Name: Ogniskowe Ca2+ Przejściowe wykrywanie mięśni gładkich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 41 s
Description: Poznaj technikę obrazowania wapnia w mięśniach gładkich z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej. Metoda umożliwia analizę sygnałów wapniowych i badanie wpływu neuroprzekaźników na funkcję mięśni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wellcome Trust zapewniło wsparcie finansowe (nagroda VIP dla J.S.Y. oraz stypendium badawcze 074128 dla K.L.B.). R.J.A. otrzymał stypendium z Medical Research Council.
Leica_SP2_Stacker, algorytm używany do importu plików TIFF w celu ich „rekonstrukcji” w serie, opiera się na Leica_tiff_sequence, wtyczce do odczytu plików TIFF z systemu Leica SP2 w programie ImageJ, opracowanej przez Tony'ego Collinsa i używanej za jego zgodą.
(<a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a>)StackReg oraz TurboReg, algorytmy stosowane do korekcji przesunięć tkanki, opierają się na pracy Th venaza i współpracowników (1998)9.
Excel_writer.jar został napisany przez Kurta De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html).
JNCT0.08JoVE.ijm, algorytm detekcji cząstek, opiera się na algorytmie opracowanym przez K.L. Braina i opisanym wcześniej5.

Część 1: Przygotowanie wskaźnika Ca2+ (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM)
<ol>
<li>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM dostarczany jest w fiolkach o objętości 500 μl w postaci niewielkiej ilości proszku (50 μg). Do proszku należy dodać 40 μl roztworu Pluronic F-127, delikatnie wstrząsając przez 30 s, a następnie dodać 460 μl PSS i ponownie delikatnie wstrząsać przez 30 s. Otrzymany roztwór końcowy o stężeniu 10 μM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM pozwala na przygotowanie 4 alikwotów po 125 μl. Należy unikać ekspozycji na światło i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
Część 2: Obciążanie Ca2+
<ol>
<li>Wyjmij wskaźnik Ca2+ (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) z zamrażarki (-20 C) i pozostaw do rozmrożenia w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Odmij 1 ml PSS do probówki i umieść ją w łaźni wodnej. Napowietrzaj mieszaninę gazem 95% O2 / 5% CO2 z prędkością około 1 pęcherzyka na sekundę. Napowietrzacz musi być zabezpieczony w probówce, np. za pomocą korka lub Parafilmu.</li>
<li>Wypreparuj tkankę z organizmu i w szalce Petri wyłożonej Sylgardem ostrożnie usuń tkankę łączną. Niezależnie od rodzaju narządu mięśnia gładkiego, PSS należy wymieniać co 10 min, a tkankę należy dokładnie wypłukać (np. trzykrotnie wymieniając PSS) po wypreparowaniu. W przypadku przewodów nasiennych: można rozciąć narząd wzdłuż, aby uzyskać płat tkanki. W przypadku pęcherza moczowego: otwórz go wzdłuż od szyjki pęcherza (tylna część) do szczytu kopuły (przednia część). Przygotuj cztery paski o długości 6 – 8 mm i szerokości 1 – 2 mm wzdłuż powierzchni grzbietowej mięśnia detrusora, tnąc w kierunku dominujących pęczków mięśniowych.</li>
<li>Umieść wypreparowaną tkankę w „podgrzanym i napowietrzonym” PSS.</li>
<li>Dodaj 125 μl 10 μM Oregon Green 488 BAPTA-1 AM do probówki i lekko wstrząśnij ręcznie w celu wymieszania.</li>
<li>Wznów napowietrzanie i pozostaw próbkę przykrytą folią. Czas potrzebny do wystarczającego wchłonięcia wskaźnika Ca2+ przez tkankę różni się w zależności od jej wielkości i grubości warstwy mięśnia gładkiego. Na przykład: od 70 min (detrusor myszy, mięsień anococcygeus szczura) do 120 min (detrusor szczura, przewód nasienny myszy).</li>
</ol>
Część 3: Przygotowanie tkanki „obciążonej Ca2+” do mikroskopii
Dokładne przypięcie tkanki jest niezbędne, aby zminimalizować jej spontaniczne ruchy (cecha charakterystyczna dla obrazowania komórek mięśni gładkich z relatywnie nienaruszonej tkanki) oraz ułatwić zlokalizowanie odpowiedniego miejsca do obrazowania (ponieważ płaski fragment tkanki można badać w dwóch wymiarach, a nie w trzech).
<ol>
<li>Płucz tkankę w napowietrzonym PSS przez co najmniej 5 mins.</li>
<li>Zamocuj tkankę w naczyniu preparacyjnym wyłożonym Sylgardem, (lekko) rozciągając ją w celu utworzenia płaskiego płata. Unikaj stosowania długich „szpilek”, które mogłyby zarysować obiektyw; zamiast nich użyj krótkich odcinków srebrnego drutu o średnicy 25-50 μm jako „szpilek” i wbijaj je pod kątem.</li>
<li>Umieść naczynie preparacyjne na stoliku mikroskopu, dbając o to, aby PSS nie wypłynął poza obszar naczynia wyłożony Sylgardem (ponieważ mogłoby to doprowadzić do zalania dużej powierzchni PSS w momencie rozpoczęcia superfuzji).</li>
