Name: Standaryzowane przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z tkanki płucnej myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-02T00:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Naucz się przygotowywać zawiesiny jednokomórkowe z tkanki płucnej myszy za pomocą dysocjatora gentleMACS. Ta metoda zapewnia wysoką liczbę żywych leukocytów i komórek śródbłonowych do dalszych badań.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy są pracownikami firmy Miltenyi Biotec GmbH, Niemcy.

Aby pracować w warunkach sterylnych, zaleca się wykonywanie wszystkich etapów w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
1. Materiały
<ol>
<li>Bufor HEPES: 10 mM HEPES-NaOH pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1.8 mM CaCl2) </li>
<li>Roztwór kolagenazy D: Kolagenaza D: 100 mg/mL (Kolagenaza D &gt; 0.15 U/mg), w buforze HEPES </li>
<li>Roztwór DNazy I: 20 000 U/mL DNazy I </li>
<li>Bufor PBS o pH 7.2 </li>
<li>Bufor PEB: 1 część roztworu zapasowego BSA w 20 częściach roztworu płuczącego autoMACS </li>
<li>Tkanka: płuco pochodzące od dorosłej samicy myszy BALB/C w wieku 6/7 tygodni, oczyszczone z przyległych narządów.</li>
<li>Opcjonalnie: CD11c MicroBeads, kolumny MACS MS, separator MACS do izolacji komórek dendrytycznych z zawiesiny pojedynczych komórek płuca myszy</li>
</ol>
2. Dysocjacja tkanki płucnej
<ol>
<li>Płucz tkankę w szalce Petri z PBS w celu usunięcia erytrocytów.</li>
<li>Przenieś maksymalnie 450 mg tkanki płucnej do probówki gentleMACS C Tube zawierającej 4,9 mL buforu HEPES.</li>
<li>Dodaj 100 μL roztworu kolagenazy D, aby uzyskać stężenie końcowe 2 mg/ml kolagenazy D.</li>
<li>Dodaj 10 μL roztworu DNazy I dla maksymalnie 150 mg tkanki (stężenie końcowe 40 U/ml DNazy I) lub 20 μL DNazy I dla 150-450 mg tkanki płucnej (stężenie końcowe 80 U/mL DNazy I).</li>
<li>Szczelnie zamknij probówkę C Tube i zamocuj ją w dysocjatorze gentleMACS. Następnie uruchom program „m_lung_01”.</li>
<li>Inkubuj przez 30 min w temperaturze 37°C przy automatycznej rotacji lub obracając probówkę ręcznie co 5 min.</li>
<li>Umieść próbkę z powrotem w dysocjatorze gentleMACS i uruchom program „m_lung_02”.</li>
</ol>
3. Filtracja
<ol>
<li>Przygotuj probówkę 50 mL do zbierania przefiltrowanych komórek, zastępując nakrętkę sitkiem komórkowym o rozmiarze oczek 70 μm.</li>
<li>Po zakończeniu drugiego programu gentleMACS można krótko odwirować probówkę w celu zebrania materiału próbki na dnie, w zależności od rozkładu materiału w probówce.</li>
<li>Pobierz komórki przez szczelną membranę nakrętki probówki C za pomocą odpowiedniej końcówki do pipety 1000 μl i nanieś je na sitko komórkowe.</li>
<li>Przemyj sitko komórkowe 5 ml buforu HEPES w RT.</li>
<li>Odwirowuj komórki w probówce 50 mL z prędkością 300xg przez 10 min, aby uzyskać osad.</li>
<li>Odsącz nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w pożądanej objętości buforu PEB.</li>
</ol>
Część 4: Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig1.jpg" alt="Wykres kropkowy z cytometrii przepływowej, FL-2 vs. FL-3, marker PI, analiza 92% populacji komórek." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Dysocjacja płuc z użyciem dysocjatora gentleMACS™ pozwoliła na uzyskanie 92% żywych komórek. Martwe komórki zostały zabarwione fluorescencyjnie jodkiem propidyny (PI) (prawy wykres kropkowy; lewy wykres kropkowy: brak zabarwienia PI).
<img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig2.jpg" alt="Wykresy kropkowe cytometrii przepływowej, CD45-PE vs. CD146-FITC i CD31-FITC, analiza populacji komórek." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Dysocjacja tkanki płuc myszy przy użyciu systemu gentleMACS Dissociator skutkuje wysokim odsetkiem żywych leukocytów i komórek śródbłonka. Otrzymane zawiesiny jednokomórkowe barwiono przeciwciałami CD45-PE i CD146-FITC lub CD31-FITC, a następnie analizowano metodą cytometrii przepływowej.
<img src="/files/ftp_upload/1266/1266figure2c.png" alt="Wykres kropkowy z cytometrii przepływowej, Anti-mPDCA-1 vs. CD11c, immunofenotypowanie, analiza populacji komórek." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 2C"> Rycina 3. Zawiesina pojedynczych komórek uzyskana z tkanki płuc myszy została zabarwiona przeciwciałami CD11c-FITC oraz Anti-mPDCA-1-APC w celu wykrycia mysich plazmacytoidalnych komórek dendrytycznych CD11clow m-PDCA-1+ oraz komórek CD11chigh.
 <img src="/files/ftp_upload/1266/1266fig4.jpg" alt="Analiza cytometrii przepływowej; wykresy kropkowe CD11c-PE względem Anti-MHC Class II-FITC przed i po wzbogaceniu." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4. Wzbogacenie komórek dendrytycznych przy użyciu CD11c MicroBeads, separatora MiniMACS i dwóch kolumn MS.

