Name: Wytwarzanie zawiesin jednokomórkowych z tkanki nerwowej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-07T19:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 17 s
Description: Naucz się wytwarzać jednokomórkowe zawiesiny z tkanki nerwowej myszy przy użyciu gentleMACS Dissociator. Ta metoda zachowuje witalność komórek i epitopy antygenowe do dalszej analizy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Aby pracować w warunkach sterylnych, zaleca się wykonywanie wszystkich etapów w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
1. Materiały
<ul>
<li>Zestaw do dysocjacji tkanki nerwowej (P) (Składniki: Roztwory 1, 2, 3 i 4, bufor do przechowywania)</li>
<li>Filtry do wstępnej separacji</li>
<li>(Opcjonalnie) Kuleczki do usuwania mieliny</li>
<li>Beta-merkaptoetanol</li>
<li>Dysocjator gentleMACS</li>
<li>Probówki typu C</li>
<li>Rotator do probówek MACSmix</li>
<li>HBSS (bez białek)</li>
<li>HBSS (z białkami)</li>
</ul>
<ol>
<li>Przed rozpoczęciem protokołu przygotować następujące roztwory:<ol>
<li>Zbuforowany roztwór soli Hanksa bez kationów dwuwartościowych Ca2+ lub Mg2+ (HBSS (w/o)</li>
<li>Standardowy HBSS, tzn. z Ca2+ i Mg2+ (HBSS (w)</li>
</ol></li>
<li>W zależności od epitopu antygenu będącego przedmiotem zainteresowania w kolejnych zastosowaniach, należy użyć zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej opartego na papainie (P) lub zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej opartego na trypsynie (T).</li>
<li>Przygotować następujące roztwory z zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej:<ol>
<li>Roztwór 2: dodać beta-merkaptoetanol do stężenia 0,067 mM</li>
<li>Roztwór 4: rozpuścić proszek w 0,7 ml buforu do przechowywania (Storage Buffer, dostarczony w zestawie), delikatnie wymieszać (nie wirować w wortexie)</li>
<li>Mieszanka enzymatyczna 1 (Enzyme Mix 1): odmierzyć pipetą 1,9 mL roztworu 2 oraz 50 μl roztworu 1 (oba z zestawu) do probówki typu C i inkubować przez 10-15 min w 37 °C. Ilość ta jest wystarczająca do dysocjacji 400 mg tkanki mózgowej.</li>
</ol></li>
</ol>
2. Dysocjacja tkanki nerwowej
<ol>
<li>Zważ tkankę mózgu w probówce zawierającej 1 ml HBSS (bez Ca²⁺/Mg²⁺)</li>
<li>Przenieś mózg myszy do probówki typu C zawierającej 1950 μL podgrzanej Mieszaniny Enzymatycznej 1. (UWAGA: protokół ten jest opracowany dla ≤ 400 mg, ale objętość roztworów można skalować, aby pomieścić do 1600 mg tkanki mózgu na jedną probówkę typu C)</li>
<li>Umieść probówkę typu C w dysocjatorze gentleMACS i uruchom program „m_brain_01”.</li>
<li>Inkubuj z rotacją (4 rpm przy użyciu rotatora probówek MACSmix) przez 15 min w temperaturze 37 °C.</li>
<li>Umieść probówkę typu C w dysocjatorze gentleMACS i uruchom program „m_brain_02”.</li>
<li>Podczas etapu dysocjacji przygotuj 30 μl Mieszaniny Enzymatycznej 2 na każde 400 mg tkanki, delikatnie mieszając 20 μl Roztworu 3 i 10 μl Roztworu 4.</li>
<li>Dodaj Mieszaninę Enzymatyczną 2 do probówki typu C przez szczelną septę w nakrętce i delikatnie wymieszaj bez użycia vortexa.</li>
<li>Inkubuj probówkę typu C z rotacją przez 10 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze.</li>
<li>Umieść probówkę typu C w dysocjatorze gentleMACS i uruchom program „m_brain_03”.</li>
<li>Inkubuj probówkę typu C z rotacją przez 10 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze.</li>
<li>Krótko odwiruj próbkę, aby zebrać ją na dnie probówki.</li>
</ol>
3. Filtracja
<ol>
<li>Wybierz filtr o rozmiarze porów wystarczająco dużym, aby umożliwić przejście interesujących nas komórek. Na przykład komórki Purkinjego są zbyt duże, aby przejść przez filtr 30 μm, natomiast komórki Prominin-1+ przejdą.</li>
<li>Za pomocą odpowiedniej pipety 1000 μl pobierz komórki z rurki C przez zamkniętą septem zakrętkę i przenieś je na filtr wstępny zamocowany na probówce zbiorczej o pojemności 15 ml. (UWAGA: w przypadku większych próbek należy użyć probówki zbiorczej o pojemności 50 ml).</li>
<li>Przemyj filtr 10 ml HBSS (w).</li>
<li>Odwiruj przefiltrowane komórki przy 300 x g przez 10 min w RT.</li>
<li>Resuspender supernatant w wybranym medium lub buforze do dalszych zastosowań.</li>
<li>W celu usunięcia szczątków mieliny zastosuj kuleczki do usuwania mieliny (Myelin Removal Beads).</li>
</ol>
4. Reprezentatywny wynik: Patrz rysunki 1-3
<img src="/files/ftp_upload/1267/Fig_1.png" alt="Wykres kropkowy cytometrii przepływowej, jodek propidyny vs. FL-2, żywotność komórek, 97% żywych, 3% martwych komórek." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="fig 1"> Rysunek 1 Dysocjacja mózgu przy użyciu urządzenia gentleMACS Dissociator pozwoliła uzyskać 97% żywych komórek, co wykazuje analiza cytometryczna.
<img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig2.png" alt="Wzrost kolonii drobnoustrojów obserwowany pod mikroskopem, ilustrujący proliferację hodowli komórkowej." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="fig 2"> Rysunek. 2 Zdjęcie z mikroskopu świetlnego przedstawiające tworzenie neurosfer po magnetycznej separacji komórek z użyciem MicroBeads Anti-Prominin-1 po 7 dniach hodowli w MACS® NeuroMedium z dodatkiem MACS Supplement B27 PLUS. Komórki przygotowano z mózgu myszy CD1 (P3) przy użyciu Neural Tissue Dissociation Kit (P).
<img src="/files/ftp_upload/1267/1267fig4.jpg" alt="Wykresy rozrzutu cytometrii przepływowej izolacji komórek Prominin-1+; analiza danych, efekt usuwania mieliny." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="fig 3.5"> Rysunek 3 Szczątki mieliny w zawiesinach pojedynczych komórek znacznie utrudniają izolację komórek, a usuwanie szczątków mieliny za pomocą kulek Myelin Removal Beads zwiększa wydajność separacji komórek. W przypadku separacji MACS z użyciem kulek Anti-Prominin-1 MicroBeads, mózg myszy P22 został rozdzielony przy użyciu zestawu Neural Tissue Dissociation Kit (P). Komórki z zawiesiny pojedynczych komórek zostały albo bezpośrednio użyte do separacji, albo poddane usuwaniu mieliny za pomocą Myelin Removal Beads. Porównanie separacji z próbek bez i z usuwaniem mieliny wykazuje, że czystość jest wyższa w przypadku próbek po uprzednim usunięciu mieliny.