<li>Włącz pompę, aby rozpocząć superfuzję preparatu roztworem PSS. Często stosuje się przepływ rzędu 100 ml na godzinę.</li>
<li>Włącz jednostkę grzejną.</li>
<li>Umieść rurki dopływowe i odpływowe oraz sondę temperatury na naczyniu preparacyjnym (mocując każdą z nich do metalowej listwy za pomocą magnesu u podstawy). Wysokość końcówki rurki odpływowej będzie determinować poziom PSS. Upewnij się, że odpływ faktycznie usuwa PSS (ponieważ początkowo może tak nie być).</li>
<li>Ustaw temperaturę na jednostce grzejnej tak, aby osiągnąć pożądaną wartość, np. 33-35 °C.</li>
<li>Pozostaw tkankę do equilibracji przez co najmniej 10 mins.</li>
</ol>
Część 4: Wybór obszaru do obrazowania
Ekspozycja na oświetlenie wzbudzające spowoduje fotoblaknięcie wskaźnika, dlatego należy unikać jego stosowania przez więcej niż kilka sekund naraz.
<ol>
<li>Używając obiektywu o małym powiększeniu (10x lub 20x), zastosuj epifluorescencję z wzbudzeniem światłem niebieskim, aby zobrazować mięśnie gładkie i zidentyfikować odpowiedni obszar do monitorowania. Wybór miejsca powinien opierać się na: ruchu (który powinien być minimalny) oraz liczbie komórek mięśni gładkich w polu widzenia. Jasne „struktury” mogą powodować dużą liczbę „fałszywie dodatnich” wyników w algorytmie detekcji obrazu, dlatego należy unikać miejsc z dużą liczbą (np.) przemieszanych komórek nabłonkowych lub fibroblastów.</li>
<li>Przełącz na obiektyw o większym powiększeniu (40x).</li>
<li>Obróć stolik lub oś optyczną tak, aby komórka (lub komórki) mięśnia gładkiego znajdowały się w pozycji poziomej (tj. równolegle do osi szybkiego skanowania).</li>
</ol>
Część 5: Mikroskopia konfokalna
Szczegóły dotyczące „konfiguracji” mikroskopu konfokalnego są specyficzne dla każdego typu urządzenia, jednak kluczowymi kwestiami są: prędkość (do większości przejściowych zmian stężeń Ca2+ wymagane jest minimum 5 Hz), rozdzielczość oraz wielkość pola widzenia (oba te parametry są kompromisem w stosunku do prędkości). Część poniższego protokołu odnosi się konkretnie do pionowego mikroskopu konfokalnego Leica SP2. Typowy protokół obejmuje: serię 100 klatek, rejestrowanych z częstotliwością 5 Hz (256 x 256 pikseli; ok. 100 x 100 μm) lub 13,5 Hz (256 x 64 pikseli; ok. 100 x 25 μm). Głowica skanująca jest ustawiona na ruch dwukierunkowy (aby zmaksymalizować prędkość akwizycji) i rejestruje obraz z częstotliwością 1000 Hz na linię.
<ol>
<li>Zwęź otwór blendy (pinhole) do rozmiaru jednej „tarczy Airy’ego”.</li>
<li>Ustaw moc lasera (488 nm) w zakresie od 25 do 35% na AOTF; wartość ta stanowi kompromis między jasnością a fotobleachingiem. (Ten drugi jest szczególnie problematyczny podczas długich rejestracji).</li>
<li>Pozyskaj sześć serii na każdy obszar oraz od czterech do sześciu obszarów na jedną „serię badawczą”. Zwyczajowo dąży się do monitorowania tych samych sześciu obszarów przed podaniem leku (tj. „kontrola”) i po jego podaniu, choć znaczny fotobleaching może zmusić eksperymentatora do odejścia od tego schematu.</li>
<li>W obrazowaniu Ca2+ niezbędne jest przeprowadzenie „kontroli czasowej”.</li>
</ol>
Część 6: Przygotowanie do analizy
<ol>
<li>Pobierz i zainstaluj program Image J ze strony: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Pobierz wersję odpowiednią dla Twojej platformy, a następnie zaktualizuj program do najnowszej wersji, pobierając najnowszy plik imageJ.jar ze strony http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar i zastępując nim stary plik. Użytkownicy komputerów Apple Mac: jeśli program działa powoli, upewnij się, że korzystasz z najnowszej wersji maszyny wirtualnej Java (JVM) dostępnej w Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/).</li>
<li>Pobierz plik Excel_writer.jar ze strony: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html i zainstaluj go w katalogu Plugins [directory] > jar.</li>
<li>Skopiuj następujące pliki do katalogu Plugins: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Zainstaluj każdy z tych skryptów za pomocą funkcji Plugins [Menu] > Macros > Install… w programie ImageJ.</li>
<li>Używamy konfokalnego mikroskopu Leica SP2, którego oprogramowanie (Leica LCS) generuje każdą serię jako pojedynczy, wyświetlany w programie „film”, ale zapisuje ją jako poszczególne klatki. Aby zrekonstruować klatki w serie: (i) Upewnij się, że wszystkie klatki do rekonstrukcji znajdują się w jednym folderze (np. „DataFolder > Tiffs”). (ii) Wybierz Plugins [Menu] > Macros > Leica_SP2_Stacker. Wybierz katalog główny (np. „DataFolder”). Wybierz odpowiedni folder z listy rozwijanej (np. „Tiffs/”). Wybierz katalog wyjściowy lub utwórz nowy (np. „DataFolder > Stacks”). Skrypt zrekonstruuje następnie serie z poszczególnych klatek.</li>
