Transplantacja soczewki u rybek zebrafish i jej zastosowanie w analizie mutantów oka

Aby rozpocząć transplantację soczewki u danio pręgowanych, donory transgeniczne wykazujące ekspresję GFP oraz biorców z dzikiego typu inkubuje się najpierw przez 30 minut w osobnych szalkach Petriego zawierających roztwór Ringera dla danio pręgowanych pozbawiony wapnia. Następnie larwy ryb osadza się w dwóch równoległych liniach w niskotopliwym agarozie. Jedna linia (A) jest przeznaczona dla donorów, a druga (B) dla biorców. W przypadku biorców usuwa się całe oko donora, podczas gdy z biorcy usuwa się jedynie soczewkę.

Tkanki otaczające soczewkę dawcy są usuwane przed umieszczeniem soczewki w oku biorcy. Po transplantacji ryby są przechowywane w opisanych płytkach 24-dołkowych. Przeszczepiona soczewka powinna wykazywać fluorescencję GFP u biorcy.

Oczywiście, oko przeciwległe gospodarza nie zostało poddane operacji i nie wykazuje ekspresji GFP. Cześć, jestem Yj. A ja jestem Kaya McCullough i pochodzimy z laboratorium dr Yma Maki z Katedry Okulistyki na Harvard Medical School. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę transplantacji soczewki u dzikiego typu rybek zebrafish Daniel Rio.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do transplantacji soczewek od zwierząt typu dzikiego do mutantów i odwrotnie. Pozwala nam to określić, czy geny mutantów działają w soczewce autonomicznie czy nieautonomicznie. Zacznijmy zatem.

Linie danio prążkowanego są utrzymywane w standardowych warunkach w zapleczu dla ryb, w temperaturze 28.5 °C, przy 14-godzinnym cyklu światła i 10-godzinnym cyklu ciemności. Wieczorem przed planowanym eksperymentem umieszcza się samce i samice w zbiorniku z przegrodą, aby je od siebie oddzielić. Genotyp tych ryb powinien zapewniać potomstwo z ekspresją GFP oraz każdą interesującą mutacją. Równolegle zastosuj tę samą procedurę w celu przygotowania krzyżówek między nietransgenicznymi zwierzętami typu dzikiego w ciągu jednej godziny.

Po zapaleniu światła rano wyjmij przegrody, aby umożliwić rybom rozmnażanie. Po 15 do 30 minutach przelej wodę z akwarium przez sito, aby zebrać embriony, a następnie wypłucz je strumieniem wody do jaj z butelki myjącej do szalki Petriego o wymiarach 100 na 15 milimetrów. Następnie oczyść jaja, odpipetowując niezapłodnione embriony oraz wszelkie zanieczyszczenia.

Wymień zużytą wodę z jaj z nową wodą z jaj. Embriony można przechowywać w inkubatorze w temperaturze 28,5 °C przed transplantacją soczewki. Gdy będziesz gotowy do przeprowadzenia transplantacji, przygotuj embriony, usuwając ręcznie chorion.

Za pomocą metalowej sondy i pęsety embriony z usuniętą otoczką należy teraz inkubować w 0,2% EDTA w bezwapniowym medium ZFR przez 30 minut. Podczas inkubacji można przygotować igły niezbędne do sekcji. Procedura transplantacji wymaga zaostrzonej igły do przecięcia tkanek otaczających soczewkę oraz wyjęcia embrionów z agaru.

Wymagana jest również tępa igła do przesuwania soczewki dawcy i wprowadzania jej do biorcy; każdą z igieł przygotowuje się poprzez odcięcie końcówki pipety Pasteura za pomocą noża diamentowego. Następnie do końcówki pipety Pasteura wprowadza się kapilarę szklaną tak, aby około połowy jej długości znajdowała się wewnątrz. Za pomocą płomienia ostrożnie wprowadza się cienki drucik wolframowy do otwartego końca kapilary.

Roztopić szkło nad drutem; za pomocą pęsety stabilnie przytrzymać koniec szklany drutem metalowym, jednocześnie obracając drugi koniec igły. Zmiękczone szkło powinno owinąć się spiralnie wokół metalu, mocno go chwytając. W ten sposób z igły tępej powstaje igła ostra.