<ol><li>Swanson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flt3-Ligand%2C+IL-4%2C+GM-CSF%2C+and+Adherence-Mediated+Isolation+of+Murine+Lung+Dendritic+Cells%3A+Assessment+of+Isolation+Technique+on+Phenotype+and+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flt3-Ligand, IL-4, GM-CSF, and Adherence-Mediated Isolation of Murine Lung Dendritic Cells: Assessment of Isolation Technique on Phenotype and Function.</a> J. Immunol. 173, 4875-4881 (2004).</li>
<li>Vermaelen, K., Pauwels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+and+simple+discrimination+of+mouse+pulmonary+dendritic+cell+and+macrophage+populations+by+flow+cytometry%3A+Methodology+and+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Accurate and simple discrimination of mouse pulmonary dendritic cell and macrophage populations by flow cytometry: Methodology and new insights.</a> Cytometry Part A. 61A, 170-177 (2004).</li>
</ol>

Autorzy są pracownikami firmy Miltenyi Biotec GmbH, która produkuje instrument wykorzystany w niniejszym artykule.

W tym filmie przedstawiamy nową metodę dysocjacji tkanki płuc myszy. Wykazujemy, że połączenie obróbki mechanicznej i enzymatycznej tkanki płucne pozwoliło na uzyskanie wysokiego odsetka żywotnych leukocytów oraz komórek śródbłonka. W szczególności dezintegracja mechaniczna tkanki została przeprowadzona za pomocą urządzenia gentleMACS Dissociator. Probówki gentleMACS C Tubes zawierają system rotor-stator, który dysocjuje tkankę w sposób łagodny. Procedura jest sterowana przez ustawienia programu urządzenia. Parametry zos...

<table><tbody><tr><td>Probówki C Tube</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr katalogowy 130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_765_gentleMACS_C_Tubes.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; Zestaw startowy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr zamówienia 130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACSmix&amp;#8482; Rotator do probówek</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr zamówienia 130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS&amp;#8482; roztwór płuczący</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr kat. 130-091-222</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_134_155_autoMACS_Rinsing_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACS&amp;#174; roztwór zapasowy BSA</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr zamówienia 130-091-376</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_33_295_MACS_BSA_Stock_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD11c MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr zamówienia 130-052-001</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_93_132_CD11c_MicroBeads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD11c-FITC, CD11c-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr zamówienia 130-092-026130-091-830</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_329_CD11c.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Anti-mPDCA-1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr zamówienia 130-091-963</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_325_Anti_mPDCA_1.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD146-FITC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr zamówienia 130-092-026</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_417_CD146_LSEC_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD45-PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr katalogowy 130-091-610</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_331_CD45.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Roztwór jodku propidyny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr zamówienia 130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z wydłużonym zasięgiem Art 1000</td><td>Molecular BioProducts</td><td>Nr zamówienia 2079</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&lt;/a&gt;&lt;W celu zapewnienia pracy w warunkach sterylnych zaleca się wykonywanie wszystkich etapów w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