</ol>
Część 7: Korekcja ruchu
Choć ruch obrazowanego miejsca można zminimalizować poprzez dokładne przypięcie i równomierne rozciągnięcie tkanki, niektóre organy mięśni gładkich wykazują skurcze spontaniczne, których nie można wyeliminować samym precyzyjnym przypięciem. W niniejszym materiale opisujemy zastosowanie ogólnodostępnego algorytmu, który wyrównuje lub dopasowuje klatki w obrębie serii.
<ol>
<li>Pobierz programy „StackReg” (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) oraz „TurboReg” (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/).</li>
<li>Zainstaluj każdy z nich w katalogu wtyczek, korzystając z opcji Plugins > Macros > Install…</li>
<li>Wczytaj stos obrazów do przetworzenia (File > Open…), a następnie przejdź do klatki, która wyraźnie pokazuje obszar zainteresowania. Pozostałe klatki zostaną wyrównane do tej klatki referencyjnej.</li>
<li>Wybierz Plugins > Stacks > StackReg. Przetestuj poszczególne rodzaje transformacji („Transformations”, tj. Translation, Rigid Body, Scaled Rotation, Affine), aby określić, która z nich jest najskuteczniejsza. (Więcej szczegółów: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)</li>
</ol>
Część 8: Algorytm detekcji cząstek
Dla każdego obrazowanego „miejsca” będą występować zmienne czynniki wpływające na detekcję przejściowych zmian stężenia Ca2+. Pomiar określonych właściwości każdego miejsca („parametry cząsteczkowe” – szczegóły poniżej) ułatwia proces detekcji. W związku z tym dla każdego miejsca oblicza się „próg dla wartości odjętej”, „próg dla stosunku” oraz „próg krawędzi komórki”.
<ol>
<li>Wtyczki [Menu] > Makra > Zainstaluj… i wybierz „JNCT0.08Release.ijm”.</li>
<li>Wtyczki [Menu] > Makra > załaduj stos (skrót: l). Wybierz serię i oblicz parametry cząsteczek:<ol style="list-style:none;">
<li>a. Próg dla wartości odjętej (= tło)</li>
</ol></li>
<li>Wybierz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) w miejscu, które uznajesz za „tło”.</li>
<li>Pomiar (skrót: m). Zanotuj średnią (MEAN).<ol style="list-style:none;">
<li>b. Obliczanie progu dla stosunku</li>
</ol></li>
<li>Wybierz prostokątny ROI wokół optycznie płaskiego obszaru komórki lub komórek.</li>
<li>Pomiar (skrót: m). Zanotuj średnią (MEAN) i odchylenie standardowe (STANDARD DEVIATION).</li>
<li>Powtórz tę czynność jeszcze dwa razy LUB narysuj trzy ramki jednocześnie, trzymając klawisz „shift”.</li>
<li>Oblicz i zanotuj próg dla stosunku = (1+SD/mean) x 32, uśredniając wartości z trzech powtórzeń / miejsc.<ol style="list-style:none">
<li>c. Próg krawędzi komórki</li>
</ol></li>
<li>Obraz > Stosy > Projekcja Z... Wybierz typ projekcji: „Average intensity” (Średnia intensywność).</li>
<li>Obraz > Dopasuj > Próg.</li>
<li>Wybierz tryb czarno-biały.</li>
<li>Zdefiniuj górny limit suwaka „under” i zanotuj odpowiadającą mu wartość (po prawej stronie suwaka). Liczone będą tylko zdarzenia występujące w obszarach czarnych.</li>
<li>Kliknij „reset”.</li>
<li>Analiza stosów (skrót: 2).</li>
<li>Na tym etapie wybierz tylko jedną serię, tzn. „pierwszy plik” i „ostatni plik” powinny być takie same.</li>
<li>Wprowadź wartości „progu dla wartości odjętej”, „progu dla stosunku” oraz „progu krawędzi komórki”. Pozostałe ustawienia pozostaw w wartościach domyślnych.</li>
<li>Algorytm wygeneruje okno z dwoma panelami, w którym po lewej stronie wyświetlana jest przetworzona seria, a po prawej oryginalna. Przejrzyj je uważnie, aby ocenić liczbę wyników fałszywie dodatnich oraz przypadki, w których zdarzenia widoczne gołym okiem nie zostały wykryte. Aby uzyskać dokładniejsze wykrywanie przejściowych stężeń Ca2+, może być konieczne niewielkie dostosowanie niektórych „parametrów cząsteczek”. Choć przy pierwszej próbie proces ten może wydawać się nieco przypadkowy, szybko nabiera się wyczucia, które parametry są kluczowe.</li>
<li>Dla każdej serii algorytm generuje plik Excel, w którym szczegółowo opisano charakterystykę wykrytego zdarzenia (taką jak amplituda, powierzchnia i pozycja). Wyniki „fałszywie dodatnie” – zidentyfikowane podczas przeglądania plików obrazów wygenerowanych przez algorytm (np. krok 8.17) – można ręcznie usunąć z tego pliku Excel.</li>
</ol>

