Przygotowanie zawiesin pojedynczych komórek z tkanki nerwowej myszy
7 lipca 2009
Dysocjacja komórek z konkretnych typów tkanek wymaga zastosowania specyficznych parametrów agitacji tkanki, aby uzyskać wysoką liczbę żywych komórek zdolnych do hodowli. Urządzenie Miltenyi gentleMACS Dissociator optymalizuje to zadanie dzięki prostemu, praktycznemu protokołowi. W niniejszej publikacji wyjaśniono zastosowanie tego urządzenia w odniesieniu do tkanki nerwowej.
W obrębie układu nerwowego opisano setki typów komórek glejowych neuronalnych. Każdy konkretny typ komórek w mózgu lub rdzeniu kręgowym posiada zestaw cząsteczek powierzchniowych lub determinantów molekularnych, dzięki którym można go zidentyfikować i scharakteryzować.
Obecnie skuteczne technologie identyfikacji i separacji komórek wymagają przygotowania zawiesin pojedynczych komórek przy jednoczesnym ograniczeniu ich obumierania oraz niszczenia charakterystycznych białek powierzchniowych. Urządzenie GentleMACS Associator stosowane w połączeniu z zestawami do dysocjacji opartymi na trypsynie lub pepsynie pozwala na efektywne i łagodne dysocjowanie tkanki mózgowej, zachowując epitopy antygenowe i ograniczając utratę komórek. Uzyskane zawiesiny pojedynczych komórek można następnie traktować koniugatami monoklonalnymi, takimi jak mikrokule anty-prominent one, które identyfikują neuroprogenitory, lub poddać dalszemu oczyszczaniu przy użyciu kulek do usuwania mieliny.
Witajcie, nazywam się Sandra PeNAT. Jestem kierownikiem projektów ds. produktów neuronaukowych w firmie Mil Biotech w Baggage Gabert w Niemczech. Dzisiaj pokażę Państwu, jak przygotować zawiesinę pojedynczych komórek z tkanki mózgowej myszy przy użyciu urządzenia Genix DisAssociator.
Genix Dis Associator to urządzenie, które pozwala na dysocjację wielu typów tkanek w zamkniętym, sterylnym środowisku, co eliminuje potrzebę żmudnej, ręcznej dysocjacji mechanicznej. Zacznijmy zatem. W zależności od epitopu antygenowego istotnego w późniejszych zastosowaniach, należy użyć zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej opartego na papainie lub zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej opartego na trypsynie.
W dzisiejszym doświadczeniu preferujemy zestaw do dysocjacji tkanki nerwowej P, ponieważ chcemy wyizolować komórki prominent positive przy użyciu mikrokulek anty-prominent one. Prominent one nie jest wrażliwy ani na pepanę, ani na trypsynę, w takim przypadku zestaw do dysocjacji tkanki nerwowej P jest lepszym wyborem. Przed rozpoczęciem protokołu należy przygotować odczynniki i roztwory dla tego zestawu.
Przygotuj zapas zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS) bez jonów wapnia i magnezu oraz HBSS z jonami wapnia i magnezu oraz beta-merkaptoetanol. Rozpocznij od przygotowania roztworu dwa, roztworu cztery, a następnie mieszaniny enzymatycznej jeden. Najpierw dodaj beta-merkaptoetanol do roztworu dwa do stężenia końcowego 0,067 mM.
Roztwór jest teraz stabilny przez maksymalnie jeden miesiąc przy przechowywaniu w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie rozpuść liofilizowany proszek z fiolki oznaczonej jako roztwór cztery, używając 0,7 mililitra buforu do przechowywania; wymieszaj delikatnie, nie używając wortexa.
Teraz przygotuj mieszaninę enzymatyczną nr 1, pipetując 1900 µL roztworu dwa oraz 50 µL roztworu jeden do probówki C. Taka ilość roztworu wystarczy do dysocjacji 400 mg tkanki, zatem w przypadku dysocjacji większej ilości materiału należy przygotować dodatkową porcję mieszaniny enzymatycznej nr 1. W probówce C można przetworzyć maksymalnie 1600 mg tkanki mózgu.
Mieszaninę enzymatyczną nr 1 w probówce C inkubuje się następnie w temperaturze 37 °C przez 10 do 15 minut. Aby rozpocząć dysocjację, należy pipetować 1 mL HBSS bez jonów wapnia i magnezu do probówki. Umieść probówkę na wadze, dodaj tkankę mózgową i zapisz jej masę.