<ol><li>Hardt, O., Scholz, C., Küsters, D., Yanagawa, Y., Pennartz, S., Cremer, H., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+analysis+defines+differences+between+region-specific+GABAergic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Gene expression analysis defines differences between region-specific GABAergic neurons.</a> Mol Cell Neurosci. 39, 418-428 (2008).</li>
<li>Lee, J. K., McCoy, M. K., Harms, A. S., Ruhn, K. A., Gold, S. J., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulator+of+G-protein+signaling+10+promotes+dopaminergic+neuron+survival+via+regulation+of+the+microglial+inflammatory+response%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulator of G-protein signaling 10 promotes dopaminergic neuron survival via regulation of the microglial inflammatory response.</a> J Neurosci. 28, 8517-8528 (2008).</li>
<li>Környei, Z., Gócza, E., Rühl, R., Orsolits, B., Vörös, E., Szabó, B., Vágovits, B., Madarász, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astroglia-derived+retinoic+acid+is+a+key+factor+in+glia-induced+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Astroglia-derived retinoic acid is a key factor in glia-induced neurogenesis.</a> FASEB J. 21, 2496-2509 (2007).</li>
<li>Meylan, F., Davidson, T. S., Kahle, E., Kinder, M., Acharya, K., Jankovic, D., Bundoc, V., Hodges, M., Shevach, E. M., Keane-Myers, A., Wang, E. C., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+TNF-family+receptor+DR3+is+essential+for+diverse+T+cell-mediated+inflammatory+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The TNF-family receptor DR3 is essential for diverse T cell-mediated inflammatory diseases.</a> Immunity. 29, 79-89 (2008).</li>
<li>Skog, J., Würdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., Sena-Esteves, M., Curry, W. T. Jr, Carter, B. S., Krichevsky, A. M., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nat Cell Biol. 10, 1470-1476 (2008).</li>
</ol>