<ol><li>Gregory, J. Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+fluorescent+probes+and+research+products%22">Handbook of fluorescent probes and research products</a>. , Molecular Probes. Eugene, Oregon. 771-826 (2002).</li>
<li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+force+and+Ca2%2B+in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li>
<li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li>
<li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+purinergic+Ca2%2B+transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li>
<li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2%2B+transients+in+mouse+vas+deferens%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li>
<li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharmacol.+Exp.+Ther%22%5BJournal%5D)">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li>
<li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li>
<li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li>
<li>Thévenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Image+Process%22%5BJournal%5D)">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li>
</ol>

Dołożono starań, aby zminimalizować liczbę wykorzystanych zwierząt oraz ich cierpienie; wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z brytyjską ustawą Animals (Scientific Procedures) Act 1986 oraz dyrektywą Rady Wspólnot Europejskich 86/09/EEC.

Wybór fluorescencyjnego wskaźnika Ca2+
Jako wskaźnik Ca2+ wybrano Oregon Green 488 BAPTA-1 AM, ponieważ (i) wykazuje on wysoką jasność w porównaniu z innymi wskaźnikami (np. Fluo-4 i Calcium Green)1; (ii) jest czuły na fizjologiczne zmiany stężenia Ca2+ z wartością Kd o zbliżonej wielkości1 do wewnątrzkomórkowego stężenia Ca2+ [Ca2+]i (np. w przewodach nasiennych2); (iii) wnika do wielu komórek mięśni gładkich, co umożliwia monitorowanie sprzężenia między tymi komórkami. Jednakże Oregon Green 488 BAPTA-1 AM jest wskaźnikiem Ca2+ niewymagającym pomiaru stosunkowego (non-ratioable), przez co nie może być łatwo wykorzystany do określenia bezwzględnego [Ca2+]i. Ponadto, w wysokich stężeniach może on pełnić rolę bufora Ca2+ oraz ulec nasyceniu przy zmianach [Ca2+]i o wysokiej amplitudzie.
Hamowanie kurczliwości spontanicznej
Spontaniczną kurczliwość organów z mięśni gładkich można zredukować farmakologicznie, na przykład poprzez blokowanie przepływu Ca2+ przez kanały Ca2+ typu L (np. za pomocą: nifedipinu3; diltiazemu4). Należy pamiętać, że leki te znacznie zmniejszą amplitudę błysków / przejściowych wzrostów stężenia Ca2+ w całej komórce.
Skurcz przewodów nasiennych wynika z połączenia przede wszystkim purinergicznej i noradrenergicznej neurotransmisji. Jednakże ogniskowe przejściowe wzrosty stężenia Ca2+ w tej tkance są niewrażliwe na blokadę receptorów noradrenergicznych (np. α1 adrenoreceptora za pomocą prazosyny5), zatem ruch może być ograniczony bez wpływu na ogniskowe przejściowe wzrosty stężenia Ca2+.
Alternatywnie skurcz można zapobiec „poniżej” (downstream) poprzez inhibicję kinazy lekkich łańcuchów miozyny, np. za pomocą wortmanniny6.
Wnioski
Monitorowanie fluorescencji Ca2+ w rozdzielczości submikronowej jest potężną techniką badania efektów pozasynaptycznych uwalniania neuroprzekaźników5,7 oraz uwalniania Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów (np. tzw. „iskier” 8). Analiza przejściowych zmian stężenia Ca2+ z wykorzystaniem opisanej tutaj metodologii jest bardziej efektywna kosztowo w porównaniu do komercyjnie dostępnych pakietów do analizy obrazu i umożliwia spersonalizowaną analizę dzięki niestandardowym wtyczkom Java dla programu ImageJ.

<table><tbody><tr><td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>10 x 50 &amp;#x03BC;g</td></tr><tr><td>Roztwór Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td>roztwór 20% w DMSO</td></tr><tr><td>Pionowy mikroskop konfokalny Leica SP2</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stół pneumatyczny (&amp;#8216;stanowisko pracy z izolacją wibracyjną&amp;rsquo;)</td><td>Newport Corp.</td><td>M-VW-3046-OPT-012140</td><td></td></tr><tr><td>Elastomer Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie ogniskowych przejściowych zmian stężenia ca2+ w mięśniach gładkich

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Obrazowanie Ca2+ w mięśniach gładkich pozwala na wgląd w mechanizmy komórkowe, które mogą nie prowadzić do zmian potencjału błony, takie jak uwalnianie Ca2+ z wewnątrzkomórkowych magazynów, oraz umożliwia jednoczesne monitorowanie wielu komórek w celu oceny, na przykład, sprzężenia w tkance syncytialnej. Podkomórkowe przejściowe wzrosty stężenia Ca2+ są powszechne w mięśniach gładkich, jednak ich dokładny pomiar jest trudny ze względu na problemy wynikające z ich stochastycznego występowania, często w szerokim polu widzenia, w narządzie podatnym na skurcze. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy serię protokołów obrazowania i rutyn analizy w celu automatycznego pozyskiwania i analizowania częstotliwości, lokalizacji oraz amplitudy takich zdarzeń. Choć podejście to można zastosować w innych kontekstach, nasza praca koncentruje się na detekcji lokalnych purinergicznych przejściowych wzrostów stężenia Ca2+ w celu lokalizacji uwalniania przekaźnika z rozdzielczością submikronową. 
ATP jest uwalniany jako kotransmiter z nerwów autonomicznych, gdzie wiąże się z receptorami P2X1 w mięśniach gładkich mięśnia detrusora i przewodu nasiennego. Jon Ca2+ wnika do mięśni gładkich, co prowadzi do powstania purynergicznych neuroefektorowych przejściowych zmian stężenia Ca2+ (NCTs). Ogniskowe zmiany stężenia Ca2+ umożliwiają optyczny monitoring uwalniania neuroprzekaźnika w sposób, który posiada wiele zalet w porównaniu z elektrofizjologią. Poza znacznie lepszą rozdzielczością przestrzenną, rejestracja optyczna daje dodatkową korzyść w postaci możliwości jednoczesnego rejestrowania uwalniania przekaźnika z wielu rozróżnialnych miejsc. Ponadto płaszczyznę ostrości optycznej łatwiej jest utrzymać lub skorygować podczas długich serii pomiarowych niż ponownie ustawić wewnątrzkomórkową ostrą mikroelektrodę. 
Podsumowując, przedstawiono metodę obrazowania fluorescencji Ca2+, w której szczegółowo opisano przygotowanie tkanki oraz pozyskiwanie i analizę danych. Opisujemy wykorzystanie kilku skryptów do analizy takich stanów przejściowych Ca2+.

