Standaryzowane przygotowanie zawiesin jednokomórkowych z tkanki płucnej myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS
2 lipca 2009
Oddzielenie komórek od określonych typów tkanek wymaga określonych parametrów do pobudzenia tkanek w celu uzyskania dużej ilości żywotnych, zdolnych do hodowli komórek. Dysocjator Miltenyi gentleMACS optymalizuje to zadanie za pomocą prostego, praktycznego protokołu. W niniejszej publikacji wyjaśniono zastosowanie tego aparatu na tkance płucnej.
W tym protokole wideo zobaczysz, jak zdysocjować tkankę płucną dorosłej myszy za pomocą delikatnego maksimum po dysocjacji tkanki płucnej. W obecności kolagenazy d i DNAS zawiesiny jednej komórki są filtrowane za pomocą wirówki z sitkiem o średnicy 70 mikronów i zawieszane do dalszych zastosowań. Cześć, nazywam się Melanie Mlu i pracuję w Mil Biotech w Niemczech.
Dzisiaj pokażę Ci powtarzalną i zautomatyzowaną procedurę przygotowania zawiesiny pojedynczej komórki z tkanki płucnej myszy za pomocą dysocjacji GenX. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do przygotowania zawiesin pojedynczych komórek do przygotowania leukocytów lub komórek śródbłonka. Dobra, zacznijmy.
Zanim przystąpimy do sporządzania protokołu, musimy przygotować i mieć w pogotowiu kilka standardowych rozwiązań. Po pierwsze, będziemy potrzebować bufora Hebes. Po drugie, roztwór kolagenazy D zawierający 100 miligramów na mililitr enzymu i bufor hebes.
Po trzecie, roztwór dase one zawierający 20 000 jednostek na mililitr dase jeden. Wreszcie, dwa popularne rozwiązania buforowe. Typowy bufor PBS o pH 7,2 i bufor PEB pochodzący z roztworu płuczącego AutoMax i roztworu podstawowego BSA.
Rozpoczynamy nasz protokół od wypreparowanego płuca pobranego od sześcio- lub siedmiotygodniowej samicy myszy poddanej biopsji. Upewnij się, że płuca są wolne od sąsiednich narządów, takich jak serce i grasica, odprowadzające i doprowadzające naczynia krwionośne, tchawica i tkanki łączne. Wypłucz tkankę na szalce Petriego zawierającej PBS w celu usunięcia erytrocytów.
Zazwyczaj płuco myszy w tym wieku waży od 110 do 150 miligramów. Jeśli planujesz kojarzyć płuca ze starszymi zwierzętami lub innymi szczepami myszy, zważ tkankę i buforuj. Maksymalnie 450 miligramów tkanki może być zdysocjowanych na jedną probówkę.
Przenieś tkankę płucną do delikatnej rurki max C wypełnionej 4,9 mililitra buforu heis. Dodaj 100 mikrolitrów roztworu kolagenazy D do końcowego stężenia dwóch miligramów na mililitr do tkanki płucnej i buforu. Teraz 10 mikrolitrów dase.
Jedno rozwiązanie dla ponad 150 miligramów tkanki. Dodaj 20 mikrolitrów dase jeden roztwór. Upewnij się, że rurka C jest szczelnie zamknięta i umieść ją do góry nogami na delikatnym max dis.
Upewnij się, że tkanka znajduje się między wirnikiem a stojanem. Wybierz program płuc i uruchom go, naciskając przycisk start po zakończeniu programu. Wyjąć probówkę C z przyrządu i inkubować próbkę przez 30 minut.
W inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza podczas inkubacji probówkę należy obracać za pomocą rotatora probówki max mix lub ręcznie obracać co pięć minut. Po inkubacji zwróć rurkę C do delikatnego asocjatora max i uruchom drugi program płucny Podczas działania programu przygotuj 50-mililitrową probówkę do zbierania przefiltrowanych komórek, zastępując nasadkę sitkiem do komórek o siatku 70 mikrometrów. Po zakończeniu programu dysocjacji, w zależności od rozkładu materiału próbki w probówce, można krótko odwirować probówkę w celu skoncentrowania materiału próbki.