1. Materiały
Bufor HEPES: 10 mM HEPES-NaOH pH 7,4, 150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2
Roztwór kolagenazy D: Kolagenaza D: 100 mg/ml (Kolagenaza D > 0,15 U/mg) w buforze HEPES
Roztwór DNazy I: 20 000 U/ml DNazy I
Bufor PBS o pH 7,2
Bufor PEB: 1 część roztworu zapasowego BSA w 20 częściach roztworu płuczącego autoMACS
Tkanka: płuco pobrane od dorosłej samicy myszy BALB/C w wieku 6/7 tygodni, oczyszczone z przyległych narządów.
Opcjonalnie: CD11c MicroBeads, kolumny MACS MS, separator MACS do izolacji komórek dendrytycznych z zawiesiny pojedynczych komórek płuca mysiego.

2. Dysocjacja tkanki płucnej
Opłukać tkankę w naczyniu Petriego zawierającym PBS w celu usunięcia erytrocytów. Przenieść maksymalnie 450 mg tkanki płucnej do probówki gentleMACS C Tube zawierającej 4,9 ml buforu HEPES. Dodać 100 μl roztworu kolagenazy D do uzyskania stężenia końcowego 2 mg/ml kolagenazy D. Dodać 10 μl roztworu DNazy I dla ilości tkanki do 150 mg (stężenie końcowe 40 U/ml DNazy I) lub 20 μl DNazy I dla 150–450 mg tkanki płucnej (stężenie końcowe 80 U/ml DNazy I). Szczelnie zamknąć probówkę C Tube i zamocować ją w dysocjatorze gentleMACS. Następnie uruchomić program „m_lung_01”. Inkubować przez 30 min w temperaturze 37°C przy automatycznej rotacji lub ręcznym obracaniu co 5 min. Umieścić próbkę ponownie w dysocjatorze gentleMACS i uruchomić program „m_lung_02”.

3. Filtracja
Przygotować probówkę 50 ml do zbierania przefiltrowanych komórek, zastępując zakrętkę sitkiem komórkowym o rozmiarze oczek 70 μm. Po zakończeniu drugiego programu gentleMACS, w zależności od rozkładu materiału w probówce, można krótko odwirować probówkę, aby zebrać materiał na dnie. Pobrać komórki przez szczelną membranę zakrętki probówki C Tube za pomocą odpowiedniej końcówki do pipety 1000 μl i nanieść je na sitko komórkowe. Przemyć sitko komórkowe 5 ml buforu HEPES w temperaturze pokojowej. Odwirować komórki w probówce 50 ml przy 300xg przez 10 min do uzyskania osadu. Odessać supernatat i resuspender osad komórkowy w pożądanym objętości buforu PEB.

Część 4: Reprezentatywne wyniki
Rysunek 1. Dysocjacja płuc za pomocą dysocjatora gentleMACS™ pozwoliła uzyskać 92% żywych komórek. Komórki martwe zabarwiono fluorescencyjnie jodkiem propidyny (PI) (wykres kropkowy po prawej; wykres kropkowy po lewej: bez barwienia PI).
Rysunek 2. Dysocjacja tkanki płucnej myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS skutkuje wysokim odsetkiem żywych leukocytów i komórek śródbłonkowych. Otrzymane zawiesiny pojedynczych komórek zabarwiono przeciwciałami CD45-PE i CD146-FITC lub CD31-FITC, a następnie poddano analizie w cytometrii przepływowej.
Rysunek 3. Zawiesina pojedynczych komórek pochodząca z tkanki płucnej myszy została zabarwiona przeciwciałami CD11c-FITC i Anti-mPDCA-1-APC w celu wykrycia mysich plazmocytoidalnych komórek DC CD11clow m-PDCA-1+ oraz komórek CD11chigh.
Rysunek 4. Wzbogacenie komórek dendrytycznych przy użyciu CD11c MicroBeads, separatora MiniMACS i dwóch kolumn MS.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