Szczegółowe metody obrazowania Ca2+ o wysokiej rozdzielczości w mięśniach gładkich w obrębie izolowanych organów, obejmujące: przygotowanie tkanki, akwizycję obrazu oraz analizę danych.

Wykrywanie ogniskowych przejściowych zmian stężenia Ca2+ w mięśniach gładkich

Obrazowanie jonów Ca2+ w mięśni gładkiej pozwala na poznanie mechanizmów komórkowych, które mogą nie prowadzić do zmian potencjału błonowego, takich jak uwalnianie jonów Ca2+ ...

W pierwszej kolejności przygotowuje się roztwór do ładowania wapniem, który następnie podgrzewa się i napowietrza. Pęcherz moczowy zostaje wypreparowany, otwarty i rozpięty na płasko, a następnie wycina się pasek mięśnia detrusora. Pasek mięśnia detrusora przenosi się do roztworu do ładowania, inkubuje, płucze i rozpina na płasko.Poziom podstawowy wapnia w tkance jest wzbudzany światłem laserowym, a emitowane światło jest rejestrowane. Filmy składające się z pojedynczych klatek są analizowane poprzez porównywanie kolejnych klatek. Tło zostaje odjęte.Próg krawędzi komórki określa obszar, w którym mogą być wykrywane zdarzenia, a następnie obliczany jest stosunek między kolejnymi próbkami mózgu. Jeśli pozostałe zdarzenia spełniają zdefiniowane kryteria, zostają one wyróżnione i oznakowane. Dzień dobry, nazywam się John Young i reprezentuję laboratoria Keitha Braina oraz Toma Kinane z Katedry Farmakologii Uniwersytetu w Oxfordzie.Jestem Rob Amos, również z laboratoriów Braina i Canne, a ja nazywam się Keith Brain. Dzisiaj John i Rob zaprezentują Państwu technikę obrazowania wapnia w mięśniach gładkich. Stosujemy ją w naszym laboratorium do badania uwalniania neuroprzekaźników z nerwów autonomicznych oraz ich wpływu na mięśnie gładkie.Zacznijmy zatem. Wskaźnik wapnia organ green 488 BAFTA 1 AM dostarczany jest w fiolkach o pojemności 500 µL zawierających 50 µg proszku. Aby przygotować wskaźnik wapnia, należy dodać 40 µL roztworu Onic F1 27 do proszku i delikatnie wstrząsać przez 30 s, a następnie dodać 460 µL fizjologicznego roztworu soli PSS i ponownie delikatnie wstrząsać przez kolejne 30 s.Końcowy roztwór organ green 4 88 BAFTA o stężeniu 10 µM dostarcza cztery alikwoty po 125 µL każda. Należy unikać ekspozycji na światło i przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C przed przeprowadzeniem sekcji wybranego tkanek.Wyjmij wskaźnik wapnia z zamrażarki i rozmroź w temperaturze pokojowej, dopóki wskaźnik wapnia nie stanie się płynny. Umieść 1 mL PSS w probówce i w kąpieli wodnej o temperaturze 33 °C. Zamocuj napowietrzacz w probówce za pomocą korka lub można użyć rurki Perflex, a następnie napowietrzaj mieszaniną 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla z prędkością około jednego pęcherzyka na sekundę.Wypreparuj organ z mięśni gładkich z organizmu zwierzęcia. W tym przypadku jest to pęcherz moczowy myszy. Umieść organ w około 50 mililitrach PSS w celu jego przemycia; po dokładnym przemyciu tkanki ostrożnie usuń tkankę tłuszczową oraz tkankę łączną.Przeprowadź sekcję zgodnie z typem laurean dla mięśni gładkich pęcherza moczowego. Otwórz pęcherz wzdłużnie od szyjki pęcherza, przez koniec dystalny, aż do szczytu kopuły. W części kranialnej przygotuj cztery paski o długości 6–8 mm i szerokości 1–2 mm wzdłuż powierzchni grzbietowej, tnąc w kierunku dominujących pęczków mięśniowych.Umieść wypreparowaną tkankę oraz wstępnie ogrzany i napowietrzany PSS do załadowania wskaźnika wapnia, dodając do tkanki w probówce 125 µL 10 µM organ green 488B, a następnie delikatnie wstrząśnij probówką ręcznie, aby wymieszać składniki. Włóż probówkę z powrotem do łaźni wodnej. Wznów napowietrzanie i przykryj łaźnię wodną arkuszem folii.Czas potrzebny na wchłonięcie wskaźnika wapnia przez wystarczającą ilość tkanki różni się w zależności od wielkości tkanki oraz grubości warstwy mięśni gładkich. Na przykład w przypadku mięśnia detrusora myszy oraz oxs szczura czas ten wynosi 70 minut. Natomiast w przypadku mięśnia detrusora szczura i deens VAs myszy inkubację prowadzimy przez 120 minut.Po załadowaniu tkanki wskaźnikiem wapnia można ją przygotować do badania mikroskopowego. Najpierw płucz tkankę w napowietrzonym roztworze PSS przez 10 minut. Następnie umieść tkankę w naczyniu preparacyjnym wyłożonym osłoną S guard.Lekko rozciągnąć tkankę, aby utworzyła płaską warstwę. Przymocować tkankę za pomocą krótkich odcinków, na przykład dwumilimetrowych srebrnych