Autorzy są pracownikami firmy Miltenyi Biotec GmbH, Niemcy.

Urządzenie gentleMACS Dissociator umożliwia standaryzowane przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanek nerwowych w systemie zamkniętym. Zestawy do dysocjacji tkanki nerwowej (Neural Tissue Dissociation Kits) zostały zoptymalizowane pod kątem zachowania epitopów antygenowych niezbędnych do dalszych zastosowań, takich jak barwienia immunocytochemiczne i immunomagnetyczna separacja komórek1-5. W niniejszym protokole przedstawiamy łagodną dysocjację enzymatyczną mózgu myszy przy użyciu urządzenia gentleMACS Dissociator oraz zestawu Neural Tissue Dissociation Kit (P), co pozwala uzyskać komórki o żywotności 97%. Z 100 mg tkanki nerwowej uzyskuje się od 5x106 do 1x107 komórek, w zależności od wieku tkanki gospodarza. Docelowe komórki Prominin-1+ zostały wyizolowane przy użyciu Anti-Prominin-1 MicroBeads, a następnie poddane hodowli. Wykazano, że protokół jest jeszcze bardziej skuteczny przy dodatkowym zastosowaniu Myelin Removal Beads podczas pracy z tkanką nerwową myszy w wieku &gt;P7.

<table><tbody><tr><td>Probówki C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr kat. 130-093-237</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>gentleMACS&amp;#8482; Zestaw startowy</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr zamówienia 130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MACSmix&amp;#8482; Rotator do probówek</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr kat. 130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji tkanki nerwowej (P)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr kat. 130-092-628</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Filtry do wstępnej separacji</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr kat. 130-041-407</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_247_Pre_Separation_Filters.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>MicroBeads przeciwko Promininnie-1</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr zamówienia 130-092-333</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_654_524_Anti_Prominin_1_MicroBeads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Przeciwciało Anti-Prominin-1-APC</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr kat. 130-092-335</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_525_Anti_Prominin_1.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Kuleczki do usuwania mieliny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr kat. 130-094-544</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_688_Myelin_Removal_Beads.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Końcówki do pipet o zwiększonym zasięgu Art 1000 </td><td>Molecular BioProducts</td><td>Nr kat. 2079</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/ASP/products.aspx?query_TipID=61&lt;/a&gt;&lt;Aby pracować w warunkach sterylnych, zaleca się przeprowadzanie wszystkich etapów w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

1. Materiały
Zestaw do dysocjacji tkanki nerwowej (P) (składniki: roztwór 1, 2, 3 i 4, bufor do przechowywania)
Filtry do wstępnej separacji (opcjonalnie)
Kuleczki do usuwania mieliny (Myelin Removal Beads)
Dysocjator gentleMACS
Probówki C
Rotator do probówek MACSmix
HBSS (bez)
HBSS (z)

Przed rozpoczęciem protokołu należy przygotować następujące roztwory:
Hanks’ Buffered Salt Solution bez kationów dwuwartościowych Ca2+ lub Mg2+ (HBSS (bez))
Standardowy Hanks’ Buffered Salt Solution, tzn. z Ca2+ i Mg2+ (HBSS (z))

