wapnia w narządach z mięśni gładkich, takich jak pęcherz moczowy, a także sposób analizy tych zmian za pomocą algorytmu opracowanego w naszym laboratorium. Kluczową kwestią jest odpowiednie przygotowanie tkanki do obrazowania wapnia. W przypadku tkanki zaprezentowanej dzisiaj polega to na usunięciu tkanki łącznej oraz wszelkich złogów tłuszczu, które mogłyby zasłaniać pole widzenia.

Ważne jest również, aby przypiąć tkankę w płaskim arkuszu. Życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów i dziękujemy za oglądanie.