drutów o średnicy od 25 do 50 µm, wbijając piny pod kątem.Należy unikać używania szpilek o długości przekraczającej kilka milimetrów, ponieważ mogą one porysować obiektyw. Staranne przypięcie tkanki jest istotne w celu zminimalizowania jej samoistnego kurczenia się oraz ułatwienia zlokalizowania odpowiedniego miejsca do obrazowania. Po przypięciu tkanki należy umieścić naczynie z preparatem na stoliku mikroskopu.Należy uważać, aby PSS nie wypłynął poza obszar szalki wyłożony osłoną silikonową, ponieważ może to doprowadzić do pokrycia PSS dużego obszaru. W celach demonstracyjnych, po rozpoczęciu superfuzji, następujące kroki zostaną wykonane w świetle.Należy pamiętać, że doświadczenia te są zazwyczaj przeprowadzane w ciemności. Włącz pompę, aby przeprowadzić superfuzję preparatu. W przypadku PSS często stosuje się szybkość 100 milliliters per hour.Włącz urządzenie grzewcze, a następnie umieść rurki dopływowe i odpływowe oraz sondę temperatury na naczyniu preparacyjnym, mocując każdą z nich do metalowego paska za pomocą magnesu znajdującego się u podstawy. Wysokość końcówki rurki odpływowej będzie determinować głębokość PSS. Należy zachować ostrożność i upewnić się, że odpływ rzeczywiście usuwa PSS, ponieważ czasami tak się nie dzieje.Wstępnie ustaw temperaturę na urządzeniu grzewczym tak, aby osiągnęła pożądaną wartość między 33 a 35 °C. Pozostaw tkankę do wyrównania temperatury przez co najmniej 10 minut, używając obiektywu o małej powiększeniu: 10x lub 20x.Należy użyć fluorescencji epifluorescencyjnej lub wzbudzenia światłem niebieskim, aby uwidocznić mięśnie gładkie i zidentyfikować odpowiedni obszar do monitorowania. Ponieważ ekspozycja na światło wzbudzające prowadzi do fotoblaknięcia wskaźnika, należy unikać jego stosowania przez więcej niż kilka sekund jednorazowo.Należy unikać obszarów z jasnymi strukturami, ponieważ mogą one powodować dużą liczbę wyników fałszywie dodatnich w algorytmie detekcji obrazu. Należy starać się wybrać miejsce z minimalną ruchliwością i dużą liczbą komórek mięśni gładkich w polu widzenia. Po wybraniu obszaru do obrazowania należy przełączyć na obiektyw o większym powiększeniu, np. 40 x.Obróć stolik lub oś optyczną tak, aby komórka lub komórki mięśni gładkich znajdowały się w pozycji poziomej, czyli równolegle do osi szybkiego skanowania. Komórki mięśni gładkich są teraz gotowe do obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej.W niniejszym protokole używamy odwróconego mikroskopu konfokalnego Leica SP dwa. Przymknij otwór pinhole do rozmiaru jednej plamki Airy'ego. Ustaw moc lasera w zakresie od 25 do 35% na regulowanym filtrze custo optic.Wartość ta stanowi kompromis pomiędzy jasnością a fotowybielaniem. Aby przygotować się do analizy danych, należy pobrać i zainstalować program ImageJ. Pobierz wersję odpowiednią dla danego systemu operacyjnego, a następnie zaktualizuj ją do najnowszej wersji, pobierając aktualny plik jar ImageJ i zastępując nim stary plik. Następnie pobierz plik jar programu Excel writer i zainstaluj go w katalogu plugins jar.Skopiuj te pliki do katalogu wtyczek. Zainstaluj każdy z tych skryptów za pomocą makr wtyczek. Zainstaluj funkcję programu ImageJ. Oprogramowanie do mikroskopu konfokalnego Leica SP2, z którego korzystamy, nazywa się Leica.LCS zapisuje poszczególne klatki każdej serii jako osobne pliki. Aby zrekonstruować serię, należy upewnić się, że wszystkie klatki przeznaczone do rekonstrukcji znajdują się w jednym folderze.Na przykład folder danych tiffs. Następnie z menu plugins macros wybierz makro Leica SP two stacker. Wybierz katalog główny, w tym przypadku folder danych.Wybierz odpowiedni folder z listy rozwijanej. W tym przypadku wybierz katalog wyjściowy dla plików tiff lub utwórz nowy. Na przykład folder data stacks.Następnie skrypt zrekonstruuje serie z poszczególnych klatek, aby skorygować przesunięcia wynikające z ruchu. Wykorzystujemy ogólnodostępny algorytm, który wyrównuje lub dopasowuje klatki w obrębie serii z pobranego stosu danych: rig oraz turbo reg. Skopiuj pliki każdego z nich do folderu stacks.Wczytaj stos obrazów do przetworzenia, a następnie przejdź do klatki, która wyraźnie pokazuje interesujący obszar. Pozostałe klatki zostaną wyrównane do tej klatki referencyjnej. Następnie przejdź do menu wtyczek (plugins), a następnie do sekcji stosów (stacks).Rejestracja stosu. Należy wypróbować każdą