Ogniskowe Ca²⁺ Przejściowe wykrywanie mięśni gładkich

Najpierw przygotowuje się roztwór wapnia, podgrzewa się go i bąbelkuje. Pęcherz moczowy jest wycinany, otwierany, przypinany na płasko i pobierany jest pasek wypieracza. Pas wypieracza dodaje się do roztworu ładującego, inkubuje i wypłukuje, wypłukuje na płasko.

Czwarte dno wapniowe w tkance jest wzbudzane przez światło laserowe, w wyniku czego wychwytywane jest emitowane światło. Filmy składające się z pojedynczych klatek analizowane są poprzez porównywanie kolejnych klatek. Tło jest odejmowane.

Próg krawędzi komórki określa, gdzie można znaleźć zdarzenia i pobierany jest stosunek między kolejnymi mózgami. Jeśli pozostałe zdarzenia spełniają wstępnie zdefiniowane kryteria, zostaną wyróżnione i oznaczone etykietą. Cześć, nazywam się John Young i pracuję w laboratoriach Keitha Braina i Toma Kinane'a na Wydziale Farmakologii Uniwersytetu Oksfordzkiego.

Nazywam się Rob Amos, również pracuję w Brain and Canne Labs i nazywam się Keith Brain. Dzisiaj John i Rob pokażą Ci technikę obrazowania wapnia w mięśniach gładkich. Używamy tego w naszym laboratorium do badania uwalniania neuroprzekaźnika z nerwów autonomicznych i jego wpływu na mięśnie gładkie.

Więc zacznijmy. Zielony narząd wskaźnika wapnia, 4 88 BAFTA 1:00 AM jest dostępny w fiolkach o pojemności 500 mikrolitrów zawierających 50 mikrogramów proszku. Aby przygotować wskaźnik wapnia w 40 mikrolitrach roztworu Onic F1 27 do proszku i delikatnie wstrząsać przez 30 sekund, a następnie w 460 mikrolitrach roztworu soli fizjologicznej PSS i delikatnie wstrząsać przez kolejne 30 sekund.

Ostateczne rozwiązanie, 10 mikro zębów trzonowych narządu zielonego. 4 88 BAFTA 1:00 AM dostarcza cztery porcje po 125 mikrolitrów każdy. Unikaj ekspozycji na światło i przechowuj roztwór w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przed wypreparowaniem tkanki będącej przedmiotem zainteresowania.

Wyjmij wskaźnik wapnia z zamrażarki i rozmrozić w temperaturze pokojowej, gdy wskaźnik wapnia jest twoj. Umieść jeden mililitr PSS w probówce i łaźni wodnej o temperaturze 33 stopni Celsjusza. Przymocuj bełkotkę do probówki za pomocą korka lub możesz również użyć perfilu, a następnie bąbelkować mieszanką 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla w tempie około jednego pęcherzyka pojawiającego się na sekundę.

Wypreparuj narząd mięśni gładkich od zwierzęcia. W tym przypadku jest to pęcherz moczowy myszy. Umieść narząd w około 50 milimetrach PSS, aby go umyć, po umyciu tkanki ostrożnie usuń ciero tkankę tłuszczową i tkankę łączną.

Rozwiń otwórz zgodnie z typem mięśni gładkich laurean dla pęcherza moczowego. Otwórz wzdłużnie od szyjki pęcherza, koniec rozpieszczany do szczytu kopuły. Koniec czaszki Przygotuj cztery paski o długości od sześciu do ośmiu milimetrów i szerokości od jednego do dwóch milimetrów wzdłuż grzbietowej powierzchni ressera przecinając w kierunku dominujących wiązek mięśni.

Umieść wypreparowaną tkankę oraz przedwojenny i pęcherzykowy PSS, aby załadować wskaźnik wapnia w 125 mikrolitrach 10 mikromolowych narządów zielonych, 4 88 B do 1:00 AM do tkanki w probówce i lekko potrząśnij ręką, aby wymieszać. Włóż rurkę z powrotem do łaźni wodnej. Wznów bulgotanie i przykryj łaźnię wodną arkuszem folii.

Czas potrzebny do wchłonięcia wskaźnika wapnia przez wystarczającą ilość tkanki różni się w zależności od wielkości tkanki i grubości warstwy mięśni gładkich. Na przykład w przypadku odstraszacza myszy i szczurów wołów jest to 70 minut. Natomiast w przypadku odstraszacza szczurów i myszy VA wysiadywamy przez 120 minut.

Po załadowaniu tkanki wskaźnikiem wapnia można ją przygotować do mikroskopii. Najpierw płucz tkankę w bąbelkowym PSS przez 10 minut. Następnie zamontuj chusteczkę w naczyniu wyłożonym osłoną S.

Rozciągając go lekko, aby utworzyć płaski arkusz. Przypnij tkankę za pomocą krótkich odcinków. Na przykład dwa milimetry srebrnego drutu o średnicy od 25 do 50 mikrometrów i włóż kołki pod kątem.

