Standaryzowane przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z tkanki płucnej myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS
2 lipca 2009
Oddzielenie komórek od określonych typów tkanek wymaga określonych parametrów do pobudzenia tkanek w celu uzyskania dużej ilości żywotnych, zdolnych do hodowli komórek. Dysocjator Miltenyi gentleMACS optymalizuje to zadanie za pomocą prostego, praktycznego protokołu. W niniejszej publikacji wyjaśniono zastosowanie tego aparatu na tkance płucnej.
W tym protokole wideo zobaczysz, jak zdysocjować tkankę płucną dorosłej myszy za pomocą delikatnego maksimum po dysocjacji tkanki płucnej. W obecności kolagenazy d i DNAS zawiesiny jednej komórki są filtrowane za pomocą wirówki z sitkiem o średnicy 70 mikronów i zawieszane do dalszych zastosowań. Cześć, nazywam się Melanie Mlu i pracuję w Mil Biotech w Niemczech.
Dzisiaj pokażę Ci powtarzalną i zautomatyzowaną procedurę przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki z tkanki płucnej myszy za pomocą dysocjacji GenX. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do przygotowania zawiesin pojedynczych komórek do przygotowania leukocytów lub komórek śródbłonka. Dobra, zacznijmy.
Zanim przystąpimy do sporządzania protokołu, musimy przygotować i mieć w pogotowiu kilka standardowych rozwiązań. Po pierwsze, będziemy potrzebować bufora Hebes. Po drugie, roztwór kolagenazy D zawierający 100 miligramów na mililitr enzymu i bufor hebes.
Po trzecie, roztwór dase one zawierający 20 000 jednostek na mililitr dase jeden. Wreszcie, dwa popularne rozwiązania buforowe. Typowy bufor PBS o pH 7,2 i bufor PEB pochodzący z roztworu płuczącego AutoMax i roztworu podstawowego BSA.
Rozpoczynamy nasz protokół od wypreparowanego płuca pobranego od sześcio- lub siedmiotygodniowej samicy myszy poddanej biopsji. Upewnij się, że płuca są wolne od sąsiednich narządów, takich jak serce i grasica, odprowadzające i doprowadzające naczynia krwionośne, tchawica i tkanki łączne. Wypłucz tkankę na szalce Petriego zawierającej PBS w celu usunięcia erytrocytów.
Zazwyczaj płuco myszy w tym wieku waży od 110 do 150 miligramów. Jeśli planujesz kojarzyć płuca ze starszymi zwierzętami lub innymi szczepami myszy, zważ tkankę i buforuj. Maksymalnie 450 miligramów tkanki może być zdysocjowanych na jedną probówkę.
Przenieś tkankę płucną do delikatnej rurki max C wypełnionej 4,9 mililitra buforu heis. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu kolagenazy D do końcowego stężenia dwóch miligramów na mililitr do tkanki płucnej i buforu. Teraz 10 mikrolitrów dase.
Jedno rozwiązanie dla ponad 150 miligramów tkanki. Dodaj 20 mikrolitrów dase jeden roztwór. Upewnij się, że rurka C jest szczelnie zamknięta i umieść ją do góry nogami na delikatnym max dis.
Upewnij się, że tkanka znajduje się między wirnikiem a stojanem. Wybierz program płuc i uruchom go, naciskając przycisk start po zakończeniu programu. Wyjąć probówkę C z przyrządu i inkubować próbkę przez 30 minut.
W inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza podczas inkubacji probówkę należy obracać za pomocą rotatora probówki max mix lub ręcznie obracać co pięć minut. Po inkubacji zwróć rurkę C do delikatnego asocjatora max i uruchom drugi program płucny Podczas działania programu przygotuj 50-mililitrową probówkę do zbierania przefiltrowanych komórek, zastępując nasadkę sitkiem do komórek o siatku 70 mikrometrów. Po zakończeniu programu dysocjacji, w zależności od rozkładu materiału próbki w probówce, można krótko odwirować probówkę w celu skoncentrowania materiału próbki.
Zdysocjowane komórki można usunąć z probówki przez pipetowanie przez uszczelnioną przegrodę nasadkę rurki C. Za pomocą odpowiedniej końcówki do pipet o pojemności 1000 mikrolitrów zawiesinę komórek nakłada się na sitko komórek w celu usunięcia większych cząstek lub agregatów. Po odsączeniu roztworu umyj sitko komórkowe, dodając dodatkowe pięć mililitrów temperatury pokojowej i bufor do osadzania przefiltrowanych komórek.
Odwirować 50-mililitrową probówkę o stężeniu 300 GS przez 10 minut. Teraz odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w żądanej objętości o temperaturze pokojowej. Bufor peb.
Nie dekantować supernatantu. Teraz możesz przejść do aplikacji podrzędnej. Dysocjacja tkanki płucnej myszy przy użyciu tej procedury pozwoli uzyskać wysoki odsetek żywotnych leukocytów i komórek śródbłonka.
Otrzymane zawiesiny pojedynczych komórek barwiono CD 45 PE jako CD 1 46 FITC lub CD 31 FITC i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Ten wykres przedstawia wzbogacanie komórek dendrytycznych za pomocą mikrokulek CD 11 C, separatora minimax i dwóch kolumn MS. Porządku. Właśnie pokazałem, jak przygotować zawiesiny jednokomórkowe z tkanki płucnej myszy w ustandaryzowany sposób, używając delikatnej dysocjacji mieszanki i rurek C.