Ten mózg myszy w stadium P4 waży około 0,2 g. Mózg dorosłego osobnika ważyłby około 0,4 g; w przypadku wszystkich próbek tkanek o masie mniejszej niż 400 mg, objętości roztworów, których będziemy dziś używać, są odpowiednie.
Jeśli tkanka waży więcej niż 400 mg, należy proporcjonalnie zwiększyć objętość wszystkich odczynników; w jednej probówce C można przetworzyć do 1600 mg tkanki. Przenieś mózg myszy do przygotowanej probówki C zawierającej 1 950 µL podgrzanego enzymu. Wymieszaj i szczelnie zamknij nakrętkę.
Następnie umieść probówkę C w urządzeniu GenMax Associator zakrętką do dołu i upewnij się, że tkanka znajduje się w obszarze stojana. Wybierz program MCO brain O one i uruchom go. Jest to pierwszy z trzech programów, które zostaną wykonane podczas dysocjacji, gdy program dobiegnie końca.
Wyjmij probówkę C i inkubuj próbkę przez 15 minut w temperaturze 37 °C przy powolnym, ciągłym obracaniu. Przy użyciu rotatora do probówek max mix tryb pracy urządzenia odpowiada prędkości 4 RPM. Po pierwszej inkubacji umieść probówkę z powrotem na urządzeniu do dysocjacji dnem do góry i uruchom program M brain O2. Podczas kolejnej inkubacji przygotuj 30 µl mieszaniny enzymatycznej dwa na każde 400 mg tkanki, dodając 20 µl roztworu trzy oraz 10 µl roztworu cztery.
Po zakończeniu drugiego cyklu mieszania, dodaj 30 µL mieszaniny enzymatycznej 2 do probówki C bezpośrednio przez otwór uszczelniony septem na środku nakrętki. Aby zachować sterylność, delikatnie odwróć probówkę C w celu wymieszania zawartości; nie używaj wortexa. Następnie umieść probówkę C ponownie na rotatorze do probówek max mix i inkubuj próbkę przez 10 minut w temperaturze 37 °C przy mieszaniu z prędkością 4 RPM.
Następnie probówkę CTU umieszcza się ponownie w łagodnym dysocjatorze Max Dis po raz trzeci i ostatni, a następnie uruchamia program M brain oh three. Po zakończeniu trzeciego programu probówki z treścią (C tubes) należy umieścić w rotatorze i inkubować przez kolejne 10 minut w temperaturze 37 °C. Następnie próbkę krótko wirujemy, aby osadzić komórki na dnie probówki.
Jesteśmy teraz gotowi do filtrowania komórek. Wybierz sitko komórkowe odpowiednie dla wielkości badanego typu komórek. Jeśli komórki, które chcesz zebrać, mają średnicę większą niż 30 micrometers, jak na przykład komórki kinji, rozmiar porów musi być wystarczający, aby ciała komórek o takiej średnicy mogły przez nie przejść.
W przypadku komórek o wyraźnej fluorescencji pojedynczej pozytywnej odpowiedni będzie filtr o rozmiarze 30 µm. Należy przenieść rozdzieloną tkankę z probówki C, używając końcówek do pipety o pojemności 1000 µL, które mieszczą się w otworze zabezpieczonym septem w nakrętce probówki C. Następnie należy nanieść zawiesinę komórkową na filtr separacyjny umieszczony na probówce zbiorczej o pojemności 15 mL.
W przypadku większych próbek może być wymagana probówka o pojemności 50 mililitrów. Należy pozwolić zawiesinie komórkowej przepłynąć przez filtr. Następnie należy przemyć filtr, dodając 10 mililitrów roztworu HBSS z jonami wapnia i magnezu.
W przypadku pracy z ilością tkanki przekraczającą 400 mg, do płukania filtra należy użyć do 30 ml HBSS z jonami wapnia i magnezu. Następnie należy sfragmentować komórki w probówce zbiorczej poprzez wirowanie przy 300 Gs przez 10 minut w temperaturze pokojowej, całkowicie odessać supernatant i resuspender osad komórkowy w wybranym buforze lub medium. Na tym etapie można zdecydować o usunięciu pozostałości mieliny, ponieważ mogą one utrudniać izolację komórek oraz barwienie przeciwciałami.
