Name: Przeszczep soczewki u danio pręgowanego i jego zastosowanie w analizie mutantów oka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Poznaj technikę przeszczepu soczewki u danio pręgowanego do badania rozwoju oka i interakcji tkanek. Metoda ta pozwala określić, czy mutacje wpływają na soczewkę autonomicznie czy nieautonomicznie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza procedura w dużej mierze opiera się na technice transplantacji dla ryb jaskiniowych opracowanej przez laboratorium Billa Jeffreya.

Część 1: Przygotowanie embrionów
W niniejszym protokole będziemy używać symbolu jjxy do oznaczenia hipotetycznego mutanta soczewki danio pręgowanego.
<ol>
<li>Szczepy danio pręgowanego utrzymuje się w standardowych warunkach w pracowni ryb w temperaturze 28.5 °C w cyklu 14h światła / 10h ciemności.</li>
<li>Wieczorem umieszcza się samce i samice szczepu danio pręgowanego jjxy:AB/TU; tg(mGFP) w zbiorniku z przegrodą oddzielającą obie płcie. Potomstwo z tego krzyżowania będzie wykazywać ekspresję transgenu GFP we wszystkich tkankach i zostanie wykorzystane jako dawcy. Równolegle stosuje się tę samą procedurę w celu przygotowania krzyżowań między nietransgenicznymi zwierzętami typu dzikiego. W zależności od celu eksperymentu, jako dawców lub biorców można wykorzystać zwierzęta typu dzikiego w locus jjxy.</li>
<li>W ciągu godziny od zapalenia światła rano należy usunąć przegrody, aby umożliwić rybom rozród.</li>
<li>Po 15-30 minutach zbiera się zarodki do szalek Petriego o wymiarach 100 x 15 mm, oczyszcza je i wymienia medium (wodę do jaj).</li>
<li>Zarodki przechowuje się w inkubatorze w temperaturze 28.5 °C do wyznaczonego czasu.</li>
<li>Przed rozpoczęciem transplantacji należy ręcznie usunąć chorion za pomocą dwóch par ostrych pęset, a następnie inkubować zarodki w 0.2% EDTA w bezwapniowym medium ZFR przez 30 minut.</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie igieł do sekcji
<ol>
<li>Procedura transplantacji wymaga dwóch rodzajów igieł: ostrej, służącej do nacinania tkanek wokół soczewki, usuwania chorionu oraz uwalniania embrionów z agarozy, oraz tępej, służącej do przesuwania soczewki dawcy i wprowadzania jej do biorcy. W tej części pokażemy, jak wykonać te igły.</li>
<li>W pierwszej kolejności należy odciąć końcówkę pipety Pasteura za pomocą noża diamentowego. Następnie do końcówki pipety Pasteura należy wsunąć kapilarę szklaną w taki sposób, aby około połowa jej długości znajdowała się wewnątrz. Ułatwi to unieruchomienie drutu wolframowego poprzez jego stopienie ze szkłem w kolejnym kroku.</li>
<li>Następnie do otwartego końca kapilary należy wsunąć cienki drut wolframowy. Szkło nad drutem należy stopić przy użyciu palnika Bunsena. Przytrzymując pęsetą szklany koniec z metalowym drutem, należy dłonią skręcać drugi koniec igły. Zmiękczone szkło powinno owinąć się wokół metalu, mocując go w miejscu.</li>
<li>Jeśli wykonujemy igłę o tępym czubku, procedura dobiega końca. Aby stworzyć igłę ostrą, należy trzymać drut wolframowy nad palnikiem Bunsena przez 1-1,5 minuty, wypalając metal, aż powstanie bardzo cienka końcówka. Jakość czubka należy sprawdzić pod mikroskopem. Zaleca się sterylizację obu igieł w płomieniu przez kilka sekund bezpośrednio przed transplantacją.</li>
</ol>
Część 3: Przygotowanie odczynników
<ol>
<li>Roztwory Ringer’a dla danio pręgowanego (ZFR) bez zawartości wapnia (116 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 5 mM HEPES, pH 7.2)</li>
<li>0.2% EDTA w roztworach Ringer’a dla danio pręgowanego bez zawartości wapnia (pH 7.2)</li>
<li>1.2% agarozy (niskotopliwej) w bezwapniowym ZFR</li>
<li>0.2% agarozy (niskotopliwej) w bezwapniowym ZFR</li>
<li>Pożywka dla embrionów (pH 7.0, na litr zawiera: 10 ml Hanks Solution #1, 1ml Hanks Solution #2, 10ml Hanks Solution #4, 10ml Hanks Solution #5, 0.35 g wodorowęglanu sodu, 300 uL 2M HCl, penicylina-streptomycyna 500,000U) Zgodnie z The Zebrafish Book (University of Oregon Press, 2000).</li>