W zależności od epitopu antygenowego istotnego w późniejszych zastosowaniach, należy użyć Zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej opartego na papainie (P) lub Zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej opartego na trypsynie (T).
Z Zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej należy przygotować następujące roztwory:
Roztwór 2: dodać beta-merkaptoetanol do stężenia 0,067 mM
Roztwór 4: rozpuścić proszek w 0,7 ml buforu do przechowywania (zawartego w zestawie), delikatnie wymieszać (nie wirować w vortexie)
Mieszanina enzymatyczna 1: do probówki C pipetować 1,9 ml roztworu 2 i 50 μl roztworu 1 (oba z zestawu) i inkubować przez 10–15 min w temperaturze 37 °C. Ilość ta jest wystarczająca do dysocjacji 400 mg tkanki mózgowej.

2. Dysocjacja tkanki nerwowej
Zważyć tkankę mózgową w probówce zawierającej 1 ml HBSS (bez).
Przenieść mózg myszy do probówki C zawierającej 1950 μL podgrzanej mieszaniny enzymatycznej 1.
(UWAGA: protokół ten jest opracowany dla masy ≤ 400 mg, jednak objętości roztworów można przeskalować, aby pomieścić do 1600 mg tkanki mózgowej na jedną probówkę C).
Umieścić probówkę C w dysocjatorze gentleMACS i uruchomić program „m_brain_01”.
Inkubować z rotacją (4 obr./min przy użyciu rotatora do probówek MACSmix) przez 15 min w temperaturze 37 °C.
Umieścić probówkę C w dysocjatorze gentleMACS i uruchomić program „m_brain_02”.
Podczas etapu dysocjacji przygotować 30 μl mieszaniny enzymatycznej 2 na każde 400 mg tkanki, delikatnie mieszając 20 μl roztworu 3 i 10 μl roztworu 4.
Dodać mieszaninę enzymatyczną 2 do probówki C przez zakrętkę z septem i delikatnie wymieszać bez użycia vortexa.
Inkubować probówkę C z rotacją przez 10 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
Umieścić probówkę C w dysocjatorze gentleMACS i uruchomić program „m_brain_03”.
Inkubować probówkę C z rotacją przez 10 min w temperaturze 37 °C w inkubatorze.
Krótko odwirować, aby zebrać próbkę na dnie probówki.

3. Filtracja
Wybrać filtr o rozmiarze umożliwiającym przejście interesujących nas komórek. Na przykład komórki Purkinjego są zbyt duże, aby przejść przez filtr 30 μm, natomiast komórki Prominin-1+ przejdą.
Za pomocą odpowiedniej pipety 1000 μl pobrać komórki z probówki C przez zakrętkę z septem i nanieść je na filtr do wstępnej separacji umieszczony na probówce zbiorczej 15 ml.
(UWAGA: dla większych objętości próbek należy użyć probówki zbiorczej 50 ml).
Przepłukać filtr 10 ml HBSS (z).
Odwirować przefiltrowane komórki z prędkością 300 x g przez 10 min w temperaturze pokojowej (RT).
Resuspender supernatant w wybranym medium lub buforze do późniejszych zastosowań.
W celu usunięcia pozostałości mieliny należy użyć kuleczek do usuwania mieliny (Myelin Removal Beads).

4. Reprezentatywny wynik: patrz Ryciny 1–3
Rycina 1. Dysocjacja mózgu przy użyciu dysocjatora gentleMACS pozwoliła na uzyskanie 97% żywych komórek, co wykazuje analiza cytometryczna.
Rycina 2. Zdjęcie z mikroskopu świetlnego przedstawiające formowanie się neurosfer po magnetycznym sortowaniu komórek z użyciem Anti-Prominin-1 MicroBeads po 7 dniach hodowli w MACS® NeuroMedium uzupełnionym o MACS Supplement B27 PLUS. Komórki przygotowano z mózgu myszy CD1 (P3) przy użyciu Zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej (P).
Rycina 3. Pozostałości mieliny w suspensjach jednokomórkowych znacznie utrudniają izolację komórek; usunięcie pozostałości mieliny za pomocą Myelin Removal Beads zwiększa wydajność separacji komórek. W przypadku separacji MACS z użyciem Anti-Prominin-1 MicroBeads, mózg myszy P22 zdysocjowano przy użyciu Zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej (P). Komórki z suspensji jednokomórkowej wykorzystano bezpośrednio do separacji lub poddano procesowi usuwania mieliny za pomocą Myelin Removal Beads. Porównanie separacji z próbek bez i z usuwaniem mieliny wykazuje, że czystość jest wyższa w próbkach poddanych wcześniejszemu usuwaniu mieliny.&gt;&lt;a href=&quot;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&quot;&gt;http://www.mbpinc.com/html/products/art/display.html&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji tkanki nerwowej (T)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr kat. 130-093-231</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_712_656_Neural_Tissue_Dissociation_Kits.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Roztwór jodku propidyny</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>Nr kat. 130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&quot;&gt;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki nerwowej myszy