Zdysocjowane komórki można usunąć z probówki przez pipetowanie przez uszczelnioną przegrodę nasadkę rurki C. Za pomocą odpowiedniej końcówki do pipet o pojemności 1000 mikrolitrów zawiesinę komórek nakłada się na sitko komórek w celu usunięcia większych cząstek lub agregatów. Po odsączeniu roztworu umyj sitko komórkowe, dodając dodatkowe pięć mililitrów temperatury pokojowej i bufor do osadzania przefiltrowanych komórek.
Odwirować 50-mililitrową probówkę o stężeniu 300 GS przez 10 minut. Teraz odessać supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w żądanej objętości o temperaturze pokojowej. Bufor peb.
Nie dekantować supernatantu. Teraz możesz przejść do aplikacji podrzędnej. Dysocjacja tkanki płucnej myszy przy użyciu tej procedury pozwoli uzyskać wysoki odsetek żywotnych leukocytów i komórek śródbłonka.
Otrzymane zawiesiny pojedynczych komórek barwiono CD 45 PE jako CD 1 46 FITC lub CD 31 FITC i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej. Ten wykres przedstawia wzbogacanie komórek dendrytycznych za pomocą mikrokulek CD 11 C, separatora minimax i dwóch kolumn MS. Porządku. Właśnie pokazałem, jak przygotować zawiesiny jednokomórkowe z tkanki płucnej myszy w ustandaryzowany sposób, używając delikatnej dysocjacji mieszanki i rurek C.
Metoda ta pozwala na sprawną i skuteczną dysocjację tkanek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby prawidłowo wypreparować płuco i przetworzyć tkankę natychmiast po sekcji. Przygotowane zawiesiny pojedynczych komórek można następnie wykorzystać do dalszych eksperymentów.
Na przykład znakowanie magnetyczne komórek, a następnie oddzielenie leukocytów lub komórek śródbłonka. Dobra, to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół wideo demonstruje dysocjację tkanki płuc dorosłej myszy przy użyciu dysocjatora gentleMACS. Procedura została opracowana w celu uzyskania dużej liczby żywotnych, zdolnych do hodowli komórek do dalszych zastosowań.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Techniki dysocjacji komórek
- Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek
- Analiza tkanki płuc myszy
Wstęp
- Dysocjacja komórek z tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów.
- Dysocjator gentleMACS zapewnia zoptymalizowany protokół.
- W procesie dysocjacji stosuje się kolagenazę D oraz DNazę.
- Przefiltrowane zawiesiny komórkowe są przygotowywane do dalszych zastosowań.
Cel badania
- Zaprezentowanie powtarzalnej metody przygotowywania zawiesin pojedynczych komórek.
- Ułatwienie badania leukocytów oraz komórek śródbłonka.
- Dostarczenie praktycznego protokołu dla badaczy w tej dziedzinie.
Zastosowane metody
- Zastosowanie dysocjatora gentleMACS do agitacji tkanki.
- Użycie kolagenazy D i DNazy podczas dysocjacji.
- Filtracja zawiesin komórkowych przez sitko komórkowe o rozmiarze oczek 70 micron.
- Wirowanie i zawieszenie komórek do dalszych zastosowań.
Główne wyniki
- Skuteczna dysocjacja tkanki płuc myszy do zawiesin pojedynczych komórek.
- Uzyskanie dużej liczby żywotnych komórek zdolnych do hodowli.
- Protokół wykazał powtarzalność i efektywność.
- Preparat odpowiedni do dalszych zastosowań analitycznych.
Wnioski
- Dysocjator gentleMACS jest skuteczny w dysocjacji tkanki płucnej.
- Metodę tę można zastosować do różnych rodzajów tkanek.