Unikaj używania szpilek dłuższych niż kilka milimetrów, ponieważ mogą one porysować obiektyw. Staranne przypinanie tkanki jest ważne ze względu na zminimalizowanie samoistności tkanki i ułatwienie lokalizacji odpowiedniego miejsca do obrazowania. Po przypinaniu tkanki umieść naczynie do przygotowywania na stoliku mikroskopu.

Uważaj, aby PSS nie wydostał się z obszaru wyłożonego osłoną sil guard naczynia. Ponieważ może to prowadzić do pokrycia dużego obszaru PSS. Kiedy superfuzja rozpocznie się w celach demonstracyjnych, następujące kroki zostaną wykonane w świetle.

Należy pamiętać, że eksperymenty te są zwykle wykonywane w ciemności. Włączyć pompę, aby super stopić preparat. W przypadku PSS często stosuje się szybkość 100 mililitrów na godzinę.

Włączyć nagrzewnicę, umieścić rurki doprowadzające i odpływowe oraz sondę temperatury na naczyniu przygotowawczym, mocując każdą z nich do metalowego paska za pomocą magnesu na jego podstawie. Wysokość końcówki rurki odpływowej określi głębokość PSS. Należy uważać, aby upewnić się, że odpływ faktycznie usuwa PSS, ponieważ czasami tak się nie dzieje.

Początkowo ustaw temperaturę na nagrzewnicy, aby osiągnąć żądaną temperaturę w zakresie od 33 do 35 stopni Celsjusza. Pozwól tkance zrównoważyć się przez co najmniej 10 minut z obiektywem o małej mocy. 10 lub 20 razy.

Użyj fluorescencji epi lub wzbudzenia niebieskim światłem, aby wyświetlić mięśnie gładkie i zidentyfikować odpowiedni obszar do monitorowania. Od momentu wystawienia na wzbudzenie oświetlenie spowoduje fotowybielanie wskaźnika. Unikaj używania przez więcej niż kilka sekund na raz.

Unikaj widoczności z jasnymi strukturami, ponieważ mogą one powodować dużą liczbę fałszywych alarmów w algorytmie wykrywania obrazu. Spróbuj wybrać miejsce z minimalnym ruchem i dużą liczbą komórek mięśni gładkich w terenie. Po wybraniu miejsca do zobrazowania przełącz się na obiektyw o większej mocy, taki jak 40 x.

Obróć stolik lub oś optyczną tak, aby komórka lub komórki mięśni gładkich leżały poziomo. Jest to równolegle do osi szybkiego skanowania. Komórki mięśni gładkich są teraz gotowe do obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej.

W tym protokole używamy dwóch pionowych mikroskopów konfokalnych Leica SP. Zamknij otwór na jeden przewiewny dysk. Ustaw moc lasera w zakresie od 25 do 35% na filtrze optycznym dostrojonym w czujniku.

Ta wartość jest kompromisem między jasnością a wybielaniem zdjęć. Aby przygotować się do analizy danych, pobierz i zainstaluj obraz J. Pobierz wersję specyficzną dla platformy, a następnie zaktualizuj do najnowszej wersji, pobierając najnowszy plik jar ImageJ, aby zastąpić stary plik. Następnie pobierz plik jar programu Excel Writer i zainstaluj go w katalogu jar wtyczek.

Skopiuj te pliki do katalogu wtyczek. Zainstaluj każdy z tych skryptów za pomocą makr wtyczek. Zainstaluj funkcję obrazu J. Oprogramowanie do dwukonfokalnego mikroskopu Leica SP, którego używamy, nazywa się Leica.

LCS zapisuje poszczególne klatki każdej serii jako osobny plik. Zrekonstruować serię. Upewnij się, że wszystkie ramki do zrekonstruowania znajdują się w jednym folderze.

Na przykład tiffs folderu danych. Następnie wybierz makro Leica SP two stacker z menu makr wtyczek. Wybierz katalog główny w tym przypadku folder danych.

Wybierz żądany folder z listy rozwijanej. W takim przypadku tiffs wybierają katalog wyjściowy lub generują nowy. Na przykład stosy folderów danych.

Skrypt następnie zrekonstruuje serie z poszczególnych klatek, aby skorygować je na podstawie ruchu. Używamy ogólnodostępnego algorytmu, który wyrównuje lub dopasowuje klatki w serii pobrań, stosu, platformy i turbo rejestru. Skopiuj pliki dla każdego z nich do folderu stosów.

Załaduj stos do przetworzenia, a następnie przejdź do ramki, która wyraźnie pokazuje pole zainteresowania. Inne klatki zostaną wyrównane do tego układu odniesienia. Następnie przejdź do stosów wtyczek.