<li>Drut wolframowy, pozłacany, średnica 0.1mm, Alfa Aesar</li>
<li>Kapilara, średnica 1.0mm, World Precision Instruments</li>
</ol>
Część 4: Procedura transplantacji
<ol>
<li>W plastikowej probówce wiriówkowej przygotuj 1,2% niskotopliwą agarozy w bezwapniowym ZFR, podgrzanym do 40 C w kąpieli wodnej.</li>
<li>W wybranym stadium (np. 30 hpf), pobierz embriony pipetą Pasteura, powoli przenieś je do probówki wiriówkowej i inkubuj przez około 5 sekund. Dawcy i biorcy powinni być inkubowani oddzielnie.</li>
<li>Za pomocą pipety pobierz embriony w 1,2% agarozy z probówki wiriówkowej i ułóż je w dwóch równoległych rzędach w 100mm polistyrenowej płytce Petriego, oddzielając biorców od dawców. Dzięki powolnemu i ostrożnemu wypuszczaniu, większość embrionów ułoży się na boku w agarozie. Te, które nie znajdą się w tej pozycji, należy zorientować za pomocą tępej igły tak, aby oko było skierowane do góry, zanim agarosa stężeje.</li>
<li>Odczekaj, aż 1,2% agarosa stężeje, a następnie przykryj ją 0,2% roztworem niskotopliwej agarozy.</li>
<li>Używając zaostrzonej igły, usuń agarozę wokół oczu i bardzo ostrożnie wycięcie soczewkę z embrionów biorcy i dawcy, wykonując krótkie ruchy. Upewnij się, że cięcie przebiega wystarczająco blisko soczewki, aby jej nie przerwać, ale jednocześnie nie usuwać zbyt wiele tkanki z reszty oka biorcy.</li>
<li>Po uwolnieniu soczewki będą unosić się w medium. Za pomocą tępej igły ostrożnie przesuń soczewkę dawcy dokładnie nad miejsce, w którym normalnie znajduje się soczewka biorcy, a następnie wciśnij ją do wnętrza oka. Soczewka biorcy może zostać usunięta.</li>
<li>Pozostaw embriony dawcy i biorcy w 1,2% agarozie przez 30-60 minut, następnie uwolnij je z agarozy za pomocą ostrej igły i przenieś do płytki 24-dołkowej z medium dla embrionów. Każdy embrion powinien znajdować się w osobnym dołku. Prawidłowo oznakuj dołki, aby było jasne, który biorca odpowiada któremu dawcy.</li>
<li>Inkubuj w temperaturze 28,5 C. Soczewkę pochodzącą od dawcy można odróżnić od soczewki biorcy po nieoperowanej stronie tego samego zwierzęcia na podstawie fluorescencji GFP. Można również wykonać przekroje w celu pomiaru wielkości soczewki i ustalenia, czy różnicuje się ona prawidłowo.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1258/1258fig1.jpg" alt="Schemat szklanej rurki kapilarnej, układ do chromatografii, punkty A, B, C, ilustrujące proces." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 1"> Ryc. 1 Obraz przy niskim powiększeniu zaostrzonej igły używanej do przeszczepiania soczewki. Szklana kapilara (B) jest wkładana do pipety Pasteura (A), a cienki drut wolframowy (C) jest wprowadzany do otwartego końca kapilary. Szkło nad drutem jest zmiękczane za pomocą palnika Bunsena. Używając pincety, należy stabilnie trzymać szklany koniec z metalowym drutem, jednocześnie skręcając ręką drugi koniec pipety Pasteura. Zmiękczone szkło powinno owinąć się spiralnie wokół metalu, mocno go chwytając.
 <img src="/files/ftp_upload/1258/fig2%201258.png" alt="Obraz mikroskopowy końcówki sondy światłowodowej, używanej do badań wzbudzenia i emisji optycznej." width="600" height="204" data-altupdatedat="1787630408000"> Rys. 2 Końcówki dwóch rodzajów igieł stosowanych do transplantacji soczewki.
 <img src="/files/ftp_upload/1258/1258fig3.jpg" alt="Porównanie fluorescencji po przeszczepie oka w świetle widzialnym i UV; analiza wyników eksperymentu." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 3"> Rys. 3 Zarodki poddano transplantacji soczewki w 30hpf. Przedstawiono zarodek dawcy (A, B), oko biorcy z przeszczepioną soczewką (C, D) oraz stronę kontrolną zarodka biorcy (E, F). Każde oko pokazano w świetle przechodzącym oraz w oświetleniu UV, zgodnie z oznaczeniem. Zdjęcia wykonano w 48 hpf. W tym eksperymencie wykorzystano linię transgeniczną Q01[9].