Aby usunąć resztki mieliny, sugerujemy zastosowanie kulek do usuwania mieliny. W przeciwnym razie komórki są gotowe do dalszego zastosowania. Ten wykres kropkowy oparty na barwieniu jodkiem propidyniowym wskazuje, że 97% komórek obecnych w zawiesinie pojedynczych komórek z mózgu myszy, takiej jak zawiesina przygotowana w tym filmie, jest żywych.
Komórki te można dalej oczyszczać, wykorzystując przeciwciała przeciwko prominecie unieruchomione na mikrokulkach, aby uzyskać progenitorów neuronalnych, które hodowane w pożywce Max Neuro z dodatkiem B 27 plus mogą tworzyć neurosfery przedstawione na tych wykresach kropkowych. Widoczna jest korzyść z traktowania zawiesin kulkami do usuwania mieliny. Znacznie wyższy odsetek progenitorów neuronalnych wykazujących ekspresję prominenty 1 uzyskuje się podczas separacji Max po usunięciu mieliny z zawiesiny pojedynczych komórek.
Właśnie przedstawiłem sposób przygotowania zawiesiny pojedynczych komórek z tkanki mózgowej myszy przy użyciu genix dissociation oraz zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wszystkie roztwory zostały przygotowane odpowiednio do wybranego zestawu do dysocjacji tkanki nerwowej, T lub P. Proszę zapoznać się z notą aplikacyjną lub kartą charakterystyki NDK. Stosując tę metodę, zarówno embrionalne, jak i dorosłe przekroje tkankowe lub cały mózg mogą być przetwarzane w warunkach sterylnych w sposób zstandaryzowany i oszczędzający czas.
Dziękujemy za obejrzenie materiału i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.
Przegląd
Niniejszy artykuł omawia zastosowanie dysocjatora Miltenyi gentleMACS do pozyskiwania żywotnych i zdolnych do hodowli komórek z tkanki nerwowej. Protokół podkreśla znaczenie specyficznych parametrów dysocjacji w celu zachowania żywotności komórek oraz białek powierzchniowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Techniki dysocjacji tkanek
Wstęp
- Typy komórek neuronalnych i glejowych w układzie nerwowym charakteryzują się unikalnymi cząsteczkami powierzchniowymi.
- Przygotowanie pojedynczych komórek jest niezbędne do dokładnej identyfikacji i separacji komórek.
- Zachowanie żywotności komórek oraz białek powierzchniowych podczas dysocjacji jest kluczowe.
- Urządzenie gentleMACS Dissociator zapewnia zamknięte, sterylne środowisko do dysocjacji tkanek.
Cel badania
- Przedstawienie skutecznego protokołu dysocjacji tkanki mózgu myszy.
- Wskazanie zalet zastosowania urządzenia gentleMACS Dissociator w celu zachowania epitopów antygenowych.
- Zapewnienie szczegółowego przewodnika krok po kroku dla badaczy w dziedzinie neuronauki.
Zastosowane metody
- Przygotowanie mieszanin enzymatycznych do dysocjacji tkanek.
- Wykorzystanie urządzenia gentleMACS Dissociator do dysocjacji mechanicznej.
- Inkubacja próbek tkanek w kontrolowanych warunkach.
- Filtracja zdysocjowanych komórek w celu izolacji specyficznych typów komórek.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie dysocjuje tkankę mózgu myszy, zachowując żywotność komórek.
- Specyficzne zestawy enzymatyczne zwiększają stopień zachowania białek powierzchniowych.
- Suspensje pojedynczych komórek mogą być efektywnie filtrowane w celu dalszej analizy.
- Urządzenie gentleMACS Dissociator upraszcza proces dysocjacji w porównaniu z metodami manualnymi.
Wnioski
- Dysocjator gentleMACS jest cennym narzędziem w badaniach z zakresu neuronauki.
- Zoptymalizowane protokoły dysocjacji mogą prowadzić do lepszego odzyskania i charakterystyki komórek.
- Przyszłe zastosowania mogą zostać rozszerzone na inne rodzaje tkanek i obszary badawcze.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Znormalizowane generowanie zawiesiny pojedynczych komórek z tkanki nerwowej umożliwia wiarygodną analizę markerów powierzchniowych komórek oraz późniejsze procesy oczyszczania. Podejście to wspomaga walidację celów poprzez zachowanie epitopów antygenowych przy jednoczesnym minimalizowaniu utraty komórek, co bezpośrednio wpływa na powtarzalność analiz w procesach odkrywania leków. Metoda ta zapewnia skalowalne rozwiązanie w systemie zamkniętym do przygotowywania istotnych dla danej choroby populacji komórek nerwowych w celu badania celów terapeutycznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutyków
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez zachowanie cząsteczek powierzchniowych komórek, które są kluczowe dla identyfikacji celu.