standaryzowane przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki płuc myszy przy użyciu dysocjatora gentlemacs

Standardized Preparation of Single-Cell Suspensions from Mouse Lung Tissue using the gentleMACS Dissociator

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanek jest istotnym warunkiem wstępnym dla wielu eksperymentów w badaniach nad komórkami. Proces dysocjacji całych narządów wymaga zastosowania specyficznych parametrów, aby w sposób powtarzalny uzyskać wysoką liczbę żywych komórek. Urządzenie gentleMACS Dissociator optymalizuje to zadanie dzięki prostemu i praktycznemu protokołowi. Instrument posiada zaprogramowane ustawienia zoptymalizowane pod kątem wydajnej, a zarazem łagodnej dysocjacji różnych typów tkanek, w tym płuc myszy. W niniejszej publikacji zaprezentowano zastosowanie urządzenia gentleMACS Dissociator w odniesieniu do tkanki płucnej pochodzącej od myszy.

Dysocjacja komórek z określonych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać dużą liczbę żywotnych komórek zdolnych do hodowli. Dysocjator Miltenyi gentleMACS optymalizuje to zadanie dzięki prostemu i praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono sposób wykorzystania tego urządzenia w odniesieniu do tkanki płucnej.

Standaryzowane przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki płuc myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanek jest istotnym warunkiem wstępnym dla wielu eksperymentów w badaniach nad komórkami. Proces...