<ol><li>Thut, C. J., Rountree, R. B., Hwa, M., Kingsley, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+in+situ+screen+provides+molecular+evidence+for+the+induction+of+eye+anterior+segment+structures+by+the+developing+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A large-scale in situ screen provides molecular evidence for the induction of eye anterior segment structures by the developing lens.</a> Dev Biol. 231, 63-76 (2001).</li>
<li>Yamamoto, Y., Jeffery, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+the+lens+in+cave+fish+eye+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Central role for the lens in cave fish eye degeneration.</a> Science. 289, 631-633 (2000).</li>
<li>Easter, S. S., Nicola, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+development+of+vision+in+the+zebrafish%28Danio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The development of vision in the zebrafish(Danio rerio).</a> Dev Biol. 180, 646-663 (1996).</li>
<li>Schmitt, E., Dowling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+eye+morphogenesis+in+the+zebrafish.+Brachydanio+rerio%5BTitle%5D)+AND+%22J.comp.+Neuro%22%5BJournal%5D)">Early eye morphogenesis in the zebrafish. Brachydanio rerio.</a> J.comp. Neuro. 344 (4), 532-542 (1994).</li>
<li>Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+power+of+forward+genetics--analysis+of+neuronal+diversity+and+patterning+in+the+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Harnessing the power of forward genetics--analysis of neuronal diversity and patterning in the zebrafish retina.</a> Trends Neurosci. 23 (11), 531-541 (2000).</li>
<li>Malicki, J., Pujic, Z., Thisse, C., Thisse, B., Wei, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forward+and+reverse+genetic+approaches+to+the+analysis+of+eye+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Forward and reverse genetic approaches to the analysis of eye development in zebrafish.</a> Vision Res. 42 (4), 527-533 (2002).</li>
<li>Avanesov, A., Malicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Approaches+to+study+neurogenesis+in+the+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Approaches to study neurogenesis in the zebrafish retina.</a> Methods Cell Biol. 76, 333-384 (2004).</li>
<li>Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mutagenesis+yields+eye+morphological+mutants+with+retinal+and+lens+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mutagenesis yields eye morphological mutants with retinal and lens defects.</a> Vision Res. 42, 535-540 (2002).</li>
<li>Godinho, L., Mumm, J. S., Williams, P. R., Schroeter, E. H., Koerber, A., Park, S. W., Leach, S. D., Wong, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. Nov 132, 5069-5079 (2005).</li>
</ol>

Kilka etapów wymaga szczególnej uwagi podczas transplantacji soczewki.
<ol>
<li>Zaostrzone igły: Przed przeprowadzeniem transplantacji soczewki lepiej przygotować kilka igieł, a ich końcówki powinny być jak najcieńsze. Grubsza igła, ze względu na większą średnicę, przerwie więcej tkanek, co może uniemożliwić gojenie się oka.</li>
<li>Ułożenie embrionów: Bezpośrednio przed transplantacją należy ułożyć embriony na boku. Podczas pozycjonowania 1,2% agaroza może bardzo szybko stężeć. Aby spowolnić twardnienie agarozy, m...