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

W obrębie układu nerwowego opisano setki typów komórek neuronalnych i glejowych. Każdy konkretny typ komórek w mózgu lub rdzeniu kręgowym posiada zestaw cząsteczek powierzchniowych, czyli determinantów molekularnych, dzięki którym można go zidentyfikować i scharakteryzować. Obecnie skuteczne technologie identyfikacji i separacji komórek wymagają generowania preparatów jednokomórkowych przy jednoczesnym ograniczeniu śmierci komórek oraz niszczenia charakterystycznych białek powierzchniowych. Urządzenie gentleMACS Dissociator, stosowane w połączeniu z zestawami do dysocjacji opartymi na trypsynie lub papainie, pozwala na efektywną i łagodną dysocjację tkanki mózgowej, zachowując jednocześnie epitopy antygenowe i ograniczając utratę komórek. Standaryzowane przygotowanie zawiesin jednokomórkowych uzyskuje się przy użyciu probówek C Tubes oraz zoptymalizowanych, wstępnie zaprogramowanych programów gentleMACS. Po przygotowaniu zawiesiny jednokomórkowe można poddać działaniu koniugatów monoklonalnych, takich jak Anti-Prominin-1 MicroBeads, które identyfikują progenitory neuronalne, lub poddać dalszemu oczyszczaniu przy użyciu Myelin Removal Beads.

Dysocjacja komórek z konkretnych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać wysoką liczbę żywych komórek zdolnych do hodowli. Urządzenie Miltenyi gentleMACS Dissociator optymalizuje to zadanie dzięki prostemu, praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono zastosowanie tego urządzenia w odniesieniu do tkanki nerwowej.

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki nerwowej myszy

W obrębie układu nerwowego opisano setki typów komórek neuronalnych i glejowych. Każdy specyficzny typ komórki w mózgu lub rdzeniu kręgowym posiada...