W tym protokole wideo dowiedzą się Państwo, jak dysocjować tkankę płuc dorosłej myszy przy użyciu zestawu GentleMACS po uprzedniej dysocjacji tkanki płucnej. W obecności kolagenazy D i DNazy I zawiesiny komórkowe są filtrowane przez sitko komórkowe o rozmiarze 70 µm, wirowane i zawieszane do dalszych zastosowań. Witajcie, nazywam się Melanie Mlu z Miltenyi Biotec w Niemczech.Dzisiaj zaprezentuję powtarzalną i zautomatyzowaną procedurę przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek z tkanki płuca myszy przy użyciu systemu dysocjacji GenX. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do przygotowania zawiesin pojedynczych komórek w celu wyizolowania leukocytów lub komórek śródbłonka. Zatem zaczynajmy.Przed rozpoczęciem protokołu należy przygotować kilka standardowych roztworów. Po pierwsze, będziemy potrzebować buforu Hebes. Po drugie, roztworu kolagenazy D zawierającego 100 mg/mL enzymu w buforze Hebes.Po trzecie, roztwór dase one zawierający 20 000 jednostek na mililitr dase one. Na koniec dwa powszechnie stosowane roztwory buforowe: typowy bufor PBS o pH 7,2 oraz bufor PEB przygotowany z roztworu płuczącego AutoMax i roztworu zapasowego BSA.Protokół rozpoczynamy od wypreparowanego płuca pobranego od samicy myszy biopsyjnej w wieku od sześciu do siedmiu tygodni. Należy upewnić się, że płuca są wolne od przylegających organów, takich jak serce i grasica, a także od naczyń krwionośnych odprowadzających i doprowadzających, tchawicy oraz tkanek łącznych. Tkankę płuczemy w szalce Petriego zawierającej PBS w celu usunięcia erytrocytów.Zazwyczaj płuco myszy w tym wieku waży od 110 do 150 mg. Jeśli planujesz dysocjować płuca starszych zwierząt lub innych szczepów myszy, zważ tkankę i bufor. W jednej probówce można dysocjować maksymalnie 450 mg tkanki.Przenieść tkankę płucną do rurki gentle max C zawierającej 4,9 milliliters buforu heis. Do tkanki płucnej i buforu dodać 100 microliters roztworu kolagenazy D do stężenia końcowego 2 milligrams per milliliter. Następnie dodać 10 microliters dase.Jeden roztwór na więcej niż 150 mg tkanki. Dodać 20 µL roztworu dase one. Upewnić się, że probówka C jest szczelnie zamknięta, a następnie umieścić ją dnem do góry w urządzeniu gentle max dis.Upewnij się, że tkanka znajduje się pomiędzy rotorem a statorem. Wybierz program dla płuc i uruchom go, naciskając przycisk start; po zakończeniu programu wyjmij probówkę typu C z urządzenia i inkubuj próbkę przez 30 minut.Podczas inkubacji w inkubatorze w temperaturze 37 °C probówkę należy obracać za pomocą rotatora Max Mix lub obracać ręcznie co pięć minut. Po inkubacji należy umieścić probówkę C z powrotem w urządzeniu Gentle Max Associator i uruchomić drugi program dla płuc. W czasie trwania programu należy przygotować probówkę o pojemności 50 mL do zbierania przefiltrowanych komórek, zastępując zakrętkę sitkiem komórkowym o oczkach 70 µm. Po zakończeniu programu dysocjacji, w zależności od rozkładu materiału próbki w probówce, można przeprowadzić krótkie wirowanie w celu skoncentrowania materiału próbki.Rozdzielone komórki można usunąć z probówki, pipetując je przez zamkniętą septą zakrętkę probówki C. Przy użyciu odpowiedniego końcówki do pipety 1000 µl, zawiesinę komórkową nanosi się na sitko komórkowe w celu usunięcia większych cząsteczek lub agregatów. Po odcieknięciu roztworu należy przemyć sitko komórkowe, dodając dodatkowe 5 mL buforu HEES w temperaturze pokojowej, aby zebrać przefiltrowane komórki w osad.Wiruj probówkę o pojemności 50 ml z prędkością 300 GS przez 10 minut. Następnie odessij nadsącz i resuspenduj osad komórkowy w pożądanej objętości buforu PEB o temperaturze pokojowej.Nie należy oddzielać nadsączu. Można teraz przejść do dalszych etapów analizy. Dysocjacja tkanki płuc myszy z zastosowaniem tej procedury pozwoli na uzyskanie wysokiego odsetka żywych leukocytów oraz komórek śródbłonka.Otrzymane zawiesiny pojedynczych komórek barwiono przeciwciałami CD 45 PE, CD 1 46 FITC lub CD 31 FITC, a następnie analizowano metodą cytometrii przepływowej. Wykres ten przedstawia wzbogacenie populacji komórek dendrytycznych przy użyciu mikrokulek CD 11 C, separatora minimax oraz dwóch kolumn MS. Właśnie zaprezentowałem sposób standaryzowanego przygotowania zawiesin pojedynczych komórek z tkanki płuc myszy z wykorzystaniem delikatnej dysocjacji w systemie GentleMix oraz probówek C.Metoda ta umożliwia wydajną dysocjację tkanki płucnej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest prawidłowe wycięcie płuca i przetworzenie tkanki bezpośrednio po sekcji. Przygotowane zawiesiny pojedynczych komórek mogą być następnie wykorzystane w dalszych eksperymentach.Na przykład magnetyczne znakowanie komórek, a następnie separacja leukocytów lub komórek śródbłonka. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

standardized-preparation-single-cell-suspensions-from-mouse-lung

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Standaryzowane przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z tkanki płucnej myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS

Niniejszy film opisuje prostą i oszczędzającą czas technikę automatycznej dysocjacji tkanek z użyciem dysocjatora gentleMACS w celu przygotowania zawiesin pojedynczych komórek splenocytów mysich.