<table><tbody><tr><td>drut wolframowy o średnicy 0,1mm</td><td>A Johnson Matthey</td><td>45086</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza (niskotopna)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39346</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary z borokrzemianowego szkła</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW 100-4</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>Dumont</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Pompa do pipety</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-683C</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego</td><td>Cardinal Health</td><td>D1906</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr></tbody></table>

transplantacja soczewki u rybek zebrafish i jej zastosowanie w analizie mutantów oka

Lens Transplantation in Zebrafish and its Application in the Analysis of Eye Mutants

Soczewka odgrywa istotną rolę w rozwoju pucharu optycznego[1,2]. Wykorzystując danio pręgowanego jako organizm modelowy, można analizować pytania dotyczące rozwoju soczewki. Danio pręgowany jest użyteczny w badaniach genetycznych dzięki kilku korzystnym cechom, takim jak niewielki rozmiar, wysoka płodność, krótki cykl życiowy i łatwość hodowli. Rozwój soczewki u danio pręgowanego przebiega szybko. Do 72 hpf soczewka danio pręgowanego jest funkcjonalnie dojrzała [3]. Dostępne są liczne zasoby genetyczne i molekularne wspierające badania na tym gatunku. Ponadto podobieństwo oka danio pręgowanego do oczu innych kręgowców stanowi podstawę do jego wykorzystania jako doskonałego modelu zwierzęcego dla ludzkich wad[4-7]. Kilka mutantów danio pręgowanego wykazuje nieprawidłowości soczewki, w tym wysoki poziom śmierci komórkowej, co w niektórych przypadkach prowadzi do całkowitej degeneracji tkanek soczewki [8]. Aby ustalić, czy nieprawidłowości soczewki wynikają z przyczyn wewnętrznych czy z wadliwych interakcji z otaczającymi tkankami, przeprowadza się transplantację soczewki mutanty do oka typu dzikiego. Przy użyciu wypolerowanych ogniowo igieł metalowych soczewki mutanty lub typu dzikiego są ostrożnie wycinane z organizmu dawcy, a następnie przenoszone do biorcy. W celu rozróżnienia tkanek typu dzikiego i mutantów jako dawca wykorzystywany jest szczep transgeniczny. Linia ta wykazuje ekspresję GFP związanego z błoną w all tkankach, w tym w soczewce. Ta technika transplantacji jest niezbędnym narzędziem w badaniach mutantów soczewki u danio przebrondego.

Rozwój soczewki wiąże się z interakcjami z innymi tkankami. Kilka mutantów oka u danio pręgowanego charakteryzuje się nienaturalnie małym rozmiarem soczewki. W niniejszym opracowaniu prezentujemy eksperyment z transplantacji soczewki, mający na celu ustalenie, czy fenotyp ten wynika z przyczyn wewnętrznych, czy z wadliwych interakcji z tkankami otaczającymi soczewkę.

Transplantacja soczewki u rybek zebrafish i jej zastosowanie w analizie mutantów oka

Soczewka odgrywa istotną rolę w rozwoju pucharu optycznego[1,2]. Wykorzystując danio pręgowanego jako organizm modelowy, pytania dotyczące rozwoju soczewki...