Reg. Stack Reg. Wypróbuj każdą z różnych transformacji, aby określić, co jest najbardziej efektywne dla każdej witryny. Zobrazowane czynniki, które wpływają na wykrywanie stanów przejściowych wapnia, będą się różnić w zależności od pomiaru określonych właściwości, parametrów cząstek w każdym miejscu.

Zwiększa się czułość i swoistość wykrywania. W ten sposób dla każdej witryny obliczymy próg dla odjętego progu dla współczynnika i próg krawędzi komórki. Aby rozpocząć, przejdź do wtyczek, makr, zainstaluj i wybierz jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Następnie przejdź do stosu ładowania makr wtyczek.

Wybierz serię i oblicz następujące parametry cząstek. Aby obliczyć próg odejmowania, wybierz prostokątny obszar zainteresowania nad tym, co uważasz za miarę tła. Zanotuj średnią Aby obliczyć próg stosunku, wybierz prostokątny obszar zainteresowania wokół optycznie płaskiego obszaru komórki lub komórek mięśni gładkich.

Zmierz, zanotuj średnią i odchylenie standardowe. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy lub możesz narysować trzy pola jednocześnie, naciskając Shift. Oblicz dodawanie, zanotuj próg stosunku.

Oblicz jako odchylenie standardowe podzielone przez średnią, dodaj jeden, a następnie pomnóż wynik przez 32. Uśredniając wartości z trzech powtórzeń, współczynnik 32 jest niezbędny do uwzględnienia algorytmu ilorazowania, w którym żadna zmiana z ramki postępowania nie jest odwzorowywana na wartość całkowitą 32. Daje to dobry zakres dynamiki do wykrywania wzrostów i spadków współczynnika.

W przypadku obrazu ośmiobitowego wybierz opcję Image adjust threshold. Wybierz czerń i biel. Zdefiniuj poniżej górnej granicy suwaka i zanotuj odpowiednią wartość.

Znajduje się po prawej stronie suwaka. Pod uwagę będą brane tylko wydarzenia mające miejsce w czarnych regionach. Kliknij przycisk Resetuj.

Teraz, gdy próg odjętego progu dla wskaźnika i próg przewagi sprzedaży został obliczony, możemy przeanalizować stosy obrazów. Określ lokalizację stosów, które mają być analizowane. Na tym etapie wybierz tylko jedną serię.

To jest pierwszy plik, a ostatni plik powinien być taki sam. Następnie wybierz lokalizację, w której mają być wyprowadzane pliki danych i stosy. Na przykład dane wyjściowe folderu danych.

Wprowadź wartości progu dla odjętego progu dla wskaźnika i progu krawędzi sprzedaży. Pozostaw inne ustawienia z wartościami domyślnymi. Algorytm wytworzy okno z podwójnym panelem, w którym przetworzona seria jest pokazana po lewej stronie, a oryginał po prawej.

Otwórz ten plik z folderu wyjściowego i dokładnie go przejrzyj, aby ocenić liczbę fałszywych alarmów i sytuacji, w których zdarzenia widoczne gołym okiem nie zostały wykryte. Dla każdej serii algorytm tworzy plik Excel, który zawiera szczegółowe informacje o charakterystyce wykrytego zdarzenia, takie jak obszar amplitudy i pozycja wyników fałszywie dodatnich zidentyfikowanych przez przejrzenie plików obrazów, które algorytm wyprowadza, mogą zostać ręcznie usunięte z tego pliku Excel. Chociaż powinieneś mieć ścisłe kryteria, aby to zrobić.

To jest film o przemijaniu wapnia w mięśniach gładkich. W tym przykładzie film składa się ze 100 pojedynczych klatek uzyskanych z częstotliwością pięciu herców. Zdobywaliśmy wiele z tych filmów w jednym eksperymencie, badając, na przykład, wpływ konkretnego leku na częstość występowania przemijającego wapnia.

Tutaj widzimy liczne spontaniczne przejściowe wapnie w komórkach mięśni gładkich. Wynik algorytmu wykrywania cząstek jest pokazany tutaj. Dla każdej serii algorytm tworzy plik Excel, który zawiera szczegółowe informacje o charakterystyce wykrytego zdarzenia, takie jak obszar amplitudy i położenie.

Pokazaliśmy metodę obrazowania transu wapniowego w narządach mięśni gładkich, takich jak pęcherz moczowy, i pokazaliśmy sposób, w jaki analizujemy te przejściowe stany wapnia za pomocą algorytmu, który opracowaliśmy w laboratorium. Ważne rzeczy, o których należy pamiętać, to dobre przygotowanie tkanki do obrazowania wapnia. W przypadku tkanki, którą dzisiaj zademonstrowaliśmy, jest to usunięcie tkanki łącznej i usunięcie tłuszczu, który może zasłaniać pole.

Ważne jest również, aby przypiąć tkankę do płaskiego arkusza. Cóż, powodzenia w eksperymentach i dziękuję za oglądanie.