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek ze śledziony myszy z użyciem dysocjatora gentleMACS

Dysocjacja komórek z konkretnych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać wysoką liczbę żywych komórek zdolnych do hodowli. Urządzenie Miltenyi gentleMACS Dissociator optymalizuje to zadanie dzięki prostemu, praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono zastosowanie tego urządzenia w odniesieniu do tkanki nerwowej.

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki nerwowej myszy

W niniejszym artykule prezentujemy izolację mysich rezydentnych mezenchymalnych komórek macierzystych płuc (lung MSC), ich ekspansję, charakterystykę oraz analizę właściwości immunomodulacyjnych.

Izolacja &amp;#38; Charakterystyka barwnika Hoechstniski CD45ujemny Mezenchymalne komórki macierzyste płuc myszy

Opisano metodę otrzymywania wysoce oczyszczonej preparacji komórek dendrytycznych z płuc myszy. Szczególny nacisk położono na izolację podgrupy konwencjonalnych komórek dendrytycznych.

Izolacja komórek dendrytycznych z płuc myszy

Ten film opisuje przygotowanie zawiesiny komórek płuc myszy do analizy metodą cytometrii przepływowej w celu zbadania ekspresji PD-L1 komórek gruczolakoraka płuc.

Przygotowanie płuc myszy do cytometrii przepływowej: generowanie zawiesiny komórkowej z tkanki płucnej do analizy cytometrii przepływowej

Ta praca opisuje standaryzację metody uzyskiwania oczyszczonych populacji komórek rozrodczych z tkanki jąder różnych gatunków ssaków. Jest to prosty protokół, który łączy mechaniczną dysocjację jąder, barwienie za pomocą Hoechst-33342 i jodku propidyny oraz sortowanie FACS, z szerokim zastosowaniem w badaniach porównawczych biologii rozrodu mężczyzn.

Ustandaryzowane podejście do wielogatunkowego oczyszczania męskich komórek rozrodczych ssaków za pomocą mechanicznej dysocjacji tkanek i cytometrii przepływowej

To badanie przedstawia dwie kluczowe techniki eksperymentalne: budowę mysiego modelu rany do oceny zamknięcia rany oraz przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z mysiej skóry w celu zachowania żywotności komórek.

Modele ran u myszy i przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek

Dostarczamy szczegółowy protokół do izolowania i identyfikacji rzadkich populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu w płucach myszy poprzez magnetyczne wzbogacanie limfocytów T na bazie kulek magnetycznych i tetramery peptydu:głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC).

Identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu z płuc myszy za pomocą peptydów: głównych tetramerów kompleksu zgodności tkankowej

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację żywych populacji immunologicznych i nieimmunologicznych z płuc myszy w stanie ustalonym i po zakażeniu grypą. Zapewnia również strategie bramkowania do identyfikacji podzbiorów komórek nabłonkowych i szpikowych.

Izolacja żywych populacji komórek szpikowych i nabłonkowych z płuc myszy

Protokół opisany poniżej jest prostym i skutecznym sposobem na izolację komórek zawierających retinoidy z wysoce heterogenicznych populacji komórek płuc poprzez wykorzystanie specyficznej autofluorescencji retinoidów i zastosowanie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją.

Izolacja komórek płuc zawierających retinoidy przez sortowanie komórek

Protokół ten przedstawia szczegółową metodę izolowania wysokiej jakości zawiesin pojedynczych komórek zarówno ze zdrowej, jak i z guzowymi tkankami płuc myszy. Protokół ten może być stosowany w scRNA-seq, analizie cytometrii przepływowej oraz izolacji komórek pierwotnych.

Optymalizacja przygotowania całej tkanki płucnej z guzem myszy do cytometrii przepływowej i sekwencjonowania RNA pojedynczego komórkowego

Naucz się przygotowywać zawiesiny jednokomórkowe z tkanki płucnej myszy za pomocą dysocjatora gentleMACS. Ta metoda zapewnia wysoką liczbę żywych leukocytów i komórek śródbłonowych do dalszych badań.

Standaryzowane przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki płuc myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS

Przeglądaj więcej filmów