Aby rozpocząć transplantację soczewki u danio pręgowanych, donory transgeniczne wykazujące ekspresję GFP oraz biorców z dzikiego typu inkubuje się najpierw przez 30 minut w osobnych szalkach Petriego zawierających roztwór Ringera dla danio pręgowanych pozbawiony wapnia. Następnie larwy ryb osadza się w dwóch równoległych liniach w niskotopliwym agarozie. Jedna linia (A) jest przeznaczona dla donorów, a druga (B) dla biorców. W przypadku biorców usuwa się całe oko donora, podczas gdy z biorcy usuwa się jedynie soczewkę.Tkanki otaczające soczewkę dawcy są usuwane przed umieszczeniem soczewki w oku biorcy. Po transplantacji ryby są przechowywane w opisanych płytkach 24-dołkowych. Przeszczepiona soczewka powinna wykazywać fluorescencję GFP u biorcy.Oczywiście, oko przeciwległe gospodarza nie zostało poddane operacji i nie wykazuje ekspresji GFP. Cześć, jestem Yj. A ja jestem Kaya McCullough i pochodzimy z laboratorium dr Yma Maki z Katedry Okulistyki na Harvard Medical School. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę transplantacji soczewki u dzikiego typu rybek zebrafish Daniel Rio.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do transplantacji soczewek od zwierząt typu dzikiego do mutantów i odwrotnie. Pozwala nam to określić, czy geny mutantów działają w soczewce autonomicznie czy nieautonomicznie. Zacznijmy zatem.Linie danio prążkowanego są utrzymywane w standardowych warunkach w zapleczu dla ryb, w temperaturze 28.5 °C, przy 14-godzinnym cyklu światła i 10-godzinnym cyklu ciemności. Wieczorem przed planowanym eksperymentem umieszcza się samce i samice w zbiorniku z przegrodą, aby je od siebie oddzielić. Genotyp tych ryb powinien zapewniać potomstwo z ekspresją GFP oraz każdą interesującą mutacją. Równolegle zastosuj tę samą procedurę w celu przygotowania krzyżówek między nietransgenicznymi zwierzętami typu dzikiego w ciągu jednej godziny.Po zapaleniu światła rano wyjmij przegrody, aby umożliwić rybom rozmnażanie. Po 15 do 30 minutach przelej wodę z akwarium przez sito, aby zebrać embriony, a następnie wypłucz je strumieniem wody do jaj z butelki myjącej do szalki Petriego o wymiarach 100 na 15 milimetrów. Następnie oczyść jaja, odpipetowując niezapłodnione embriony oraz wszelkie zanieczyszczenia.Wymień zużytą wodę z jaj z nową wodą z jaj. Embriony można przechowywać w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C przed transplantacją soczewki. Gdy będziesz gotowy do przeprowadzenia transplantacji, przygotuj embriony, usuwając ręcznie chorion.Za pomocą metalowej sondy i pęsety embriony z usuniętą otoczką należy teraz inkubować w 0,2% EDTA w bezwapniowym medium ZFR przez 30 minut. Podczas inkubacji można przygotować igły niezbędne do sekcji. Procedura transplantacji wymaga zaostrzonej igły do przecięcia tkanek otaczających soczewkę oraz wyjęcia embrionów z agaru.Wymagana jest również tępa igła do przesuwania soczewki dawcy i wprowadzania jej do biorcy; każdą z igieł przygotowuje się poprzez odcięcie końcówki pipety Pasteura za pomocą noża diamentowego. Następnie do końcówki pipety Pasteura wprowadza się kapilarę szklaną tak, aby około połowy jej długości znajdowała się wewnątrz. Za pomocą płomienia ostrożnie wprowadza się cienki drucik wolframowy do otwartego końca kapilary.Roztopić szkło nad drutem; za pomocą pęsety stabilnie przytrzymać koniec szklany drutem metalowym, jednocześnie obracając drugi koniec igły. Zmiękczone szkło powinno owinąć się spiralnie