Trzymaj drucik wolframowy nad płomieniem przez 1 do 1,5 minuty, wypalając metal, aż utworzy się bardzo cienka końcówka. Sprawdź jakość końcówki pod mikroskopem.

Odpowiednia końcówka nie powinna być wygięta ani zakrzywiona i powinna płynnie zwężać się do ostrego punktu o średnicy nie większej niż 50 micrometers. Sterylizuj obie igły w płomieniu przez kilka sekund i pozwól im ostygnąć przed rozpoczęciem procedury w plastikowej probówce do wirowania; przygotuj 1,2% low melting point aros oraz wolny od wapnia ZFR podgrzany do 40 degree C w kąpieli wodnej. Na odpowiednim etapie pobierz embriony dawcy do pipety Pasteura i powoli przenieś je do probówki do wirowania zawierającej aros. Inkubuj jaja w aros przez około pięć sekund.

Przenieś zarodki za pomocą pipety i ułóż je w rzędzie na 100 mm polistyrenowej płytce Petriego, pipetując powoli i ostrożnie; większość zarodków będzie leżeć na boku z okiem skierowanym do góry. Powtórz ten proces z jajami gospodarza i ułóż je w rzędzie równolegle do jaj dawcy, zanim agar zastygnie. Użyj tępej igły, aby obrócić wszystkie nieprawidłowo zorientowane zarodki tak, aby po zastygnięciu agaru oko było skierowane do góry.

Przykryj go 0,2% roztworem agarosy o niskiej temperaturze topnienia. Używając ostrej igły, usuń nadmiar agarosy wokół oczu i bardzo ostrożnie wytnij całe oko dawcy, które będzie pływać. Następnie wyjmij soczewkę z oka.

Wykonuje się to, przeciągając igłę przez tkankę oka od dołu do góry. Dotyczy to tylko osobnika gospodarza. Soczewkę wycina się, wykonując krótkie ruchy zaostrzoną igłą, tnąc jak najbliżej soczewki, aby jej nie przerwać.

Należy unikać usuwania zbyt dużej ilości tkanki z pozostałej części oka biorcy. Po uwolnieniu soczewki będą unosić się w medium. Za pomocą tępej igły ostrożnie przesuń soczewkę dawcy tuż nad miejsce położenia soczewki biorcy, a następnie dociśnij ją do właściwej pozycji za pomocą tępej igły.

Soczewkę gospodarza można odrzucić. Pozostawić embriony dawcy i gospodarza w 1,2% Aros przez 30 do 60 minut. Pożywka dla embrionów wspomaga gojenie ran.

Następnie należy uwolnić je z agros, używając zaostrzonej metalowej igły. Przenieś embriony do płytki 24-dołkowej z pożywką dla embrionów. Każdy embrion powinien znajdować się w osobnym dołku.

Należy odpowiednio oznakować dołki, aby po zakończeniu transferu soczewek było jasne, który gospodarz odpowiada któremu dawcy. Pozostawić embriony do rozwoju w temperaturze 28.5 °C do wyznaczonego czasu. W celu obserwacji fenotypowej zazwyczaj badamy różnicowanie soczewek w ciągu jednego do dwóch dni.

Soczewka pochodząca od donora powinna zachować ekspresję GFP po przeszczepieniu do oka biorcy. Jeśli fenotyp mutanty nie zostanie odratowany w środowisku typu dzikiego, wskazuje to, że fenotyp jest autonomiczny. Natomiast jeśli zostanie odratowany, uznaje się, że fenotyp jest nieautonomiczny.

Ma to istotne znaczenie dla funkcji leżącego u podstaw genu. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzenia przeszczepu soczewki w zarodku rybki danio. Podczas wykonywania tej procedury należy zachować szczególną ostrożność podczas formowania igieł oraz podczas samego wycinania soczewki.

Ponadto, po zakończeniu transplantacji należy szybko ustawić zarodki, zanim dojdzie do przetoczenia jajeczka. Nie zapomnij dodać medium do zarodków do ośmiu do dołka inkubacyjnego. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.