W obrębie układu nerwowego opisano setki typów komórek glejowych neuronalnych. Każdy konkretny typ komórek w mózgu lub rdzeniu kręgowym posiada zestaw cząsteczek powierzchniowych lub determinantów molekularnych, dzięki którym można go zidentyfikować i scharakteryzować.Obecnie skuteczne technologie identyfikacji i separacji komórek wymagają przygotowania zawiesin pojedynczych komórek przy jednoczesnym ograniczeniu ich obumierania oraz niszczenia charakterystycznych białek powierzchniowych. Urządzenie GentleMACS Associator stosowane w połączeniu z zestawami do dysocjacji opartymi na trypsynie lub pepsynie pozwala na efektywne i łagodne dysocjowanie tkanki mózgowej, zachowując epitopy antygenowe i ograniczając utratę komórek. Uzyskane zawiesiny pojedynczych komórek można następnie traktować koniugatami monoklonalnymi, takimi jak mikrokule anty-prominent one, które identyfikują neuroprogenitory, lub poddać dalszemu oczyszczaniu przy użyciu kulek do usuwania mieliny.Witajcie, nazywam się Sandra PeNAT. Jestem kierownikiem projektów ds. produktów neuronaukowych w firmie Mil Biotech w Baggage Gabert w Niemczech. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z tkanki mózgowej myszy przy użyciu urządzenia Genix DisAssociator.Genix Dis Associator to urządzenie, które pozwala na dysocjację wielu typów tkanek w zamkniętym, sterylnym środowisku, co eliminuje potrzebę żmudnej, ręcznej dysocjacji mechanicznej. Zacznijmy zatem. W zależności od epitopu antygenowego istotnego w późniejszych zastosowaniach, należy użyć zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej opartego na papainie lub zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej opartego na trypsynie.W dzisiejszym doświadczeniu preferujemy zestaw do dysocjacji tkanki nerwowej P, ponieważ chcemy wyizolować komórki prominent positive przy użyciu mikrokulek anty-prominent one. Prominent one nie jest wrażliwy ani na pepanę, ani na trypsynę, w takim przypadku zestaw do dysocjacji tkanki nerwowej P jest lepszym wyborem. Przed rozpoczęciem protokołu należy przygotować odczynniki i roztwory dla tego zestawu.Przygotuj zapas zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) bez jonów wapnia i magnezu oraz HBSS z jonami wapnia i magnezu oraz beta-merkaptoetanol. Rozpocznij od przygotowania roztworu dwa, roztworu cztery, a następnie mieszaniny enzymatycznej jeden. Najpierw dodaj beta-merkaptoetanol do roztworu dwa do stężenia końcowego 0,067 mM.Roztwór jest teraz stabilny przez maksymalnie jeden miesiąc przy przechowywaniu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie rozpuść liofilizowany proszek z fiolki oznaczonej jako roztwór cztery, używając 0,7 mililitra buforu do przechowywania; wymieszaj delikatnie, nie używając wortexa.Teraz przygotuj mieszaninę enzymatyczną nr 1, pipetując 1900 µL roztworu dwa oraz 50 µL roztworu jeden do probówki C. Taka ilość roztworu wystarczy do dysocjacji 400 mg tkanki, zatem w przypadku dysocjacji większej ilości materiału należy przygotować dodatkową porcję mieszaniny enzymatycznej nr 1. W probówce C można przetworzyć maksymalnie 1600 mg tkanki mózgu.Mieszaninę enzymatyczną nr 1 w probówce C inkubuje się następnie w temperaturze 37 °C przez 10 do 15 minut. Aby rozpocząć dysocjację, należy pipetować 1 mL HBSS bez jonów wapnia i magnezu do probówki. Umieść probówkę na wadze, dodaj tkankę mózgową i zapisz jej masę.Ten mózg myszy w stadium P4 waży około 0,2 g. Mózg dorosłego osobnika ważyłby około 0,4 g; w przypadku wszystkich próbek tkanek o masie mniejszej niż 400 mg, objętości roztworów, których będziemy dziś używać, są odpowiednie.Jeśli tkanka waży więcej niż 400 mg, należy proporcjonalnie zwiększyć objętość wszystkich odczynników; w jednej probówce C można przetworzyć do 1600 mg tkanki. Przenieś mózg myszy do przygotowanej probówki C zawierającej 1 950 µL podgrzanego enzymu. Wymieszaj i szczelnie zamknij nakrętkę.Następnie umieść probówkę C w urządzeniu GenMax Associator zakrętką do dołu i upewnij się, że tkanka znajduje się w obszarze stojana. Wybierz program MCO brain O one i uruchom go. Jest to pierwszy z trzech programów, które zostaną wykonane podczas dysocjacji, gdy program dobiegnie końca.Wyjmij probówkę C i inkubuj próbkę przez 15 minut w temperaturze 