- Stanowi cenne narzędzie dla badaczy zajmujących się tkanką płucną.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Standaryzowana dysocjacja tkanek jest krytycznym etapem wstępnym w badaniach nad immunologią i biologią naczyniową, umożliwiającym odtwarzalne przygotowanie zawiesin komórek pierwotnych do dalszych analiz. System gentleMACS Dissociator zapewnia zautomatyzowaną, łagodną i skalowalną metodę otrzymywania zawiesin pojedynczych komórek o wysokiej żywotności z tkanki płuc myszy, zapewniając spójny materiał wejściowy do cytometrii przepływowej, sortowania komórek i profilowania molekularnego. Możliwość ta zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad walidacją celów terapeutycznych poprzez redukcję zmienności w uzysku oraz żywotności komórek pomiędzy poszczególnymi eksperymentami.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia analizę populacji leukocytów i komórek śródbłonka w tkance płucnej w celu weryfikacji hipotez badawczych.
- Wartość operacyjna: Redukuje zmienność manualną w procesowaniu tkanek, co poprawia powtarzalność wyników pomiędzy laboratoriami i różnymi punktami czasowymi.
- Wartość prognostyczna: Zapewnia spójną ilość materiału komórkowego do cytometrii przepływowej i sortowania, co zwiększa pewność wyników przesiewowych fenotypowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie przefiltrowanych zawiesin wolnych od zanieczyszczeń, odpowiednich do barwienia przeciwciałami i analiz przepływowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane trawienie enzymatyczne i dysocjacja mechaniczna zapewniają spójność uzysku komórek między partiami.
- Gotowość do analizy: Generuje zawiesiny kompatybilne z dalszymi zastosowaniami, takimi jak znakowanie magnetyczne i separacja komórek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Zapewnia istotny dla przebiegu choroby system do badania dynamiki komórek odpornościowych i naczyniowych w tkance płucnej.
- Wsparcie modelu przedklinicznego: Umożliwia izolację pierwotnych komórek z płuc myszy w celu mechanistycznego ograniczania ryzyka w odniesieniu do celów terapeutycznych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Niezawodne przygotowanie komórek wspiera spójną analizę biomarkerów i walidację funkcjonalną w przepływach pracy przedklinicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Urządzenie gentleMACS Dissociator wpisuje się w proces badawczy jako ustandaryzowany etap przygotowania próbek pomiędzy pobraniem tkanki a analizą komórkową, umożliwiając niezawodne przejście od tkanki ex vivo do pojedynczych komórek gotowych do analizy.
- Biologia odkrywcza: Wspiera izolację komórek odpornościowych i zrębowych płuc w oparciu o postawione hipotezy w celu analizy szlaków sygnałowych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne zawiesiny komórkowe do wysokoprzepustowego lub przepływowego przesiewania fenotypowego modulatorów odporności.
- Analityka: Umożliwia ilościowe odczyty z cytometrii przepływowej (np. CD45+, CD31+) w celu porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Łączy mysie modele płuc z badaniami nad ludzkimi komórkami odpornościowymi i śródbłonkowymi dzięki standaryzacji przygotowania.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Zaprogramowany protokół płucny urządzenia umożliwia jego ponowne wykorzystanie w projektach badających zapalenie, włóknienie lub infekcje płuc.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Wysoka żywotność i czystość leukocytów oraz komórek śródbłonka zwiększają jakość danych w dalszych zastosowaniach.
- Wartość operacyjna: Automatyzacja skraca czas pracy manualnej i ogranicza zmienność zależną od operatora podczas dysocjacji tkanek.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o spójne wskaźniki wydajności i żywotności komórek.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka poprzez zapewnienie niezawodnych pierwotnych materiałów komórkowych do walidacji.
Kwestie związane z wdrożeniem
- Wymaga przeszkolenia w zakresie aseptycznej dysekcji tkanek i pracy z enzymami.
- Zależy od dostępu do dysocjatora gentleMACS z programem dedykowanym dla płuc oraz probówek C tubes.
- Wymaga standaryzacji stężeń enzymów (kolagenaza D, DNaza) oraz warunków buforu dla wszystkich użytkowników.
- Możliżna jest konieczność adaptacji protokołu dla różnych szczepów myszy, grup wiekowych lub modeli chorobowych wpływających na gęstość tkanki.
- Metoda jest ograniczona do tkanek kompatybilnych z dysocjacją enzymatyczną; w przypadku próbek włóknistych lub zwapniałych mogą być wymagane alternatywy mechaniczne.