Metoda ta pozwala na sprawną i skuteczną dysocjację tkanek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby prawidłowo wypreparować płuco i przetworzyć tkankę natychmiast po sekcji. Przygotowane zawiesiny pojedynczych komórek można następnie wykorzystać do dalszych eksperymentów.
Na przykład znakowanie magnetyczne komórek, a następnie oddzielenie leukocytów lub komórek śródbłonka. Dobra, to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
To wideo przedstawia protokół dysocjacji dorosłego tkanki płuc myszy za pomocą dissociatora gentleMACS. Procedura została zaprojektowana w celu uzyskania dużej objętości żywych, nadających się do hodowli komórek do dalszych zastosowań.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Techniki dysocjacji komórek
- Przygotowanie pojedynczej zawiesiny komórkowej
- Analiza tkanki płuc myszy
Tło
- Dysocjowanie komórek z tkanek wymaga określonych parametrów.
- Dissociator gentleMACS zapewnia zoptymalizowany protokół.
- W procesie dysocjacji stosuje się kolagenazę D i DNAzę.
- Przygotowuje się przefiltrowane zawiesiny komórkowe do dalszych zastosowań.
Cel badania
- Przedstawienie metody przygotowywania pojedynczych zawiesin komórkowych, która jest powtarzalna.
- Ułatwienie badania leukocytów i komórek śródbłonka.
- Dostarczenie praktycznego protokołu dla badaczy w tej dziedzinie.
Stosowane metody
- Zastosowanie dissociatora gentleMACS do agitowania tkanek.
- Zastosowanie kolagenazy D i DNAzy podczas dysocjacji.
- Filtracja zawiesin komórkowych przez sitko komórkowe o średnicy 70 mikronów.
- Centrifugowanie i suszenie komórek do dalszych zastosowań.
Główne wyniki
- Udana dysocjacja tkanki płuc myszy w pojedyncze zawiesiny komórkowe.
- Uzyskano dużą objętość żywych, nadających się do hodowli komórek.
- Protokół wykazał się powtarzalnością i wydajnością.
- Przygotowanie nadające się do dalszych zastosowań.
Wnioski
- Dissociator gentleMACS jest skuteczny w dysocjacji tkanki płuc.
- Ta metoda może być stosowana do różnych typów tkanek.
- Dostarcza cennego narzędzia dla badaczy zajmujących się badaniem tkanki płuc.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Standardized tissue dissociation is a critical upstream step in immunology and vascular biology research, enabling reproducible preparation of primary cell suspensions for downstream analysis. The gentleMACS Dissociator provides an automated, gentle, and scalable method for generating high-viability single-cell suspensions from mouse lung tissue, supporting consistent input for flow cytometry, cell sorting, and molecular profiling. This capability enhances predictive confidence in target validation studies by reducing variability in cellular yield and viability across experiments.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of leukocyte and endothelial cell populations in lung tissue for target hypothesis testing.
- Operational Value: Reduces manual variability in tissue processing, improving reproducibility across laboratories and timepoints.
- Predictive Value: Supports consistent cellular input for flow cytometry and sorting, increasing confidence in phenotypic screening outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces filtered, debris-free suspensions suitable for antibody staining and flow-based assays.
- Operational Value: Standardized enzymatic digestion and mechanical dissociation ensure batch-to-batch consistency in cell yield.
- Assay Readiness: Generates suspensions compatible with downstream applications like magnetic labeling and cell separation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Provides a disease-relevant system for studying immune and vascular cell dynamics in lung tissue.
- Preclinical Model Support: Enables isolation of primary cells from murine lungs for mechanistic de-risking of therapeutic targets.
- Risk-Adjusted Advancement: Reliable cell preparation supports consistent biomarker analysis and functional validation in preclinical workflows.
Pipeline & Workflow Integration
The gentleMACS Dissociator fits into the discovery workflow as a standardized sample preparation step between tissue harvest and cellular analysis, enabling reliable transition from ex vivo tissue to assay-ready single cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven isolation of lung-resident immune and stromal cells for pathway analysis.
- Screening: Delivers reproducible cell suspensions for high-content or flow-based phenotypic screening of immune modulators.
- Analytics: Enables quantitative flow cytometry readouts (e.g., CD45+, CD31+) for comparing experimental conditions.
- Translational Research: Connects murine lung models to human-relevant immune and endothelial cell studies via standardized preparation.
- Enterprise Reuse: The instrument’s pre-programmed lung protocol allows reuse across projects studying pulmonary inflammation, fibrosis, or infection.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High viability and purity of leukocytes and endothelial cells increase data quality in downstream applications.
- Operational Value: Automation reduces hands-on time and user-dependent variability in tissue dissociation.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on consistent cellular yields and viability metrics.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets by providing reliable primary cell inputs for validation.
Implementation Considerations
- Requires training in aseptic tissue dissection and enzymatic handling.
- Depends on access to gentleMACS Dissociator with lung-specific program and C tubes.
- Necessitates standardization of enzyme concentrations (Collagenase D, DNase) and buffer conditions across users.
- Adaptation may be needed for different mouse strains, ages, or disease models affecting tissue density.
- Limited to tissues compatible with enzymatic dissociation; mechanical alternatives may be needed for fibrous or calcified samples.