37 °C przy powolnym, ciągłym obracaniu. Przy użyciu rotatora do probówek max mix tryb pracy urządzenia odpowiada prędkości 4 RPM. Po pierwszej inkubacji umieść probówkę z powrotem na urządzeniu do dysocjacji dnem do góry i uruchom program M brain O2. Podczas kolejnej inkubacji przygotuj 30 µl mieszaniny enzymatycznej dwa na każde 400 mg tkanki, dodając 20 µl roztworu trzy oraz 10 µl roztworu cztery.Po zakończeniu drugiego cyklu mieszania, dodaj 30 µL mieszaniny enzymatycznej 2 do probówki C bezpośrednio przez otwór uszczelniony septem na środku nakrętki. Aby zachować sterylność, delikatnie odwróć probówkę C w celu wymieszania zawartości; nie używaj wortexa. Następnie umieść probówkę C ponownie na rotatorze do probówek max mix i inkubuj próbkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C przy mieszaniu z prędkością 4 RPM.Następnie probówkę CTU umieszcza się ponownie w łagodnym dysocjatorze Max Dis po raz trzeci i ostatni, a następnie uruchamia program M brain oh three. Po zakończeniu trzeciego programu probówki z treścią (C tubes) należy umieścić w rotatorze i inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 °C. Następnie próbkę krótko wirujemy, aby osadzić komórki na dnie probówki.Jesteśmy teraz gotowi do filtrowania komórek. Wybierz sitko komórkowe odpowiednie dla wielkości badanego typu komórek. Jeśli komórki, które chcesz zebrać, mają średnicę większą niż 30 micrometers, jak na przykład komórki kinji, rozmiar porów musi być wystarczający, aby ciała komórek o takiej średnicy mogły przez nie przejść.W przypadku komórek o wyraźnej fluorescencji pojedynczej pozytywnej odpowiedni będzie filtr o rozmiarze 30 µm. Należy przenieść rozdzieloną tkankę z probówki C, używając końcówek do pipety o pojemności 1000 µL, które mieszczą się w otworze zabezpieczonym septem w nakrętce probówki C. Następnie należy nanieść zawiesinę komórkową na filtr separacyjny umieszczony na probówce zbiorczej o pojemności 15 mL.W przypadku większych próbek może być wymagana probówka o pojemności 50 mililitrów. Należy pozwolić zawiesinie komórkowej przepłynąć przez filtr. Następnie należy przemyć filtr, dodając 10 mililitrów roztworu HBSS z jonami wapnia i magnezu.W przypadku pracy z ilością tkanki przekraczającą 400 mg, do płukania filtra należy użyć do 30 ml HBSS z jonami wapnia i magnezu. Następnie należy sfragmentować komórki w probówce zbiorczej poprzez wirowanie przy 300 Gs przez 10 minut w temperaturze pokojowej, całkowicie odessać supernatant i resuspender osad komórkowy w wybranym buforze lub medium. Na tym etapie można zdecydować o usunięciu pozostałości mieliny, ponieważ mogą one utrudniać izolację komórek oraz barwienie przeciwciałami.Aby usunąć resztki mieliny, sugerujemy zastosowanie kulek do usuwania mieliny. W przeciwnym razie komórki są gotowe do dalszego zastosowania. Ten wykres kropkowy oparty na barwieniu jodkiem propidyniowym wskazuje, że 97% komórek obecnych w zawiesinie pojedynczych komórek z mózgu myszy, takiej jak zawiesina przygotowana w tym filmie, jest żywych.Komórki te można dalej oczyszczać, wykorzystując przeciwciała przeciwko prominecie unieruchomione na mikrokulkach, aby uzyskać progenitorów neuronalnych, które hodowane w pożywce Max Neuro z dodatkiem B 27 plus mogą tworzyć neurosfery przedstawione na tych wykresach kropkowych. Widoczna jest korzyść z traktowania zawiesin kulkami do usuwania mieliny. Znacznie wyższy odsetek progenitorów neuronalnych wykazujących ekspresję prominenty 1 uzyskuje się podczas separacji Max po usunięciu mieliny z zawiesiny pojedynczych komórek.Właśnie przedstawiłem sposób przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek z tkanki mózgowej myszy przy użyciu genix dissociation oraz zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wszystkie roztwory zostały przygotowane odpowiednio do wybranego zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej, T lub P. Proszę zapoznać się z notą aplikacyjną lub kartą charakterystyki NDK. Stosując tę metodę, zarówno embrionalne, jak i dorosłe przekroje tkankowe lub cały mózg mogą być przetwarzane w warunkach sterylnych w sposób zstandaryzowany i oszczędzający czas.Dziękujemy za obejrzenie materiału i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