wokół metalu, mocno go chwytając. W ten sposób z igły tępej powstaje igła ostra.Trzymaj drucik wolframowy nad płomieniem przez 1 do 1,5 minuty, wypalając metal, aż utworzy się bardzo cienka końcówka. Sprawdź jakość końcówki pod mikroskopem.Odpowiednia końcówka nie powinna być wygięta ani zakrzywiona i powinna płynnie zwężać się do ostrego punktu o średnicy nie większej niż 50 micrometers. Sterylizuj obie igły w płomieniu przez kilka sekund i pozwól im ostygnąć przed rozpoczęciem procedury w plastikowej probówce do wirowania; przygotuj 1,2% low melting point aros oraz wolny od wapnia ZFR podgrzany do 40 degree C w kąpieli wodnej. Na odpowiednim etapie pobierz embriony dawcy do pipety Pasteura i powoli przenieś je do probówki do wirowania zawierającej aros. Inkubuj jaja w aros przez około pięć sekund.Przenieś zarodki za pomocą pipety i ułóż je w rzędzie na 100 mm polistyrenowej płytce Petriego, pipetując powoli i ostrożnie; większość zarodków będzie leżeć na boku z okiem skierowanym do góry. Powtórz ten proces z jajami gospodarza i ułóż je w rzędzie równolegle do jaj dawcy, zanim agar zastygnie. Użyj tępej igły, aby obrócić wszystkie nieprawidłowo zorientowane zarodki tak, aby po zastygnięciu agaru oko było skierowane do góry.Przykryj go 0,2% roztworem agarosy o niskiej temperaturze topnienia. Używając ostrej igły, usuń nadmiar agarosy wokół oczu i bardzo ostrożnie wytnij całe oko dawcy, które będzie pływać. Następnie wyjmij soczewkę z oka.Wykonuje się to, przeciągając igłę przez tkankę oka od dołu do góry. Dotyczy to tylko osobnika gospodarza. Soczewkę wycina się, wykonując krótkie ruchy zaostrzoną igłą, tnąc jak najbliżej soczewki, aby jej nie przerwać.Należy unikać usuwania zbyt dużej ilości tkanki z pozostałej części oka biorcy. Po uwolnieniu soczewki będą unosić się w medium. Za pomocą tępej igły ostrożnie przesuń soczewkę dawcy tuż nad miejsce położenia soczewki biorcy, a następnie dociśnij ją do właściwej pozycji za pomocą tępej igły.Soczewkę gospodarza można odrzucić. Pozostawić embriony dawcy i gospodarza w 1,2% Aros przez 30 do 60 minut. Pożywka dla embrionów wspomaga gojenie ran.Następnie należy uwolnić je z agros, używając zaostrzonej metalowej igły. Przenieś embriony do płytki 24-dołkowej z pożywką dla embrionów. Każdy embrion powinien znajdować się w osobnym dołku.Należy odpowiednio oznakować dołki, aby po zakończeniu transferu soczewek było jasne, który gospodarz odpowiada któremu dawcy. Pozostawić embriony do rozwoju w temperaturze 28.5 °C do wyznaczonego czasu. W celu obserwacji fenotypowej zazwyczaj badamy różnicowanie soczewek w ciągu jednego do dwóch dni.Soczewka pochodząca od donora powinna zachować ekspresję GFP po przeszczepieniu do oka biorcy. Jeśli fenotyp mutanty nie zostanie odratowany w środowisku typu dzikiego, wskazuje to, że fenotyp jest autonomiczny. Natomiast jeśli zostanie odratowany, uznaje się, że fenotyp jest nieautonomiczny.Ma to istotne znaczenie dla funkcji leżącego u podstaw genu. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzenia przeszczepu soczewki w zarodku rybki danio. Podczas wykonywania tej procedury należy zachować szczególną ostrożność podczas formowania igieł oraz podczas samego wycinania soczewki.Ponadto, po zakończeniu transplantacji należy szybko ustawić zarodki, zanim dojdzie do przetoczenia jajeczka. Nie zapomnij dodać medium do zarodków do ośmiu do dołka inkubacyjnego. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