z różnych transformacji, aby określić, która jest najskuteczniejsza dla każdego miejsca. Czynniki obrazowania wpływające na detekcję przejściowych wzrostów poziomu wapnia będą się różnić w zależności od pomiaru określonych właściwości oraz parametrów cząstek w każdym miejscu.Czułość i swoistość detekcji zostają zwiększone. W związku z tym dla każdego miejsca obliczymy próg dla odjętego progu stosunku oraz próg krawędzi komórki. Aby rozpocząć, przejdź do plugins, macros, install i wybierz jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Następnie przejdź do plugins macros load stack.Wybierz serię i oblicz następujące parametry cząstek. Aby obliczyć próg dla odejmowania (subtracted), zaznacz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) w miejscu, które Twoim zdaniem stanowi tło pomiarowe. Zapisz średnią. Aby obliczyć próg dla stosunku (ratio), zaznacz prostokątny obszar zainteresowania wokół optycznie płaskiego obszaru komórki lub komórek mięśni gładkich.Zmierzyć i zapisać średnią oraz odchylenie standardowe. Powtórzyć ten proces jeszcze dwa razy lub narysować trzy ramki jednocześnie, przytrzymując klawisz shift. Obliczyć i zapisać wartość progową dla stosunku.Oblicz wartość jako odchylenie standardowe podzielone przez średnią plus jeden, a następnie pomnóż wynik przez 32. Przy uśrednianiu wartości z trzech powtórzeń mnożnik 32 jest niezbędny, aby uwzględnić algorytm obliczania stosunku, w którym brak zmian w stosunku do poprzedniej klatki jest mapowany na wartość całkowitą 32. Zapewnia to odpowiedni zakres dynamiczny do wykrywania wzrostów i spadków stosunku.W przypadku obrazu ośmiobitowego wybierz opcję Image Adjust Threshold. Wybierz tryb Black and White. Zdefiniuj górną granicę suwaka i zapisz odpowiadającą jej wartość.Znajduje się to po prawej stronie suwaka. Liczone będą tylko zdarzenia występujące w obszarach czarnych. Kliknij resetuj.Po obliczeniu progów odejmowania dla stosunku oraz progu krawędzi komórek, można przystąpić do analizy stosów obrazów. Należy określić lokalizację stosów przeznaczonych do analizy. Na tym etapie należy wybrać tylko jedną serię.Jest to pierwszy plik, a ostatni plik powinien być taki sam. Następnie wybierz lokalizację zapisu plików danych i stosów. Na przykład folder wyjściowy danych.Wprowadź wartości progu odejmowania, progu stosunku oraz progu krawędzi komórki. Pozostałe ustawienia pozostaw w wartościach domyślnych. Algorytm wygeneruje okno z dwoma panelami, w którym po lewej stronie wyświetlana będzie seria przetworzona, a po prawej oryginalna.Otwórz ten plik z folderu wyjściowego i dokładnie go przeanalizuj, aby ocenić liczbę wyników fałszywie dodatnich oraz przypadki, w których zdarzenia widoczne gołym okiem nie zostały wykryte. Dla każdej serii algorytm generuje plik Excel, który szczegółowo opisuje charakterystykę wykrytego zdarzenia, taką jak amplituda, pole i pozycja; wyniki fałszywie dodatnie zidentyfikowane podczas przeglądania plików obrazów wygenerowanych przez algorytm można ręcznie usunąć z tego pliku Excel. Należy jednak stosować w tym celu rygorystyczne kryteria.Jest to film przedstawiający przejściowe zmiany stężenia wapnia w mięśniach gładkich. W tym przykładzie film składa się ze 100 pojedynczych klatek zarejestrowanych z częstotliwością 5 Hz. Podczas badania, na przykład, wpływu konkretnego leku na częstotliwość przejściowych zmian stężenia wapnia, rejestrowalibyśmy wiele takich filmów w ramach jednego eksperymentu.Widzimy tutaj liczne spontaniczne przejściowe wzrosty stężenia wapnia w komórkach mięśni gładkich. Przedstawiono tutaj wynik działania algorytmu detekcji cząstek. Dla każdej serii algorytm generuje plik Excel, który szczegółowo opisuje charakterystykę wykrytego zdarzenia, taką jak amplituda, pole powierzchni i pozycja.Zaprezentowaliśmy metodę obrazowania przejściowych zmian stężenia wapnia w narządach zbudowanych z mięśni gładkich, takich jak pęcherz moczowy, a także sposób analizy tych sygnałów wapniowych przy użyciu algorytmu opracowanego w naszym laboratorium. Kluczowym elementem jest staranne przygotowanie tkanki do obrazowania wapnia. W przypadku tkanki zaprezentowanej dzisiaj polega to na usunięciu tkanki łącznej oraz wszelkich złogów tłuszczu, które mogłyby przesłonić pole widzenia.Ważne jest również, aby przypiąć tkankę w płaską warstwę. Życzymy powodzenia w eksperymentach i dziękujemy za oglądanie.