generation-of-single-cell-suspensions-from-mouse-neural-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wytwarzanie zawiesin jednokomórkowych z tkanki nerwowej myszy

W tym filmie opisano metodę izolacji neuroprekursorów z rozwijającej się kory zarodków myszy. Przedstawiono procedurę usuwania zarodków z macicy, wycinania tkanki korowej oraz trawienia wyizolowanej kory mózgu.

Hodowla prekursorów neuronalnych komórek macierzystych myszy

Opisano prostą i niezawodną metodę izolacji oraz hodowli neuralnych komórek macierzystych z odrzuconej ludzkiej tkanki kory płodowej. Hodowle pochodzące z rozpoznanych neurologicznych schorzeń człowieka mogą być wykorzystywane do charakteryzacji patologicznych procesów komórkowych i molekularnych, a także stanowić platformę do oceny skuteczności farmakologicznej.

Generowanie komórek macierzystych neuronów z odrzuconej ludzkiej tkanki korowej płodu

Ten film demonstruje metodę izolowania komórek macierzystych z móżdżku myszy po urodzeniu i różnicowania ich w komórki nerwowe. Komórki macierzyste z izolowanej zawiesiny komórkowej są oczyszczane za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałami i są hodowane w celu utworzenia neurosfer. Neurosfery są następnie utrzymywane w pożywce różnicującej w celu wytworzenia komórek nerwowych.

Izolacja komórek macierzystych z poporodowego móżdżku myszy i różnicowanie w komórki nerwowe

Ten film demonstruje protokół uzyskiwania wysoce żywotnej zawiesiny jednokomórkowej z hipokampa mózgu myszy przy użyciu kombinacji automatycznej dysocjacji mechanicznej i mieszaniny enzymów wspomagających trawienie enzymatyczne.

Uzyskiwanie zawiesiny jednokomórkowej z tkanki hipokampa myszy

Film demonstruje przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny komórek odpornościowych z mysiej tkanki mózgowej. Obejmuje trawienie enzymatyczne w celu uwolnienia komórek z tkanki mózgowej, a następnie wirowanie w gradiencie gęstości w celu wyizolowania komórek odpornościowych na podstawie ich gęstości w celu uzyskania zawiesiny pojedynczej komórki.

Przygotowanie jednokomórkowej zawiesiny komórek odpornościowych z mysiej tkanki mózgowej

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół jednoczesnego generowania kultur neuronalnych komórek prekursorowych, jako przylegających monowarstw lub neurosfer, ze strefy podkomorowej i zakrętu zębatego poszczególnych dorosłych myszy.

Jedna mysz, dwie kultury: izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych z dwóch stref neurogennych poszczególnych myszy

Ustanowienie systemów hodowli do ekspansji dorosłych nerwowych komórek macierzystych (aNSC) pozwala na badanie i zastosowanie aNSC w terapii. Strefa podmodzelowa (SCZ) została niedawno uznana za nowy region tworzący neuroblasty u dorosłych myszy. W tym miejscu opisano metody izolacji, ekspansji i różnicowania SCZ-aNSC.

Izolacja i hodowla dorosłych nerwowych komórek macierzystych ze strefy podmodzelowej myszy

Tutaj wprowadzamy nowatorską technikę mikrochirurgiczną do izolacji nerwowych komórek macierzystych z wyniosłości zwojowej zarodka myszy E13.

Izolacja i hodowla embrionalnych mysich nerwowych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy system nukleofekcji zaprojektowany w celu zwiększenia efektywności dostarczania genów w rozszerzonych nerwowych komórkach macierzystych (NSC) wyizolowanych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej. Wyniki pokazują, że metoda ta znacznie poprawia perturbację genów w NSC, przewyższając skuteczność tradycyjnych protokołów transfekcji i zwiększając wskaźnik przeżywalności komórek.

Izolacja, ekspansja i nukleofekcja nerwowych komórek macierzystych z dorosłej mysiej strefy podkomorowej

Aby zbadać odpowiedź immunologiczną na zaburzenia mózgu, jednym z powszechnych podejść jest analiza zmian w komórkach odpornościowych. Oto dwa proste i skuteczne protokoły do izolacji komórek odpornościowych z tkanki mózgu mysiego i rdzenia kostnego z czaszki.

Izolowanie komórek odpornościowych z mózgu i czaszki myszy

Naucz się wytwarzać jednokomórkowe zawiesiny z tkanki nerwowej myszy przy użyciu gentleMACS Dissociator. Ta metoda zachowuje witalność komórek i epitopy antygenowe do dalszej analizy.

Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki nerwowej myszy

Przeglądaj więcej filmów