lens-transplantation-zebrafish-its-application-analysis-eye

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przeszczepianie soczewek u rybki zwojowej i jego zastosowanie w analizie mutantów oka

Prezentujemy protokół generowania chimerycznych embrionów rybek danio w celu obrazowania na żywo zachowania komórek podczas embriogenezy.

Transplantacja blastomerów wykazujących ekspresję GFP w celu obrazowania na żywo rozwoju siatkówki i mózgu w chimerycznych embrionach danio pręgowanego

Niniejszy artykuł opisuje metodę mikrodyssekcji siatkówek zebrafish (danio pręgowanego) z dołączonym lub usuniętym nabłonkiem barwnikowym siatkówki, z embrionów od jednego do trzech dni po zapłodnieniu.

Mikrodysekcja tkanek embrionalnego oka rybki zebrafish

Ten film opisuje protokół, który został opracowany do analizy soczewek dorosłych i larw danio pręgowanego w celu analizy morfologii soczewki korowej i integralności strukturalnej szwów soczewki.

Rozwarstwienie soczewki oka: technika obserwacji morfologii soczewki danio pręgowanego

Mikroskopia fluorescencyjna z lekkim arkuszem jest doskonałym narzędziem do obrazowania rozwoju embrionalnego. Pozwala na nagrywanie długich filmów poklatkowych żywych zarodków w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Demonstrujemy jego zastosowanie do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego w szerokich skalach czasoprzestrzennych i przedstawiamy potok do fuzji i dekonwolucji zestawów danych multiview.

Wykorzystanie mikroskopii fluorescencyjnej arkuszy świetlnych do obrazowania rozwoju oka danio pręgowanego

Śledzenie na żywo poszczególnych komórek progenitorowych siatkówki WT w różnych tłach genetycznych pozwala na ocenę udziału nieautonomicznej sygnalizacji komórek podczas neurogenezy. W tym celu wykorzystano kombinację knockdownu genów, generowania chimer poprzez przeszczep zarodka i poklatkowego obrazowania konfokalnego in vivo.

In vivo (in vivo)Obrazowanie ekspresji genów transgenicznych w poszczególnych progenitorach siatkówki w chimerycznych zarodkach danio pręgowanego w celu zbadania nieautonomicznych wpływów komórek

Tutaj omawiamy protokół metody, który pozwoli na łatwą analizę unaczynienia siatkówki dorosłego dg(fli:EGFP) danio pręgowanego jako szybki odczyt w warunkach długotrwałych patologii naczyniowych związanych z neoangiogenezą i zmianami strukturalnymi.

Badanie cukrzycy oczami ryby: mikrodysekcja, wizualizacja i analiza naczyń naczyniowych siatkówki dorosłego tg(fli:EGFP) danio pręgowanego

Te protokoły zostały opracowane w celu analizy morfologii soczewki korowej, integralności strukturalnej szwów soczewki danio pręgowanego w soczewkach stałych i żywych oraz do pomiaru położenia jądra soczewki danio pręgowanego wzdłuż osi przednio-tylnej.

Ocena lokalizacji jądra soczewki danio pręgowanego i integralności szwów

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Tutaj dostępny jest protokół do obrazowania poklatkowego morfogenezy oka za pomocą dostępnego na rynku mikroskopu lightsheet i stacji roboczej do przetwarzania obrazu w celu analizy uzyskanych danych. Protokół ten szczegółowo opisuje procedury znieczulenia zarodka, zatopienia w agarozie o niskiej temperaturze topnienia, zawieszenia w komorze obrazowania, ustawienia parametrów obrazowania i wreszcie analizy danych obrazowania za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.

Wizualizacja morfogenezy oka za pomocą mikroskopii Lightsheet przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego rx3:GFP

Artykuł wyjaśnia, jak chirurgicznie usunąć oczy z żywych larw danio pręgowanego, co jest pierwszym krokiem w kierunku zbadania, jak wejście siatkówki wpływa na wzrost i rozwój tektum nerwu wzrokowego. Ponadto artykuł zawiera informacje na temat znieczulenia, fiksacji i preparacji larw, a następnie immunohistochemii i obrazowania konfokalnego.

Usunięcie oczu u żywych larw danio pręgowanego w celu zbadania zależnego od unerwienia wzrostu i rozwoju układu wzrokowego

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepiania komórek o wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej w zarodkach i larwach danio pręgowanego na każdym etapie, między co najmniej 1 a 7 dniem po zapłodnieniu.

Przeszczep komórek w wysokiej rozdzielczości u embrionów i larw danio pręgowanego

Poznaj technikę przeszczepu soczewki u danio pręgowanego do badania rozwoju oka i interakcji tkanek. Metoda ta pozwala określić, czy mutacje wpływają na soczewkę autonomicznie czy nieautonomicznie.

Transplantacja soczewki u rybek zebrafish i jej zastosowanie w analizie mutantów oka

Przeglądaj więcej filmów