focal-ca2-transient-detection-in-smooth-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykrywanie przejściowych zmian stężenia wapnia w komórkach mięśni gładkich

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

Przedstawiamy metodę izolacji szybkich (mikrosekundowych) zdarzeń wapniowych od wolniejszych przepływów w żywych komórkach z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii skanującej. Metoda ta mierzy fluktuacje intensywności fluorescencji wskaźników wapnia poprzez rejestrację skanów liniowych obejmujących kilkaset pikseli w komórce. Analiza histogramowa pozwala na wyizolowanie skal czasowych różnych przepływów wapnia.

Pomiar szybkich przepływów jonów wapnia w kardiomiocytach

Funkcja komórek naczyniowych zależy od aktywności przekaźników wewnątrzkomórkowych.  Opisana jest metoda obrazowania dwufotonowego ex vivo, która umożliwia pomiar wewnątrzkomórkowych poziomów wapnia i tlenku azotu w odpowiedzi na bodźce fizjologiczne i farmakologiczne w poszczególnych komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty.

Obrazowanie dwufotonowe wewnątrzkomórkowego obchodzenia się z Ca2+ i produkcji tlenku azotu w komórkach śródbłonka i mięśni gładkich izolowanej aorty szczurzej

Obecnie, większość dostępnych wskaźników wapnia jest używana do ilościowego określania cytoplazmatycznych stanów przejściowych wapnia jako pośrednich miar wapnia uwalnianego z retikulum sarkoplazmatycznego w hodowanych komórkach mięśni gładkich. Protokół ten opisuje użycie specyficznego wskaźnika opartego na FRET, który umożliwia bezpośredni pomiar sygnałów wapniowych w świetle retikulum sarkoplazmatycznego.

Pomiar wahań stężenia wapnia w siateczce sarkoplazmatycznej hodowanych komórek mięśni gładkich za pomocą obrazowania konfokalnego opartego na FRET

Ten artykuł opisuje protokół, który ocenia zmiany wrażliwości miofilamentu Ca2+ podczas skurczu w izolowanych miocytach serca szczura. Wraz z elektrofizjologią serca, skurczowymi/rozkurczowymi poziomami cytozolu Ca2+ i skurczem/rozluźnieniem, pomiar ten jest niezbędny do wzmocnienia mechanizmów pośredniczących w sprzężeniu pobudzenia-skurczu serca w zdrowych i chorych sercach.

Ocena wrażliwości miofilamentu ca2+ leżącej u podstaw sprzężenia wzbudzenia-skurczu serca

Tutaj prezentujemy protokół obrazowania sygnalizacji wapniowej w populacjach poszczególnych typów komórek w mysim złączu nerwowo-mięśniowym.

Ex vivo Obrazowanie specyficznej dla komórki sygnalizacji wapniowej w trójdzielnej synapsie przepony myszy

Ten protokół przedstawia zbiór sarkomerów, wapnia i makroskopowych danych geometrycznych z aktywnie kurczącego się trabecula serca ex vivo. Te równoczesne pomiary są możliwe dzięki integracji trzech modalności obrazowania.

Jednoczesne obrazowanie w jasnym polu, fluorescencji i optycznej koherentnej tomografii kurczących się beleczków serca ex vivo

Protokół opisuje metodę ładowania fluorescencyjnego barwnika wapniowego przez przecięty nerw do zakończeń nerwu ruchowego myszy. Ponadto przedstawiono unikalną metodę rejestracji szybkich stanów przejściowych wapnia w zakończeniach nerwów obwodowych za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Rejestracja stanów przejściowych wapnia w mysim połączeniu nerwowo-mięśniowym z wysoką rozdzielczością czasową przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Obecny protokół opisuje przygotowanie i wykorzystanie precyzyjnie wyciętych plastrów płuc myszy do oceny kurczliwości dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic wewnątrzpłucnych w środowisku prawie in vivo.

Wykorzystanie precyzyjnie wyciętego wycinka płuc do badania regulacji skurczowej dróg oddechowych i mięśni gładkich tętnic śródpłucnych

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce to metoda badania ruchów domen białek w czasie rzeczywistym. Modyfikacja tej techniki pod kątem jej zastosowania w komórkach natywnych umożliwia teraz wykrywanie i śledzenie ruchów pojedynczego czujnika napięcia z bramkowanych napięciem kanałów Ca2+ w mysich izolowanych włóknach mięśni szkieletowych.

Funkcjonalna fluorometria ukierunkowana na miejsce w komórkach natywnych w celu zbadania pobudliwości mięśni szkieletowych

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Poznaj technikę obrazowania wapnia w mięśniach gładkich z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej. Metoda umożliwia analizę sygnałów wapniowych i badanie wpływu neuroprzekaźników na funkcję mięśni.

Wykrywanie ogniskowych przejściowych zmian stężenia Ca²⁺ w mięśniach gładkich

Przeglądaj więcej filmów