- Wartość operacyjna: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną dzięki utrzymaniu charakterystycznych białek powierzchniowych podczas dysocjacji.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję portfolio poprzez generowanie żywotnych zawiesin pojedynczych komórek odpowiednich do testów walidacji funkcjonalnej.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie walidowanych systemów biologicznych do dalszych zastosowań, takich jak znakowanie koniugatami monoklonalnymi oraz separacja na koralikach.
- Wartość operacyjna: Zapewnienie standaryzacji analizy dzięki predefiniowanym programom gentleMACS oraz ustandaryzowanemu przygotowaniu probówek C Tube.
- Wartość skalowalności: Umożliwienie niezawodnej oceny związków poprzez uzyskanie spójnej zawiesiny pojedynczych komórek dla ilości tkanek do 1600 mg.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość translacyjna: Zachowuje istotność chorobową poprzez generowanie zawiesin z tkanki nerwowej myszy, odpowiednich do izolacji komórek progenitorowych.
- Wartość ciągłości: Wspiera dopasowanie biomarkerów translacyjnych poprzez zachowanie markerów powierzchniowych, takich jak Prominin-1, służących do identyfikacji progenitorów neuronalnych.
- Postęp skorygowany o ryzyko: Ułatwia ciągłość badań przedklinicznych, umożliwiając usuwanie szczątków mieliny w celu zwiększenia wydajności oczyszczania.
Integracja rurociągu i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum odkryć – od wczesnego testowania hipotez dotyczących punktów uchwytu, aż po identyfikację związków wiodących, zapewniając standaryzowane preparaty komórek neuronalnych do dalszych zastosowań.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i wyjaśnianie szlaków poprzez generowanie żywotnych zawiesin, które zachowują molekularne determinanty powierzchni komórkowych.
- Przesiewanie: Zapewnia gotowość do analiz poprzez powtarzalne etapy dysocjacji i filtracji, kompatybilne z separacją za pomocą sitek komórkowych.
- Analityka: Umożliwia pomiary ilościowe dzięki zastosowaniu zawiesin pojedynczych komórek kompatybilnych z cytometrią przepływową w celu analizy żywotności i ekspresji markerów.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z pracami przedklinicznymi poprzez zachowanie markerów powierzchniowych, takich jak Prominin-1, dla wzbogacania populacji progenitorów neuronalnych.
- Ponowne zastosowanie w organizacji: Zapewnia możliwość wielokrotnego wykorzystania procedury przetwarzania tkanki nerwowej w próbkach embrionalnych, postnatalnych i dorosłych w warunkach sterylnych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna dzięki zachowaniu epitopów antygenowych i wysokiej żywotności (wykazano 97%).
- Wartość operacyjna: Standaryzacja i powtarzalność dzięki zaprogramowanym programom dysocjacji oraz doborowi zestawów specyficznych dla odczynników (P lub T).
- Wartość strategiczna: Lepsze decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań dzięki niezawodnej izolacji progenitorów neuronalnych przy użyciu Anti-Prominin-1 MicroBeads po usunięciu mieliny.
- Wpływ na portfolio: Priorytetyzacja dostosowana do ryzyka dzięki skalowalnemu przetwarzaniu przekrojów tkanki nerwowej lub całego mózgu w zamkniętych, sterylnych środowiskach.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z tkanką nerwową oraz w doborze zestawów do dysocjacji w zależności od wrażliwości docelowego epitopu.
- Wymagany jest dysocjator gentleMACS, probówki C Tubes oraz odpowiednie zestawy do dysocjacji tkanki nerwowej (oparte na papainie lub trypsynie).
- Wymagana jest standaryzacja przygotowania roztworów (warianty HBSS, mieszanki enzymatyczne) oraz protokołów inkubacji pomiędzy zespołami.
- Wymaga rozważenia adaptacji w przypadku ilości tkanki przekraczających 400 mg, co wiąże się ze skalowaniem odczynników do limitów wynoszących 1600 mg.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak konieczność stosowania kulek do usuwania mieliny w celu zwiększenia wydajności oczyszczania populacji docelowych.
